本發(fā)明的方面根據(jù)NIH合同號HHSN272200900008C在美國政府支持下完成，美國政府可以具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：對于用短鏈聚乙二醇(PEG，通常小于5000個單元)或某些Pluronic聚合物充分包被的納米顆粒，最近已經(jīng)報道了納米顆粒通過人黏液的快速運(yùn)輸[CuY,SaltzmanWM.MolPharm.2009;6(1):173-181;HanesJ,等人Nanomedicine.2011;6(2):365-375]。認(rèn)為該方案（被作者稱作黏膜穿入）依賴于下降的黏膜附著(而不是增加黏膜附著)，從而允許納米顆粒通過黏液的快速穿入。Toll-樣受體4(TLR4)調(diào)節(jié)劑是在藥物組合物中使用的免疫原性化合物，且具體地用作人疫苗中的佐劑。已經(jīng)將TLR-4激動劑配制在脂質(zhì)體中用于通過疫苗注射遞送。氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGP)是TLR4調(diào)節(jié)劑，其中的一些是特別有效的和潛在反應(yīng)原性的。在此需要一般的改進(jìn)的脂質(zhì)體組合物，且具體地需要用于施用藥物組合物的TLR4調(diào)節(jié)劑的改進(jìn)的脂質(zhì)體組合物。發(fā)明概述提供了用于黏膜遞送的脂質(zhì)體制劑的方法和組合物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了脂質(zhì)體組合物，其包含形成脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)，且還包含摻入所述脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層中的磷脂-PEG綴合物。另外，所述脂質(zhì)體組合物包含TLR4激動劑(例如AGP)，且適當(dāng)?shù)匕琀EPES緩沖劑。在一個實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體的脂質(zhì)是在有膽固醇存在下的DOPC。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了脂質(zhì)體組合物，其包含形成脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)，且還包含摻入所述脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層中的PEG共聚物/表面活性劑諸如泊洛沙姆。另外，所述脂質(zhì)體組合物包含TLR4激動劑(例如AGP)，且適當(dāng)?shù)匕琀EPES緩沖劑。在一個實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體的脂質(zhì)是在沒有膽固醇存在下的DOPC。在一個合適的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體組合物包含殼聚糖或殼聚糖衍生物。在一個合適的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)體制劑，其包含在沒有甾醇存在下的DOPC脂質(zhì)體、泊洛沙姆（其中所述泊洛沙姆摻入所述DOPC脂質(zhì)體的雙層中）、在HEPES緩沖劑中的AGP和任選的殼聚糖或殼聚糖衍生物。在一個合適的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)體制劑，其包含在有甾醇（適當(dāng)?shù)厥悄懝檀迹┐嬖谙碌腄OPC脂質(zhì)體、磷脂-PEG綴合物（其中所述磷脂-PEG綴合物摻入DOPC-甾醇脂質(zhì)體的雙層中）、在HEPES緩沖劑中的TLR4激動劑(例如AGP)、和任選的殼聚糖或殼聚糖衍生物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)體組合物，其包含磷脂、磷脂-PEG綴合物或泊洛沙姆和氨基烷烴磺酸緩沖劑諸如HEPES、HEPPS/EPPS、MOPS、MOBS和PIPES。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)體組合物，其包含磷脂、磷脂-PEG綴合物或泊洛沙姆和氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGP)，適當(dāng)?shù)厥荂RX-601、CRX602、CRX527、CRX547、CRX526、CRX529或CRX524。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)體組合物，其包含磷脂、磷脂-PEG綴合物或泊洛沙姆、AGP、氨基烷烴磺酸緩沖劑和殼聚糖或殼聚糖衍生物，適當(dāng)?shù)厥菤ぞ厶枪烟侨樗狨?、乙二醇?xì)ぞ厶恰⑷谆鶜ぞ厶腔蚣谆叶細(xì)ぞ厶?。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于舌下遞送的改進(jìn)的脂質(zhì)體組合物的生產(chǎn)方法，所述方法包括下述步驟：將脂質(zhì)諸如二油酰基磷脂酰膽堿“DOPC”)、磷脂-PEG綴合物(或在沒有膽固醇存在下的泊洛沙姆)和AGP溶解在有機(jī)溶劑中，除去所述溶劑以產(chǎn)生磷脂膜，將所述膜加入HEPES緩沖劑或HEPES緩沖劑在鹽水中的溶液中，將所述膜分散在所述溶液中，和將所述溶液接連地穿過聚碳酸酯過濾器擠出以形成單層脂質(zhì)體。可以將所述脂質(zhì)體組合物另外無菌過濾。在一個合適的實(shí)施方案中，當(dāng)用膽固醇形成脂質(zhì)體時，脂質(zhì)體組合物表現(xiàn)出TLR4激動劑(例如AGP)的高摻入。在另一個實(shí)施方案中，當(dāng)在沒有甾醇（諸如膽固醇）存在下形成脂質(zhì)體時，脂質(zhì)體組合物表現(xiàn)出特定AGP（即CRX601）的高摻入，從而提供這樣的脂質(zhì)體組合物（包括含有泊洛沙姆的脂質(zhì)體組合物）的生產(chǎn)和配制的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的脂質(zhì)體在藥物組合物的生產(chǎn)和應(yīng)用中都是有益的。在本文提供的說明書、附圖和權(quán)利要求書中公開了另外的實(shí)施方案。附圖簡述圖1顯示了在有甲基乙二醇?xì)ぞ厶?MGC)存在下佐劑-脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。對于裝載佐劑的未修飾的、PE-PEG2K和PE-PEG5K修飾的脂質(zhì)體(A)和(C)和PluronicL64、F68和F127修飾的脂質(zhì)體(B)和(D)，在遞增MGC濃度下的大小/PDI和ζ-電勢值。對于(A)和(B)，將大小繪圖為條柱，且將PDI值繪圖為點(diǎn)圖。將數(shù)據(jù)表示為平均值±SD(n=3)。在μm大小范圍內(nèi)的顆粒傾向于隨時間沉淀。圖2顯示了在有甲基乙二醇?xì)ぞ厶?MGC)存在下裝載佐劑的磷脂-PEG脂質(zhì)體的表征。對于裝載佐劑的1%(上行)和25%(下行)PE-PEG2K和PE-PEG5K修飾的脂質(zhì)體，在遞增MGC濃度下的大小/PDI和ζ-電勢值。將大小繪圖為條柱，且將PDI值繪圖為點(diǎn)圖。將數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，對于1mol%修飾而言n=2(上行)，且對于25mol%修飾而言n=1(下行)。在μm大小范圍內(nèi)的顆粒傾向于隨時間沉淀。圖3顯示了在有甲基乙二醇?xì)ぞ厶?MGC)存在下裝載佐劑的Pluronic脂質(zhì)體的表征。對于裝載佐劑的15%(上行)和25%(下行)PluronicL64、F68和F127修飾的脂質(zhì)體，在遞增MGC濃度下的大小/PDI和ζ-電勢值。將大小繪圖為條柱，且將PDI值繪圖為點(diǎn)圖。將數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，對于1mol%修飾而言n=2(上行)，且對于25mol%修飾而言n=1(下行)。在μm大小范圍內(nèi)的顆粒傾向于隨時間沉淀。圖4顯示了來自磷脂-PEG修飾的脂質(zhì)體研究的第二次后血清IgG滴度(頂)、第三次后血清IgG滴度(中間)和第三次后HI滴度和氣管/陰道洗液IgA滴度(底)。在5μgCRX-601/動物/疫苗接種的劑量評價了具有1、5和25摩爾%MPEG-2000-DSPE或MPEG-5000-DPPE替換的脂質(zhì)體。在IM對照中的CRX-601劑量是1μg/動物/疫苗接種。圖5顯示了來自磷脂-PEG修飾的脂質(zhì)體研究的第三次后HI滴度(A)和氣管/陰道洗液IgA滴度(B)。圖6.來自泊洛沙姆407修飾的脂質(zhì)體研究的第二次后血清IgG滴度(頂)、第三次后血清IgG滴度(中間)和第三次后氣管/陰道洗液IgA滴度(底)。在1或5μgCRX-601/動物/疫苗接種的劑量評價了具有5、10和15摩爾%泊洛沙姆407替換的脂質(zhì)體。圖7.來自泊洛沙姆407、188和184修飾的脂質(zhì)體研究的第二次后血清IgG滴度(頂)、第三次后血清IgG滴度(中間)和第三次后氣管/陰道洗液IgA滴度(底)。在5μgCRX-601/動物/疫苗接種的劑量評價了具有15和25摩爾%泊洛沙姆407、188或184替換的脂質(zhì)體。圖8顯示了來自泊洛沙姆407、188和184修飾的脂質(zhì)體研究的第三次后HI滴度(A)和氣管/陰道洗液IgA滴度(B)。在圖中，圖標(biāo)記代表泊洛沙姆407(F127)、泊洛沙姆188(F68)和泊洛沙姆184(F64)。圖9.來自泊洛沙姆407(在圖例中指示為F127)修飾的脂質(zhì)體+甲基乙二醇?xì)ぞ厶茄芯康牡诙魏笱錓gG滴度(頂)、第三次后血清IgG滴度(中間)和第三次后氣管/陰道洗液IgA滴度(底)。在5μgCRX-601/動物/疫苗接種的劑量評價了含有與甲基乙二醇?xì)ぞ厶墙M合的5、15或15摩爾%泊洛沙姆407添加的脂質(zhì)體。在IM對照中的CRX-601劑量是1.5μg/動物/疫苗接種。圖10.來自磷脂-PEG修飾的脂質(zhì)體+甲基乙二醇?xì)ぞ厶腔驓ぞ厶枪烟侨樗狨パ芯康牡诙魏笱錓gG滴度(A)、第三次后血清IgG滴度(B)和第三次后HI滴度(C)和氣管/陰道洗液IgA滴度(D)。在5μgCRX-601/動物/疫苗接種的劑量評價了含有與甲基乙二醇?xì)ぞ厶腔驓ぞ厶枪烟侨樗狨ソM合的5摩爾%MPEG-2000-DSPE或MPEG-5000-DPPE替換的脂質(zhì)體。在IM對照中的CRX-601劑量是1.5μg/動物/疫苗接種。圖11.來自泊洛沙姆407(在圖例中指示為F127)修飾的脂質(zhì)體+甲基乙二醇?xì)ぞ厶茄芯康牡诙魏笱錓gG滴度(頂)、第三次后血清IgG滴度(中間)和第三次后氣管/陰道洗液IgA滴度(底)。在5μgCRX-601/動物/疫苗接種的劑量評價了含有與甲基乙二醇?xì)ぞ厶墙M合的5、15或15摩爾%泊洛沙姆407添加的脂質(zhì)體。在IM對照中的CRX-601劑量是1.5μg/動物/疫苗接種。圖12.來自泊洛沙姆407(在圖例中指示為F127)修飾的脂質(zhì)體+甲基乙二醇?xì)ぞ厶茄芯康牡诙魏笱錓gG滴度(A)、第三次后血清IgG滴度(B)和第三次后HI滴度(C)氣管/陰道洗液IgA滴度(D)。在5μgCRX-601/動物/疫苗接種的劑量評價了含有與甲基乙二醇?xì)ぞ厶墙M合的5、15或15摩爾%泊洛沙姆407添加的脂質(zhì)體。在IM對照中的CRX-601劑量是1.5μg/動物/疫苗接種。發(fā)明詳述脂質(zhì)體術(shù)語“脂質(zhì)體”通常表示包封水性內(nèi)部的單層或多層(特別是2、3、4、5、6、7、8、9或10層，取決于形成的脂質(zhì)膜的數(shù)目)的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體和脂質(zhì)體制劑是本領(lǐng)域眾所周知的。能夠形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)包括具有脂肪或脂肪樣性質(zhì)的所有物質(zhì)?？梢詷?gòu)成脂質(zhì)體中的脂質(zhì)的脂質(zhì)可以選自甘油酯、甘油磷脂、甘油膦脂、甘油膦酰酯、硫脂、鞘脂、磷脂、isoprenolides、類固醇、硬脂、甾醇、archeolipids、合成陽離子脂質(zhì)和含碳水化合物的脂質(zhì)。在本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含磷脂。合適的磷脂包括(但不限于)：作為磷脂酰膽堿合成中的中間體的磷酸膽堿(PC)；天然磷脂衍生物：蛋磷酸膽堿、蛋磷酸膽堿、大豆磷酸膽堿、氫化大豆磷酸膽堿、作為天然磷脂的鞘磷脂；和合成磷脂衍生物：磷酸膽堿(二癸酰基-L-α-磷脂酰膽堿[DDPC]、二月桂?；字Ｄ憠A[DLPC]、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A[DMPC]、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿[DPPC]、二硬脂?；字Ｄ憠A[DSPC]、二油?；字Ｄ憠A[DOPC]、1-棕櫚?；?、2-油?；字Ｄ憠A[POPC]、二反油?；字Ｄ憠A[DEPC])、磷酸甘油(1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1-棕櫚酰基-2-油?；?sn-甘油-3-磷酸甘油[POPG])、磷脂酸(1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕櫚?；字醄DPPA]、二硬脂酰基-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸絲氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂(mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化的磷脂、末端活化的磷脂)、1,2-二油?；?3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP)和鞘磷脂(SPNG)。在一個實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含1-棕櫚酰基-2-油?；?甘油-3-磷酸乙醇胺。在一個實(shí)施方案中，使用高度純化的磷脂酰膽堿，并且其可以選自磷脂酰膽堿(來自蛋)、氫化磷脂酰膽堿(來自蛋)、磷脂酰膽堿(來自大豆)、氫化磷脂酰膽堿(來自大豆)。在另一個實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含磷脂酰乙醇胺[POPE]或其衍生物。取決于磷脂組成和用于其制備的方法，脂質(zhì)體大小可以從30nm到數(shù)個5μm變化。在本發(fā)明的特別的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體大小將在30nm至500nm的范圍中，并且在進(jìn)一步實(shí)施方案中，50nm至200nm，適當(dāng)?shù)匦∮?00nm。動態(tài)激光散射是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的用于測量脂質(zhì)體大小的方法。在合適的脂質(zhì)體制劑中，所述脂質(zhì)包含二油?；字Ｄ憠A[DOPC](2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿)和甾醇（特別是膽固醇）且任選地在沒有甾醇存在下。脂質(zhì)體組合物“脂質(zhì)體組合物”是制備的組合物，其包含脂質(zhì)體和在所述脂質(zhì)體內(nèi)的內(nèi)容物，具體地包括、但不限于：a)形成脂質(zhì)體雙層的脂質(zhì)，b)在所述脂質(zhì)體雙層內(nèi)除了所述脂質(zhì)以外的化合物，c)在所述脂質(zhì)體的水性內(nèi)部中且與其締合的化合物，和d)與所述脂質(zhì)體的外層結(jié)合或締合的化合物。因而，除了所述脂質(zhì)體的脂質(zhì)以外，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物適當(dāng)?shù)乜梢园?、但不限于藥學(xué)活性成分、疫苗抗原和佐劑、賦形劑、載體、黏膜粘著劑、黏膜穿入劑和和緩沖劑。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的化合物會補(bǔ)充所述脂質(zhì)體組合物的穩(wěn)定性或AGP-摻入效率和/或?qū)λ鲋|(zhì)體組合物的穩(wěn)定性或AGP-摻入效率沒有顯著損害?！爸|(zhì)體制劑”是指為了貯存和/或施用給受試者而適當(dāng)?shù)赜闷渌衔锱渲频闹|(zhì)體組合物，諸如本文描述的那些。因而，本發(fā)明的“脂質(zhì)體制劑”包括如本文中定義的脂質(zhì)體組合物，且可以另外包括、但不限于在本發(fā)明的范圍之外的脂質(zhì)體組合物，以及藥學(xué)活性成分、疫苗抗原和佐劑、賦形劑、載體和緩沖劑。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的化合物會補(bǔ)充本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的穩(wěn)定性或AGP-摻入效率和/或?qū)Ρ景l(fā)明的脂質(zhì)體組合物的穩(wěn)定性或AGP-摻入效率沒有顯著損害。氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯化合物.AGP是Toll-樣受體4(TLR4)調(diào)節(jié)劑。Toll-樣受體4識別細(xì)菌LPS(脂多糖)，且當(dāng)被活化時會啟動先天性免疫應(yīng)答。AGP是細(xì)菌LPS的脂質(zhì)A蛋白的單糖模擬物，并且已經(jīng)用所述化合物的“?；湣鄙系拿押王ユI開發(fā)。用于制備這些化合物的方法是已知的，且公開在例如WO2006/016997、美國專利號7,288,640和6,113,918和WO01/90129中，它們在此通過引用以其整體并入。其它AGP和有關(guān)的方法公開在美國專利號7,129,219、美國專利號6,525,028和美國專利號6,911,434中。在本發(fā)明的組合物中采用的、具有在酰基鏈上的醚鍵的AGP是已知的且公開在WO2006/016997中，其特此通過引用整體并入。特別重要的是在WO2006/016997中的段落處根據(jù)式(III)闡述和描述的氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯化合物。在本發(fā)明中采用的氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯化合物具有如下式1所示的結(jié)構(gòu):(式1)其中m是0-6n是0-4；X是O或S，優(yōu)選地O；Y是O或NH；Z是O或H；每個R1、R2、R3獨(dú)立地選自C1-20?；虲1-20烷基；R4是H或Me；R5獨(dú)立地選自-H、-OH、-(Cl-C4)烷氧基、-PO3R8R9、-OPO3R8R9、-SO3R8、-OSO3R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R8和-CONR8R9，其中R8和R9各自獨(dú)立地選自H和(Cl-C4)烷基；且每個R6和R7獨(dú)立地是H或PO3H2。在式1中，正脂肪酰基殘基(也就是說，仲酰氧基或烷氧基殘基，例如，R1O、R2O和R3O)所連接的3’立體中心的構(gòu)型是R或S，優(yōu)選地是R(如通過Cahn-Ingold-Prelog優(yōu)先規(guī)則命名的)。R4和R5所連接的糖苷配基立體中心的構(gòu)型可以是R或S。認(rèn)為所有立體異構(gòu)體、對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體及其混合物落在本發(fā)明范圍內(nèi)。通過變量“n”確定雜原子X和糖苷配基氮原子之間的碳原子的數(shù)目，所述“n”可以是0-4的整數(shù)，優(yōu)選地是0-2的整數(shù)。正脂肪酸R1、R2和R3的鏈長度可以是約6至約16個碳，優(yōu)選約9至約14個碳。所述鏈長度可以相同或不同。一些優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中R1、R2和R3是6或10或12或14的鏈長度。式1包括L/D-絲氨酰基、-蘇氨?；?、-半胱氨?；押王ブ|(zhì)AGP、激動劑和拮抗劑和它們的同系物(n=1-4)、以及各種羧酸生物電子等排體(即，R5是能夠形成鹽的酸性基團(tuán)；所述磷酸酯可以是在葡糖胺單元的4-或6-位上，但是優(yōu)選地是在4-位)。在采用式1的AGP化合物的本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，n是0，R5是CO2H，R6是PO3H2，且R7是H。該優(yōu)選的AGP化合物被闡述為如下式1a的結(jié)構(gòu)：(式1a)其中X是O或S；Y是O或NH；Z是O或H；每個R1、R2、R3獨(dú)立地選自C1-20?；虲1-20烷基；且R4是H或甲基。在式1a中，正脂肪?；鶜埢?也就是說，叔酰氧基或烷氧基殘基，例如，R1O、R2O和R3O)所連接的3’立體中心的構(gòu)型是R或S，優(yōu)選地是R(如通過Cahn-Ingold-Prelog優(yōu)先規(guī)則命名的)。R4和CO2H所連接的糖苷配基立體中心的構(gòu)型可以是R或S。認(rèn)為所有立體異構(gòu)體、對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體及其混合物落在本發(fā)明范圍內(nèi)。式1a包括L/D-絲氨酰基、-蘇氨?；?半胱氨?；鸦蝓ブ|(zhì)AGP、激動劑和拮抗劑。在式1和式1a中，Z是通過雙鍵連接的O或各自通過一個單鍵連接的2個氫原子。也就是說，所述化合物是酯連接的（當(dāng)Z=Y=O時）；酰胺連接的（當(dāng)Z=O和Y=NH時）；和醚連接的（當(dāng)Z=H/H和Y=O時）。特別優(yōu)選的式1的化合物被稱作CRX-601和CRX-527。它們的結(jié)構(gòu)如下所示：。另外，另一個優(yōu)選的實(shí)施方案采用具有所示結(jié)構(gòu)的CRX547。CRX547。再其它的實(shí)施方案包括AGP諸如CRX602或CRX526，其給具有較短仲酰基或烷基鏈的AGP提供增加的穩(wěn)定性。適合用于在本發(fā)明中使用的其它AGP包括CRX524和CRX529。緩沖劑.在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，使用兩性離子緩沖劑緩沖脂質(zhì)體組合物。適當(dāng)?shù)?，所述兩性離子緩沖劑是氨基烷烴磺酸或合適的鹽。氨基烷烴磺酸緩沖劑的例子包括、但不限于HEPES、HEPPS/EPPS、MOPS、MOBS和PIPES。優(yōu)選地，所述緩沖劑是適合用于在人類中使用（諸如用于在市售注射產(chǎn)品中使用）的藥學(xué)上可接受的緩沖劑。最優(yōu)選地，所述緩沖劑是HEPES。所述脂質(zhì)體組合物可以合適地包括AGP。在本發(fā)明的合適實(shí)施方案中，使用選自以下的緩沖劑緩沖所述脂質(zhì)體：i)具有約7的pH的HEPES，ii)具有約5的pH的檸檬酸鹽(例如，檸檬酸鈉)，和iii)具有約5的pH的乙酸鹽(例如，乙酸銨)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在使用具有約7的pH的HEPES緩沖的脂質(zhì)體組合物中包括AGPCRX-601、CRX-527和CRX-547。所述緩沖劑可以與適當(dāng)量的鹽水或其它賦形劑一起使用以達(dá)到期望的等滲性。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，使用0.9%鹽水。HEPES：CAS登記號：7365-45-9C8H18N2O4S4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸HEPES是一種兩性離子緩沖劑，其被設(shè)計(jì)成在約6至約8(例如6.15-8.35)的生理pH范圍中和更具體地在約6.8至約8.2的更有用范圍（如在本發(fā)明中，約7至約8之間，或7-8之間，和優(yōu)選地約7至小于8之間）中緩沖。HEPES通常是白色結(jié)晶性粉末且具有下述結(jié)構(gòu)的分子式C8H18N2O4S:HEPES是眾所周知的和商購可得的(參見，例如，Good等人,Biochemistry1966)。PEG聚乙二醇(PEG)也被稱作聚氧化乙烯(PEO)或聚氧乙烯(POE)，是在從工業(yè)制造到醫(yī)藥中具有多種應(yīng)用的親水聚合物(聚醚)。該聚合物是廉價的，具有良好生物相容性，且已經(jīng)被管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于在人類中內(nèi)部應(yīng)用。具有在1-15kDa范圍內(nèi)的分子量的PEG鏈已經(jīng)被廣泛地用作不同膠體系統(tǒng)中的立體保護(hù)劑。由于它的高水溶性、高遷移率和大排除體積，水合的PEG形成從顆粒表面伸出并包被顆粒表面的聚合物鏈的稠密刷子。這會使顆粒表面的界面自由能最小化并阻礙它與其它顆粒的相互作用，從而給系統(tǒng)提供膠體穩(wěn)定性。PEG包被層的阻止與血液和細(xì)胞中的蛋白和其它生物分子（其已經(jīng)廣泛地用于延長藥物載體在血液中的循環(huán)時間）的相互作用的能力，會減小顆粒調(diào)理作用和使它們更少地被肝和脾中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)識別。特別對于經(jīng)由黏膜途徑的遞送，已經(jīng)顯示PEG（取決于它的鏈長度）具有黏膜粘著(長鏈)和黏膜惰性(短鏈)性能?？梢砸詭追N方式實(shí)現(xiàn)PEG對膠體藥物載體（特別是脂質(zhì)體）的表面修飾：1)使用兩親的PEG-脂質(zhì)綴合物、PEG共聚物諸如泊洛沙姆或其它這樣的PEG-疏水物綴合物，無論是將它們物理吸附到囊泡的表面上，還是通過在脂質(zhì)體制備過程中摻入它們，或2)通過將具有末端官能團(tuán)的PEG鏈共價地移植至預(yù)先形成的脂質(zhì)體的表面上的反應(yīng)基團(tuán)。磷脂-PEG綴合物PEG與磷脂的綴合物已經(jīng)廣泛地用于將PEG摻入到脂質(zhì)體上。磷脂部分通過嵌入雙層的疏水內(nèi)部而充當(dāng)錨，并將PEG鏈移植至脂質(zhì)體水性表面。這些綴合物具有優(yōu)良的生物相容性。幾種不同的綴合物是可得到的，取決于PEG鏈長度和使用的磷脂的類型。Doxil（一種在臨床上批準(zhǔn)的脂質(zhì)體多柔比星制劑）和許多處于晚期臨床測試中的其它脂質(zhì)體制劑(諸如Lipoplatin、SPI-77、Lipoxal等)是基于這種摻入PEG-磷脂的概念。眾多磷脂-PEG綴合物是本領(lǐng)域已知的，且許多磷脂-PEG綴合物是商購可得的，諸如：MPEG-2000-DSPE:N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽，MPEG-5000-DPPE:N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽。其它有關(guān)的磷脂-PEG綴合物包括、但不限于：DPPE-mPEG(1000):1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](銨鹽)；DSPE-mPEG(1000):1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](銨鹽)；DOPE-mPEG(1000):1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](銨鹽)；DPPE-mPEG(2000):1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](銨鹽)DOPE-mPEG(2000):1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](銨鹽)；DSPE-mPEG(5000):1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](銨鹽)；和DOPE-mPEG(5000):1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](銨鹽)。泊洛沙姆泊洛沙姆是由側(cè)接2個親水PEG鏈的中央疏水聚氧丙烯(聚環(huán)氧丙烷)鏈組成的兩親的、非離子的三嵌段共聚物。泊洛沙姆還通過商業(yè)名稱Synperonics、Pluronics和Kolliphor已知。聚合物塊的長度可以定制，因而存在許多在它們的性能上存在差異的不同泊洛沙姆，且可以作為液體、糊或固體存在。因?yàn)樗鼈兊膬捎H結(jié)構(gòu)，這些聚合物具有可以用于乳化水不溶物的表面活性劑性能，在水溶液中形成可以捕獲多種化合物的超分子結(jié)合物(膠束或囊泡)，或可以摻入其它膠體顆粒諸如脂質(zhì)體中。這些合成聚合物的一種特有特征是相對低的毒性和生物相容性。由于該原因，這些聚合物常用在工業(yè)應(yīng)用、化妝品和藥物中。它們還已經(jīng)用在燒傷和創(chuàng)傷的治療、冷凍保護(hù)劑、藥物乳化劑、疫苗佐劑、醫(yī)學(xué)成像、血管疾病的控制中，且已經(jīng)被證實(shí)會使藥物抗性的癌癥對化學(xué)療法敏化。中央疏水塊是泊洛沙姆向脂質(zhì)體雙層和其它膠體藥物遞送顆粒中的摻入所必需的。藥學(xué)上可接受的泊洛沙姆包括、但不限于：泊洛沙姆407(Pluronic?F127)；泊洛沙姆184(Pluronic?L64)和泊洛沙姆188(Pluronic?L68)Pluronic是BASF的注冊商標(biāo)。眾多其它泊洛沙姆是商購可得的。殼聚糖殼聚糖是通過在強(qiáng)堿性溶液下部分地脫乙?；瘞锥≠|(zhì)的乙酰氨基而從幾丁質(zhì)衍生出的天然陽離子多糖。在最近的二十年中，由于它的低毒性、良好生物相容性和優(yōu)良的黏膜粘著性能，殼聚糖已經(jīng)被廣泛地用于生物醫(yī)學(xué)和藥物遞送應(yīng)用中(vanderLubben,I.M.,Verhoef,J.C.,Borchard,G.&Junginger,H.E.Chitosanformucosalvaccination.Adv.DrugDeliv.Rev.52,139-144,2001)。認(rèn)為殼聚糖的黏膜粘著涉及復(fù)雜的機(jī)制，其中陽離子殼聚糖和包被在黏膜表面上的陰離子粘蛋白之間的靜電相互作用是主要因素，盡管還認(rèn)為氫鍵合和疏水作用起重要作用。未衍生化的(“非衍生化的”)殼聚糖具有有限的溶解度(~1mg/mL)，且僅在酸性條件(pH<6.5)下是可溶性的。但是，殼聚糖的衍生物諸如乙二醇?xì)ぞ厶?、甲基乙二醇?xì)ぞ厶呛蜌ぞ厶枪烟侨樗狨ピ谏韕H具有顯著改善的溶解度(~10mg/mL)。商購可得的殼聚糖衍生物包括、但不限于殼聚糖寡糖乳酸酯、乙二醇?xì)ぞ厶腔蚣谆叶細(xì)ぞ厶?MGC)。這些衍生物具有不同于殼聚糖的物理性能，所述物理性能可能使得它們更適合用于與抗原、佐劑、脂質(zhì)體等一起使用。殼聚糖或殼聚糖衍生物以小于20、小于19、小于18、小于17、小于16、小于15、小于14、小于13、小于12、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3、小于2或小于1mg/ml的量存在。脂質(zhì)體制備用于制備脂質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)方法包括、但不限于在Liposomes:APracticalApproach,V.P.Torchilin,VolkmarWeissigOxfordUniversityPress,2003中報道的方法，且是本領(lǐng)域眾所周知的。在一種合適的制備本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的方法中，在圓底燒瓶中將AGP(例如CRX-601(0.2%w/v))和DOPC(具體地，1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿,3-4%w/v))和任選的甾醇(例如膽固醇(1%w/v))溶解在氯仿或四氫呋喃的有機(jī)相中。通過在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上并進(jìn)一步在高壓真空下蒸發(fā)12小時，除去有機(jī)溶劑。向如此得到的混合磷脂膜中加入10ml氨基烷烴磺酸緩沖液諸如10mMHEPES或10mMHEPES-鹽水緩沖液pH7.2。將混合物在間歇渦旋下在水浴(20-30℃)上聲處理，直到所有膜沿著燒瓶壁分散在溶液中(30min-1.5小時)。然后將溶液借助于脂質(zhì)擠出機(jī)(NorthernLipidsInc.,Canada))穿過聚碳酸酯膜過濾器接連地擠出以形成單層脂質(zhì)體。然后將脂質(zhì)體組合物使用0.22μm過濾器無菌過濾進(jìn)無菌的去熱原的容器中。通過動態(tài)光散射測量的得到的制劑的平均顆粒尺寸是80-120nm，具有凈負(fù)ζ電位。所述制劑代表2mg/mLCRX-601、10mg/mL膽固醇和40mg/mL總磷脂的最終靶濃度。適當(dāng)?shù)?，在過程開始時用AGP和DOPC脂質(zhì)溶解PEG-磷脂(例如MPEG-2000-DSPE(0.1-3%w/v)或MPEG-5000-DPPE(0.3-6%w/v))或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆407(1-16%w/v))。適當(dāng)?shù)?，脂質(zhì)體組合物是可以與殼聚糖(例如MGC200mg)溶解在HEPES中的無菌溶液混合的制劑。在該工作中使用的氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸酯(AGP)CRX-601可以如以前所述合成{Bazin,200832447/id}，并通過層析進(jìn)行純化(至>95%純度)。可以通過標(biāo)準(zhǔn)反相HPLC分析方法定量在起始原料中或在終產(chǎn)物中的CRX-601。在一個實(shí)施方案中，在脂質(zhì)體的制備過程中，與脂質(zhì)體水合緩沖液(“LHB”，基于磷酸鹽，pH=6.1)相比，在HEPES緩沖液(pH=7.0)中配制的CRX-601以快5倍的速度得到期望的顆粒尺寸減小。與LHB磷酸鹽緩沖液相比，CRX-601脂質(zhì)膜在HEPES緩沖液中的再水合要求少4倍的總壓力和時間來配制脂質(zhì)體。這是一個顯著的改善，因?yàn)樗?jié)省能量和時間并在脂質(zhì)體的加工過程中對AGP產(chǎn)生更少的應(yīng)力。脂質(zhì)體組合物的組分的合適范圍(w/v)包括一個實(shí)施方案，其包含在約3-4%w/v范圍內(nèi)的脂質(zhì)、1%w/v的甾醇、在0.1-1%w/v范圍內(nèi)的活性劑（諸如AGP）和10mM的氨基烷烴磺酸緩沖液。在一個實(shí)施方案中，甾醇適當(dāng)?shù)匾?.5-4%w/v的范圍存在。另外，在一個實(shí)施方案中，所述脂質(zhì):甾醇:活性劑比率是約3-4:1:0.1-1。實(shí)施例含有CRX-601的修飾的DOPC脂質(zhì)體的制備實(shí)施例1：具有1mol%MPEG-2000-DSPE替換的脂質(zhì)體mol%替換在該實(shí)施例中表示MPEG-2000-DSPE的量相對于總磷脂含量。在圓底燒瓶中將CRX-601(20mg)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（縮寫為DOPC）(396mg)、膽固醇(100mg)和PEG磷脂[N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽（縮寫為MPEG-2000-DSPE）(15mg)溶解在四氫呋喃的有機(jī)相中。通過在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上并進(jìn)一步在高壓真空下蒸發(fā)12小時，除去有機(jī)溶劑。向如此得到的混合磷脂膜中加入10ml10mMHEPES或10mMHEPES-鹽水緩沖液pH7.2。將混合物在間歇渦旋下在水浴(20-30℃)上聲處理，直到所有膜沿著燒瓶壁分散在溶液中(30min-1.5小時)。然后將溶液借助于脂質(zhì)微型擠出機(jī)(Lipex?擠出機(jī)(NorthernLipidsInc.,Canada))穿過具有600nm(1次穿過)、400nm(1次穿過)和200nm(2-4次穿過)的孔徑的聚碳酸酯過濾器接連地擠出以形成單層脂質(zhì)體。然后將脂質(zhì)體組合物使用0.22μm過濾器無菌過濾進(jìn)無菌的去熱原的容器中。通過動態(tài)光散射測量的得到的制劑的平均顆粒尺寸是80-120nm，具有凈負(fù)ζ電位。所述制劑代表2mg/mLCRX-601、10mg/mL膽固醇和40mg/mL總磷脂的最終靶濃度。在該工作中使用的氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸酯(AGP)CRX-601如以前所述合成{Bazin,200832447/id}，并通過層析進(jìn)行純化(至>95%純度)。通過標(biāo)準(zhǔn)反相HPLC分析方法定量在起始原料中或在終產(chǎn)物中的CRX-601。實(shí)施例2：具有較高mol%MPEG-2000-DSPE替換的脂質(zhì)體如在實(shí)施例1中制備脂質(zhì)體制劑，但是使用不同的DOPC和MPEG-2000-DSPE量以得到期望的mol%替換。已經(jīng)制備了具有5mol%、10mol%、15mol%和25mol%的靶替換的制劑。通過動態(tài)光散射測量的代表性平均顆粒尺寸和ζ電位顯示在表1中。具有高于25mol%替換的制劑難以制備，受限于在聲處理過程中脂質(zhì)膜在緩沖液中的溶解度，作為組分方案的溶解度限制。在高替換，預(yù)期PEG磷脂會飽和脂質(zhì)體雙層，余量作為膠束或單聚體(unimer)處于溶液中。表1:MPEG-2000-DSPE修飾的DOPC-膽固醇脂質(zhì)體的代表性制劑參數(shù).制劑Z-平均大小(nm)PDIZP(mV)PE-PEG2000水溶液60.34-151mol%MPEG-2000-DSPECRX-601DOPC-Chol脂質(zhì)體830.19-125mol%MPEG-2000-DSPECRX-601DOPC-Chol脂質(zhì)體1200.20-815mol%MPEG-2000-DSPECRX-601DOPC-Chol脂質(zhì)體1100.22-2225mol%MPEG-2000-DSPECRX-601DOPC-Chol脂質(zhì)體1100.22-730mol%MPEG-2000-DSPECRX-601DOPC-Chol脂質(zhì)體900.20-15實(shí)施例3：具有1mol%MPEG-5000-DPPE替換的脂質(zhì)體如在實(shí)施例1中制備脂質(zhì)體制劑，但是使用PEG磷脂N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽（縮寫為MPEG-5000-DPPE）(33mg)替代MPEG-2000-DSPE。通過動態(tài)光散射測量的得到的制劑的平均顆粒尺寸是80-120nm。實(shí)施例4：具有較高mol%MPEG-5000-DPPE替換的脂質(zhì)體如在實(shí)施例3中制備脂質(zhì)體制劑，但是使用不同的DOPC和MPEG-5000-DPPE量以得到期望的mol%替換。已經(jīng)制備了具有5mol%、10mol%、15mol%和25mol%的靶替換的制劑。通過動態(tài)光散射測量的代表性平均顆粒尺寸和ζ電位顯示在表2中。具有高于25mol%替換的制劑難以制備，受限于在聲處理過程中脂質(zhì)膜在緩沖液中的溶解度，作為組分方案的溶解度限制。在高替換，預(yù)期PEG磷脂會飽和脂質(zhì)體雙層，余量作為膠束或單聚體(unimer)處于溶液中。表2:MPEG-5000-DPPE修飾的DOPC-膽固醇脂質(zhì)體的代表性制劑參數(shù).制劑Z-平均大小(nm)PDIZP(mV)PE-PEG5000水溶液可變1.01mol%PE-PEG5000CRX-601DOPC-Chol脂質(zhì)體900.20-35mol%PE-PEG5000CRX-601DOPC-Chol脂質(zhì)體1000.20-215mol%PE-PEG5000CRX-601DOPC-Chol脂質(zhì)體1000.19-725mol%PE-PEG5000CRX-601DOPC-Chol脂質(zhì)體750.22-230mol%PE-PEG5000CRX-601DOPC-Chol脂質(zhì)體800.23-7實(shí)施例5：具有1mol%泊洛沙姆407添加的脂質(zhì)體的制備mol%添加在該實(shí)施例中表示泊洛沙姆的量相對于總磷脂含量。在圓底燒瓶中將CRX-601(20mg)、DOPC(400mg)和泊洛沙姆407(64mg)溶解在四氫呋喃的有機(jī)相中，并如在實(shí)施例1中討論的那樣處理。在這些制備物中不包括膽固醇，因?yàn)橐呀?jīng)報道它會減少泊洛沙姆向磷脂雙層中的摻入。通過動態(tài)光散射測量的得到的制劑的平均顆粒尺寸是120-180nm。所述制劑代表2mg/mLCRX-601、40mg/mLDOPC和1mol%(wrtDOPC)泊洛沙姆407的最終靶濃度。實(shí)施例6：具有較高mol%泊洛沙姆407添加的脂質(zhì)體的制備如在實(shí)施例5中制備脂質(zhì)體制劑，但是使用遞增量的泊洛沙姆407。已經(jīng)制備了具有5mol%、10mol%、15mol%和25mol%的靶替換的制劑。通過動態(tài)光散射測量的代表性平均顆粒尺寸和ζ電位顯示在表3中。具有高于25mol%添加的制劑難以制備，受限于在聲處理過程中脂質(zhì)-泊洛沙姆膜在緩沖液中的溶解度，作為組分方案的溶解度限制。在高替換，預(yù)期泊洛沙姆407會飽和脂質(zhì)體雙層，余量作為膠束或單聚體(unimer)處于溶液中。表3:泊洛沙姆407修飾的DOPC脂質(zhì)體的代表性制劑參數(shù).。實(shí)施例7：具有泊洛沙姆188添加的脂質(zhì)體的制備如在實(shí)施例6中制備脂質(zhì)體制劑，但是使用泊洛沙姆188替代泊洛沙姆407。已經(jīng)制備了具有15mol%和25mol%的靶替換的制劑。通過動態(tài)光散射測量的代表性平均顆粒尺寸和ζ電位顯示在表4中。實(shí)施例8：具有泊洛沙姆184添加的脂質(zhì)體的制備如在實(shí)施例6中制備脂質(zhì)體制劑，但是使用泊洛沙姆184替代泊洛沙姆407。已經(jīng)制備了具有15mol%和25mol%的靶替換的制劑。通過動態(tài)光散射測量的代表性平均顆粒尺寸和ζ電位顯示在表4中。表4:泊洛沙姆188或泊洛沙姆184修飾的DOPC脂質(zhì)體的代表性制劑參數(shù).制劑Z-平均大小(nm)/PDIZP(mV)空白25mol%PluronicF127DOPC脂質(zhì)體155/0.18-0.6空白25mol%PluronicF68DOPC脂質(zhì)體176/0.12-29空白25mol%PluronicL64DOPC脂質(zhì)體75/0.21-0.4CRX-60115mol%PluronicF127DOPC脂質(zhì)體161/0.21-0.1CRX-60125mol%PluronicF127DOPC脂質(zhì)體122/0.19-3CRX-60115mol%PluronicF68DOPC脂質(zhì)體184/0.11-27CRX-60125mol%PluronicF68DOPC脂質(zhì)體180/0.10-22CRX-60115mol%PluronicL64DOPC脂質(zhì)體68/0.25-11CRX-60125mol%PluronicL64DOPC脂質(zhì)體88/0.22-5實(shí)施例9：含有殼聚糖的脂質(zhì)體制劑的制備將甲基乙二醇?xì)ぞ厶?殼聚糖乙二醇三甲基碘化銨，200mg)溶解在10ml10mMHEPES-鹽水緩沖液（pH7.2）中以產(chǎn)生20mg/ml的濃度。將溶液使用0.22μm過濾器無菌過濾進(jìn)無菌的去熱原的容器中。將來自實(shí)施例1–4的制劑與不同體積的甲基乙二醇?xì)ぞ厶侨芤簾o菌地混合以產(chǎn)生1-10mg/mL范圍內(nèi)的濃度。盡管常規(guī)DOPC-膽固醇脂質(zhì)體制劑在與殼聚糖或它的衍生物（包括甲基乙二醇?xì)ぞ厶牵┗旌虾缶奂?表5)，但是這里報道的修飾的脂質(zhì)體(實(shí)施例1-4)在混懸液中保持穩(wěn)定(表6)。顯示在表6中的通過動態(tài)光散射測量的代表性平均顆粒尺寸和ζ電位指示超過大約1mg/mL甲基乙二醇?xì)ぞ厶菚r顆粒尺寸的一些增加和ζ電位的反轉(zhuǎn)(從凈負(fù)電位至凈正電位)，這與甲基乙二醇?xì)ぞ厶堑谋砻姘幌嘁恢?。在超過特定閾值的濃度，預(yù)期甲基乙二醇?xì)ぞ厶菚柡椭|(zhì)體雙層，余量處于溶液中。表5：指示含有不同濃度的甲基乙二醇?xì)ぞ厶?MGC)的未修飾的脂質(zhì)體DOPC制劑的聚集的代表性制劑參數(shù).在所有情況下，CRX-601濃度是1mg/mL.制劑Z-平均大小(nm)/PDIZP(mV)601DOPC-Chol脂質(zhì)體142/0.16-14601DOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.2mg/mL26350/1.0-8601DOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.4mg/mL18200/1.0-1601DOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.6mg/mL29800/0.73+3601DOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.8mg/mL26670/0.29-1601DOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,1mg/mL392/0.64+9601DOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,2mg/mL212/0.61+7601DOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,3mg/mL210/0.67+8601DOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,4mg/mL247/0.73+12601DOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,5mg/mL254/0.55+11601DOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,10mg/mL231/0.32+21表6：在10mMHEPES-鹽水中制備的在1%、5%、15%和30%脂質(zhì)體修飾的甲基乙二醇?xì)ぞ厶?MGC)包被的MPEG-2000-DSPE和MPEG-5000-DPPE修飾的DOPC-膽固醇脂質(zhì)體的代表性制劑參數(shù).在所有情況下，CRX-601濃度是1mg/mL.制劑Z-平均大小(nm)/PDIZP(mV)CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體94/0.23-17.6CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.2mg/mL183/0.39-2.7CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.4mg/mL13990/0.9-2.3CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.6mg/mL60670/1.0+2.6CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.8mg/mL248/0.35+14.4CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,1mg/mL103/0.34+4.4CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,2mg/mL107/0.24+4.5CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,3mg/mL107/0.25+2.3CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,4mg/mL117/0.34+5.9CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,5mg/mL107/0.26+7.4CRX-601/1mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,10mg/mL127/0.26+4.2CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體100/0.23-3.7CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.2mg/mL123/0.17-1.9CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.4mg/mL154/0.23-2.2CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.6mg/mL141/0.41-0.9CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.8mg/mL115/0.26+4.3CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,1mg/mL109/0.26+5.8CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,2mg/mL111/0.22+3.9CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,3mg/mL110/0.23+0.5CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,4mg/mL122/0.27+2.1CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,5mg/mL117/0.22+4.1CRX-601/1mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,10mg/mL127/0.25+3.1CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體121/0.25-7.9CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.2mg/mL137/0.26-8.0CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.4mg/mL136/0.23-3.8CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.6mg/mL142/0.28-5.0CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.8mg/mL131/0.27-1.2CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,1mg/mL140/0.27+0.3CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,2mg/mL135/0.27+3.7CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,3mg/mL143/0.28+7.0CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,4mg/mL146/0.29+13.4CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,5mg/mL164/0.27+3.6CRX-601/5mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,10mg/mL165/0.28+11.7CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體97/0.17-4.9CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.2mg/mL102/0.16-3.1CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.4mg/mL103/0.20-3.9CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.6mg/mL106/0.17-2.0CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.8mg/mL107/0.21-1.3CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,1mg/mL109/0.190.1CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,2mg/mL103/0.19-0.9CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,3mg/mL107/0.19-0.9CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,4mg/mL108/0.23+3.1CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,5mg/mL109/0.19+5.4CRX-601/5mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,10mg/mL122/0.22+3.4CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體96/0.18-1.2CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.1mg/mL99/0.20-6.3CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.2mg/mL93/0.14-0.8CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.3mg/mL96/0.192.1CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.4mg/mL100/0.19-4.0CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.5mg/mL95/0.190.0CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.6mg/mL101/0.18-2.9CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.7mg/mL101/0.19-0.4CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.8mg/mL100/0.18-0.1CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.9mg/mL108/0.17-2.0CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,1mg/mL109/0.14-0.9CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,2mg/mL108/0.20+0.1CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,3mg/mL109/0.18+0.3CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,4mg/mL107/0.21+0.5CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,5mg/mL111/0.21-1.0CRX-601/15mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,10mg/mL114/0.22+3.3CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體99/0.17CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.1mg/mL102/0.19-12.3CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.2mg/mL103/0.17-8.1CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.3mg/mL105/0.19-4.6CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.4mg/mL107/0.20-4.7CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.6mg/mL111/0.150.2CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.7mg/mL115/0.19-2.2CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.8mg/mL109/0.18-2.5CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.9mg/mL114/0.18-2.3CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.5mg/mL107/0.17-5.2CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,1mg/mL116/0.20-1.7CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,2mg/mL110/0.18+1.8CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,3mg/mL115/0.20+6.5CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,4mg/mL124/0.26+11.0CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,5mg/mL120/0.23+4.5CRX-601/15mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,10mg/mL139/0.26+9.6CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體87/0.20-7.4CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.2mg/mL85/0.21-2.0CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.4mg/mL85/0.21-1.7CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,1mg/mL83/0.200.4CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,2mg/mL94/0.21-1.4CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,3mg/mL97/0.22+0.1CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,4mg/mL86/0.22+1.3CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,5mg/mL87/0.24+1.4CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.6mg/mL78/0.23-2.5CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.8mg/mL76/0.21-1.4CRX-601/30mol%MPEG-5000-DPPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,10mg/mL99/0.27-1.8CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體86/0.16-3.8CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.2mg/mL82/0.18-3.8CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.4mg/mL89/0.18-2.2CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.6mg/mL88/0.16-4.8CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,0.8mg/mL82/0.20-4.4CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,1mg/mL92/0.22-0.7CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,2mg/mL110/0.19-0.1CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,3mg/mL110/0.23+2.0CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,4mg/mL107/0.22+2.8CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,5mg/mL112/0.22+7.0CRX-601/30mol%MPEG-2000-DSPEDOPC-Chol脂質(zhì)體+MGC,10mg/mL122/0.25+10.3殼聚糖寡糖乳酸酯--以與上面使用甲基乙二醇?xì)ぞ厶?MGC)相同的方式進(jìn)行研究，但是使用殼聚糖寡糖乳酸酯替代甲基乙二醇?xì)ぞ厶?。所有?jīng)測試的含有來自實(shí)施例1的脂質(zhì)體的組合物發(fā)生聚集。所有其它制劑在混懸液中保持穩(wěn)定。乙二醇?xì)ぞ厶?-以與上面使用甲基乙二醇?xì)ぞ厶?MGC)相同的方式進(jìn)行研究，但是使用乙二醇?xì)ぞ厶翘娲谆叶細(xì)ぞ厶?。所有?jīng)測試的含有來自實(shí)施例1和2的脂質(zhì)體的組合物發(fā)生聚集。來自實(shí)施例3和4的脂質(zhì)體在混懸液中保持穩(wěn)定。殼聚糖包被的脂質(zhì)體：通過將未修飾的、磷脂-PEG修飾的或Pluronic修飾的CRX-601脂質(zhì)體與殼聚糖衍生物混合來制備殼聚糖包被的脂質(zhì)體制劑，并針對大小和ζ-電位的變化進(jìn)行評價。當(dāng)與MGC組合時，在0.4-2mg/mLMGC，未修飾的脂質(zhì)體表現(xiàn)出聚集，從而導(dǎo)致沉淀，在圖1A中指示為表現(xiàn)出在μm范圍內(nèi)的大小的顆粒。在超過2mg/mL的MGC濃度，所述制劑最初表現(xiàn)得是膠體上穩(wěn)定的，但是在1-4天中傾向于聚集。具有5mol%修飾的PE-PEG2K和PE-PEG5K修飾的脂質(zhì)體在有MGC存在下是膠體上穩(wěn)定的，在任何測試的濃度沒有大小的重大變化(圖1A)。ζ-電位從負(fù)電位至正電位的反轉(zhuǎn)發(fā)生在大約0.5mg/mlMGC（對于未修飾的脂質(zhì)體）和1mg/mL（對于5%PE-PEG2K或PE-PEG5K修飾）。具有少至1mol%PE-PEG2K或PE-PEG5K的修飾被證實(shí)會在大多數(shù)濃度提供針對MGC誘導(dǎo)的聚集的足夠保護(hù)(圖2A)。在1%修飾，PE-PEG5K脂質(zhì)體比PE-PEG2K修飾的脂質(zhì)體更耐受MGC誘導(dǎo)的聚集。在0.4-0.6mg/mLMGC，用1%PE-PEG5K修飾沒有觀察到顆粒尺寸或PDI的重大變化，但是用1%PE-PEG2K修飾觀察到大小增加至μm范圍。直到25%的修飾沒有導(dǎo)致在有MGC存在下的任何失穩(wěn)/聚集(圖2B)。在Pluronic修飾的脂質(zhì)體中，F(xiàn)127修飾的脂質(zhì)體是最穩(wěn)定的，在評價的MGC濃度的整個范圍內(nèi)沒有表現(xiàn)出肉眼可見的聚集或多分散性的增加(圖1B)。顆粒尺寸的增加是約10-30nm，且ζ-電位從凈負(fù)電位至正電位的反轉(zhuǎn)發(fā)生在≥0.4mg/mL的MGC濃度。在15%和25%修飾的F127修飾的脂質(zhì)體在有MGC存在下是類似穩(wěn)定的(圖3A)，但是在1%修飾指示聚集(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)與MGC組合時，具有5mol%L64修飾的脂質(zhì)體在0.2-0.8mg/mLMGC表現(xiàn)出大小和多分散性的增加(圖1B)，這對應(yīng)于脂質(zhì)體表面電荷的完全中和。在≥1mg/mLMGC，類似于未修飾的脂質(zhì)體，L64修飾的脂質(zhì)體最初顯得穩(wěn)定，但是隨時間傾向于聚集和沉淀(圖1B)。F68修飾的脂質(zhì)體是最不穩(wěn)定的，并在所有測試濃度的MGC造成立即沉淀。用具有15%和25%的較高Pluronic修飾的脂質(zhì)體觀察到類似趨勢(圖3)。因此，在有MGC存在下Pluronic修飾的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性的次序是F127>L64>F68。在有殼聚糖衍生物、MGC、GC和CO存在下對這些脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性評價的總結(jié)顯示在表7中?？傊谒袦y試的殼聚糖衍生物中，用MGC觀察到最少聚集。磷脂-PEG修飾的脂質(zhì)體比Pluronic脂質(zhì)體對殼聚糖誘導(dǎo)的聚集更穩(wěn)定。僅表現(xiàn)出電荷的顯著下降的制劑(磷脂-PEG或PluronicF127修飾的脂質(zhì)體)耐受殼聚糖誘導(dǎo)的聚集。PE-PEG5K脂質(zhì)體比PE-PEG2K脂質(zhì)體更穩(wěn)定，如在有MGC存在下在1%修飾時大小/PDI沒有任何變化和在有GC和CO存在下改善的穩(wěn)定性所證實(shí)的。表7：具有不同修飾程度的未修飾的、磷酸脂質(zhì)-PEG和Pluronic脂質(zhì)體對殼聚糖衍生物誘導(dǎo)的聚集的穩(wěn)定性總結(jié)aa測試的最低修飾是1mol%e部分聚集0.2-0.6mg/mLbMGC：甲基乙二醇?xì)ぞ厶牵琧GC：乙二醇?xì)ぞ厶?，dCO：殼聚糖寡糖乳酸酯。實(shí)施例10：兔熱原測試在這里使用熱原測試作為CRX-601向來自實(shí)施例1–6的修飾的脂質(zhì)體中的摻入的替代量度和作為它們在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性的量度。在PacificBiolabs(Hercules,CA)按照它們的SOP16E-02（其遵循在USP<151>中描述的規(guī)程）執(zhí)行測試。除了來自實(shí)施例7(泊洛沙姆188修飾的脂質(zhì)體)和實(shí)施例8(泊洛沙姆184修飾的脂質(zhì)體)的制劑以外，來自實(shí)施例1–6的所有制劑直到至少250ngCRX-601/kg動物體重的濃度缺少致熱原性。這種直到250ng/kg的致熱原性缺乏對應(yīng)于與游離CRX-601(最大無熱原劑量為2.5ng/kg)相比的100倍改善，并指示>99%的CRX-601在脂質(zhì)體雙層中的摻入。在表8中指示了來自每個測試三只兔子的各個溫度增加。表8：在實(shí)施例2、4、6和9中描述的制劑的代表性兔熱原測試測量結(jié)果。在括號中的值是三只動物在測試階段中的最大溫度變化。0.5℃或更大的溫度升高被認(rèn)為是熱原性應(yīng)答。符號P和F分別指示’通過（Pass）’或‘失敗（Fail）’應(yīng)答。制劑在250ng/kg的劑量在任何時間區(qū)間觀察到的最大溫度升高(相對于對照)在500ng/kg的劑量在任何時間區(qū)間觀察到的最大溫度升高(相對于對照)CRX-6015%MPEG-2000-DSPEDOPCChol脂質(zhì)體P(0.1℃,0.4℃,0.0℃)F(0.5℃,0.4℃,0.5℃)CRX-60115%MPEG-2000-DSPEDOPCChol脂質(zhì)體P(0.0℃,0.1℃,0.0℃)P(0.0℃,0.0℃,0.2℃)CRX-60130%MPEG-2000-DSPEDOPCChol脂質(zhì)體P(0.1℃,0.0℃,0.0℃)P(0.1℃,0.3℃,0.0℃)CRX-6015%MPEG-5000-DPPEDOPCChol脂質(zhì)體P(0.0℃,0.0℃,0.0℃)P(0.2℃,0.1℃,0.0℃)CRX-60115%MPEG-5000-DPPEDOPCChol脂質(zhì)體P(0.3℃,0.2℃,0.0℃)P(0.0℃,0.0℃,0.4℃)CRX-60130%MPEG-5000-DPPEDOPCChol脂質(zhì)體P(0.3℃,0.0℃,0.3℃)P(0.3℃,0.0℃,0.0℃)CRX-6015%MPEG-2000-DSPEDOPCChol脂質(zhì)體,MGC5mg/mLP(0.0℃,0.2℃,0.1℃)CRX-6015%MPEG-5000-DPPEDOPCChol脂質(zhì)體,MGC5mg/mLP(0.0℃,0.2℃,0.1℃)CRX-6015%MPEG-2000-DSPEDOPCChol脂質(zhì)體,CL5mg/mLP(0.0℃,0.0℃,0.2℃)CRX-6015%MPEG-5000-DPPEDOPCChol脂質(zhì)體,CL5mg/mLP(0.4℃,0.0℃,0.4℃)CRX-6015%泊洛沙姆407DOPC脂質(zhì)體P(0.3℃,0.3℃,0.1℃)F(0.3℃,0.3℃,1.0℃)CRX-60110%泊洛沙姆407DOPC脂質(zhì)體P(0.2℃,0.0℃,0.0℃)F(0.0℃,1.1℃,0.0℃)CRX-60115%泊洛沙姆407DOPC脂質(zhì)體P(0.2℃,0.0℃,0.1℃)P(0.0℃,0.3℃,0.0℃)CRX-601/15%泊洛沙姆188DOPC脂質(zhì)體F(0.5℃,0.4℃,0.8℃)CRX-601/25%泊洛沙姆188DOPC脂質(zhì)體F(0.3℃,0.7℃,0.4℃)CRX-601/15%泊洛沙姆184DOPC脂質(zhì)體F(0.3℃,0.6℃,0.7℃)F(0.8℃,0.8℃,0.4℃)CRX-601/25%泊洛沙姆184DOPC脂質(zhì)體F(0.9℃,0.5℃,0.9℃)F(0.5℃,0.6℃,0.9℃)甲基乙二醇?xì)ぞ厶?MGC)P(0.0℃,0.0℃,0.1℃)殼聚糖乳酸酯(CL)P(0.0℃,0.0℃,0.0℃)縮寫：甲基乙二醇?xì)ぞ厶?MGC)；殼聚糖寡糖乳酸酯(CL)。實(shí)施例11：小鼠舌下疫苗接種和特異性抗體應(yīng)答的確定為這些研究使用得自CharlesRiverLaboratories(Wilmington,MA)的雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)。通過舌下施用(5-6μL)給通過腹膜內(nèi)(i.p)施用氯胺酮(100mg/kg)和賽拉嗪(10mg/kg)麻醉的小鼠施用疫苗。在第0、21和42天用在脂質(zhì)體制劑中的5μgCRX-601（其與1或1.5μgHA/小鼠混合，使用流感抗原A/Victoria/210/2009H3N2）給所有小鼠接種疫苗。在第36天(14dp2)在麻醉下收獲血清，在第56天(14dp3)將小鼠處死，并收集陰道洗液、氣管洗液和血清的最終收獲物。根據(jù)U.S.DepartmentofHealthandHumanServicesOfficeofLaboratoryAnimalWelfare和InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeatGSKBiologicals,Hamilton,Montana建立的指南使用所有動物。通過2個獨(dú)立的免疫測定（酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和流感血凝素抑制（HI）測定）測量特異性抗體應(yīng)答。使用裂解的流感包被的96孔板(NuncMaxisorp)執(zhí)行ELISA，并使用過氧化物酶聯(lián)山羊抗-小鼠IgG、IgG1、IgG2a或IgA檢測來自添加的血清或氣管洗液或陰道洗液樣品的結(jié)合的免疫球蛋白。這之后添加酶特異性的色原體，其產(chǎn)生與血清中所含的特異性抗流感IgG/IgA的量直接成比例的顏色強(qiáng)度。在450nm讀出光密度。通過評價在有小鼠血清存在下暴露于流感病毒以后雞或公雞RBC的抑制來執(zhí)行HI測定。使用導(dǎo)致RBC的完全或部分凝集的流感病毒的最后稀釋度的倒數(shù)計(jì)算HI滴度，并表達(dá)為HA單元/50μl血清。實(shí)施例12：使用MPEG-2000-DSPE或MPEG-5000-DPPE修飾的脂質(zhì)體的小鼠舌下疫苗接種(NIH#162)使用在實(shí)施例11中描述的規(guī)程，用來自實(shí)施例1-4的1mol%、5mol%和25mol%MPEG-2000-DSPE或MPEG-5000-DPPE修飾的脂質(zhì)體給小鼠接種疫苗。第二次疫苗接種后和第三次疫苗接種后14天的血清IgG滴度顯示在圖4中(且在圖5中也與HI滴度一起)。在舌下治療組中，在25%MPEG-5000-DPPE脂質(zhì)體治療組中接受CRX-601的小鼠中的滴度最高，顯著高于CRX-601水性或CRX-601未修飾的脂質(zhì)體治療組。實(shí)施例13：使用泊洛沙姆407修飾的脂質(zhì)體的小鼠舌下疫苗接種(NIH#158)使用在實(shí)施例11中描述的規(guī)程，用來自實(shí)施例5-6的5mol%、10mol%和15mol%泊洛沙姆407修飾的脂質(zhì)體給小鼠接種疫苗。第二次疫苗接種后和第三次疫苗接種后14天的血清IgG滴度顯示在圖6中。在舌下治療組中，在15%泊洛沙姆407修飾的脂質(zhì)體治療組中接受CRX-601的小鼠中的滴度最高(第二次后)，顯著高于CRX-601水性或CRX-601未修飾的脂質(zhì)體治療組。實(shí)施例14：使用泊洛沙姆407、188和184修飾的脂質(zhì)體的小鼠舌下疫苗接種(NIH#167)使用在實(shí)施例11中描述的規(guī)程，用來自實(shí)施例5-8的15mol%和25mol%泊洛沙姆407、或188、或184修飾的脂質(zhì)體給小鼠接種疫苗。第二次疫苗接種后和第三次疫苗接種后14天的血清IgG滴度顯示在圖7中(且在圖8中與HI滴度一起)。在舌下治療組中，在15%泊洛沙姆188脂質(zhì)體治療組中接受CRX-601的小鼠中的滴度最高。在CRX-601/泊洛沙姆修飾的脂質(zhì)體治療組中的滴度通常優(yōu)于CRX-601水性或CRX-601未修飾的脂質(zhì)體治療組。實(shí)施例15：使用MPEG-2000-DSPE或MPEG-5000-DPPE和甲基乙二醇?xì)ぞ厶腔驓ぞ厶枪烟侨樗狨バ揎椀闹|(zhì)體的小鼠舌下疫苗接種(NIH#163)使用在實(shí)施例11中描述的規(guī)程，用來自實(shí)施例2和4的5摩爾%MPEG-2000-DSPE或MPEG-5000-DPPE修飾的脂質(zhì)體（如在實(shí)施例9中所述用甲基乙二醇?xì)ぞ厶腔驓ぞ厶枪烟侨樗狨ヅ渲疲┙o小鼠接種疫苗。第二次疫苗接種后和第三次疫苗接種后14天的血清IgG滴度顯示在圖9中(且在圖10中也與HI滴度一起)。在舌下治療組中，在脂質(zhì)體+甲基乙二醇?xì)ぞ厶侵委熃M中的滴度通常優(yōu)于CRX-601未修飾的脂質(zhì)體治療組。實(shí)施例16：使用泊洛沙姆和甲基乙二醇?xì)ぞ厶切揎椀闹|(zhì)體的小鼠舌下疫苗接種(NIH#164)使用在實(shí)施例11中描述的規(guī)程，用來自實(shí)施例5-8的5mol%、15mol%和25mol%泊洛沙姆407(在圖11和12中標(biāo)記的F127)修飾的脂質(zhì)體和如在實(shí)施例9中所述用甲基乙二醇?xì)ぞ厶桥渲频?5mol%或25mol%泊洛沙姆407脂質(zhì)體給小鼠接種疫苗。第二次疫苗接種后和第三次疫苗接種后14天的血清IgG滴度顯示在圖11中(且在圖12中也與HI滴度一起)。當(dāng)前第1頁1 2 3