以陽離子脂質(zhì)體dotap為佐劑的疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以陽離子脂質(zhì)體DOTAP(2,3-二油氧基丙基三甲基氯化銨)作為佐劑的疫苗及其制備方法。該疫苗由蛋白質(zhì)抗原與陽離子脂質(zhì)體DOTAP制備而成，抗原分子與DOTAP脂質(zhì)形成0－500nm±的膠束結(jié)構(gòu)，抗原分子包裹在膠束的親水內(nèi)核中或鑲嵌在膠束膜中。DOTAP作為疫苗佐劑通過與抗原分子形成膠束結(jié)構(gòu)，可明顯提高抗原提呈細胞對抗原的攝取和提呈；同時與傳統(tǒng)佐劑通過Toll樣受體途徑激活抗原提呈細胞不同，DOTAP可通過促細胞分裂原活化蛋白激酶(MAP)途徑激活抗原提呈細胞，從而誘導特異性的免疫應(yīng)答，該途徑炎癥因子釋放少，炎癥反應(yīng)低，因此安全性更好；DOTAP作為疫苗佐劑既可誘導體液免疫應(yīng)答和又可誘導細胞免疫應(yīng)答，克服了傳統(tǒng)鋁佐劑只能誘導體液免疫應(yīng)答的缺陷。
【專利說明】
W陽離子脂質(zhì)體DOTAP為佐劑的疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本文設(shè)及一種W陽離子脂質(zhì)體D0TAP作為佐劑的疫苗及其制備方法，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 佐劑是指加入疫苗制劑后能促進、增強或延長機體對抗原特異性免疫應(yīng)答的物 質(zhì)。佐劑增強免疫應(yīng)答的機制尚未完全闡明，不同佐劑也不盡相同，但概括而言，可歸納為： 一，佐劑和抗原一起進入機體后，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲存庫，有利于抗原的 緩釋，延長抗原在體內(nèi)存留的時間；二，被佐劑吸附的抗原更易被吞隧細胞吞隧，促進對抗 原的處理，易在局部形成炎癥反應(yīng)；Ξ，刺激淋己細胞增殖和分化，從而增強和擴大免疫應(yīng) 答的效應(yīng)；四，增強巨隧細胞和淋己細胞膜的通透性，促進其對抗原的有效處理和提呈。自 從1926年Glenny首次用明抓沉淀白喉類毒素制成抗原免疫豚鼠，取得了較強的免疫效果， 侶佐劑已廣泛應(yīng)用于百白破、乙肝等多種疫苗中，并取得了良好的效果，其安全性和有效性 得到了公認，成為人用疫苗中使用最廣泛的一種佐劑。然而，隨著侶佐劑的廣泛應(yīng)用，其不 足之處也逐漸暴露。首先侶佐劑不能凍干；制備的凝膠批與批之間差異大，質(zhì)量難控制且對 佐劑的效果很難做出準確的評價；更為重要的是，侶佐劑只能誘導產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，不能 誘導產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答；還可誘導產(chǎn)生I姐抗體，增加了發(fā)生超敏反應(yīng)的危險。而一個理想 的疫苗佐劑應(yīng)具有W下特點：可增強抗原的免疫原性，特別是一些無免疫原性或弱免疫原 性的抗原物質(zhì)；可增強機體的免疫反應(yīng)性，特別是那些免疫機能低下人群；能誘導產(chǎn)生高 親和力的抗體的同時，可誘導產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答；可引起或增強遲發(fā)型超敏反應(yīng)；對機體 固有免疫的激活適度，誘導產(chǎn)生較低水平的引起不良反應(yīng)的炎癥因子IL-1、TNF-a等，免 疫副反應(yīng)小。
[0003] 2, 3-二油氧基丙基Ξ甲基氯化錠值0TA巧是一種常用的陽離子脂質(zhì)體，由于它與 DNA或RNA形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復合物進入細胞，并將核酸釋放入細胞內(nèi)，因此一直作為一種真 核細胞轉(zhuǎn)染試劑用于真核細胞的轉(zhuǎn)染和DNA疫苗的載體。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，D0TAP還是 一種很好的免疫調(diào)節(jié)劑，將多膚或蛋白質(zhì)抗原與D0TAP包裝制備成陽離子脂質(zhì)體可明顯提 高抗原提呈細胞對抗原的提呈能力，同時與傳統(tǒng)佐劑通過Toll樣受體途徑激活抗原提呈 細胞不同，D0TAP可通過促細胞分裂原活化蛋白激酶（MA巧途徑激活抗原提呈細胞，從而誘 導特異性的免疫應(yīng)答。該途徑炎癥因子釋放少，炎癥反應(yīng)低。因此如果將D0TAP作為一種 新的疫苗佐劑既可W增強免疫應(yīng)答的強度，又避免了傳統(tǒng)侶佐劑免疫副反應(yīng)強的缺點。目 前國內(nèi)外尚無使用D0TAP作為蛋白質(zhì)疫苗佐劑的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種W陽離子脂質(zhì)體D0TAP作為佐劑的疫苗，該疫苗通過將蛋白質(zhì) 抗原與陽離子脂質(zhì)體D0TAP包裝、擠壓形成0 - 500皿的蛋白質(zhì)陽離子脂質(zhì)體納米顆粒，疫 苗的免疫原性明顯提高，同時可降低疫苗免疫后的不良反應(yīng)。
[0005] 本發(fā)明提供了一種W陽離子脂質(zhì)體DOTAP作為佐劑的疫苗的制備方法。
[0006] 本發(fā)明提供的冊N1型流感陽離子脂質(zhì)體D0TAP佐劑疫苗的制備方法，通過W下技 術(shù)方案完成：
[0007] 疫苗組成成分：冊N1型流感裂解疫苗原液化5N1型血凝素抗原0 - 100 μ g/ml，總 蛋白與血凝素含量比為1 :2 - 1 :4);陽離子脂質(zhì)D0TAP(0 - 3000 μ g/ml);含30mM氯化鋼 的等滲葡萄糖溶液。
[0008] 所述的冊N1型流感裂解疫苗原液是采用WHO發(fā)布的購置于英國NIBSC的毒株按 照中國藥典2010版3部中流感疫苗生產(chǎn)工藝的方法制備而成，并用等滲葡萄糖溶液稀釋而 成。
[0009] 所述的的陽離子脂質(zhì)體D0TAP化3-二油氧基丙基Ξ甲基氯化錠）購置于加拿大 TRC公司，純度>98%。
[0010] 冊N1型流感陽離子脂質(zhì)體D0TAP佐劑疫苗的制備方法：將D0TAP溶解于1 :1的甲 醇和氯仿溶劑中，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2小時后形成脂膜，加入一定濃度的冊N1型流感病毒裂解 疫苗原液，30°C充分混合2小時后，通過800nm、400nm、200nm孔徑的碳酸纖維醋膜分別4次 擠壓。馬爾文粒度分析儀檢測脂質(zhì)體粒徑，平均粒徑應(yīng)在200nm±，粒徑分散指數(shù)PDI值應(yīng) 《0. 25,和zata電位為正電荷。
[0011] D0TAP陽離子脂質(zhì)體包封率檢測：W 40000g的離屯、力超速離屯、，將脂質(zhì)體微粒完 全沉淀，用微量BCA法檢測上清中的游離抗原的蛋白濃度，從而計算脂質(zhì)體包封率的檢測 方法。計算公式為：包封率=[1 -(上清中抗原濃度X溶液體積）/(抗原給藥濃度X給 藥體積）]X 100 %。包封率應(yīng)> 50 %。
【附圖說明】
[0012] 圖1 :0. 1 μ g劑量不同實驗組血凝抑制抗體動態(tài)變化曲線。
[0013] 圖2 :1 μ g劑量不同實驗組血凝抑制抗體動態(tài)變化曲線。
[0014] 圖3 :10 μ g劑量不同實驗組血凝抑制抗體動態(tài)變化曲線。
[0015] 圖4 :不同劑量實驗組免疫后42天血清抗體保護率。
[0016] 圖5 :不同劑量實驗組免疫后42天血清總IgG抗體水平比較。
[0017] 圖6 :不同劑量實驗組免疫后42天血清亞型抗體IgGl水平比較。
[0018] 圖7 :不同劑量實驗組免疫后42天血清亞型抗體IgG2a水平比較。
[0019] 圖8 :不同劑量D0TAP組免疫后血清總IgG抗體水平比較。
[0020] 圖9 :不同劑量D0TAP組免疫后42天血凝抑制抗體水平比較。
[0021] 圖10 :不同實驗組脾臟淋己細胞體外培養(yǎng)比-2分泌水平比較。
[0022] 圖11 :不同實驗組脾臟淋己細胞體外培養(yǎng)IFN-丫分泌水平比較。
[0023] 圖12 :不同實驗組脾臟淋己細胞體外培養(yǎng)比-4分泌水平比較。
[0024] 圖13 :HBsAg陽離子脂質(zhì)體佐劑疫苗SDS-PAGE電泳結(jié)果，1 :HBsAg原液；2 :HBsAg 脂質(zhì)體溶液；3出BsAg脂質(zhì)體離屯、后沉淀；4 :皿sAg脂質(zhì)體離屯、后上清；5 :空白脂質(zhì)體；6: 蛋白質(zhì)標準。
[002引 圖14 :透射電子顯微鏡觀察皿SAg陽離子脂質(zhì)體（20 μ g/ml皿S)。
[002引圖15 :不同實驗組皿S IgG抗體幾何平均滴度比較（A:免疫后14天；B:免疫后 28天；C:免疫后42天）
[0027] 圖16 :初免后42天不同實驗組亞型抗體幾何平均滴度比較（A: IgGl ;B: IgG2a)
【具體實施方式】
[0028] W下通過實例對本發(fā)明進行進一步說明，本發(fā)明包括但不僅限于W下實例。
[0029] 實施例1含冊N1型血凝素抗原10 μ g/ml，D0TAP3000 μ g/ml的陽離子脂質(zhì)體佐劑 疫苗的制備。
[0030] 將冊N1型流感裂解疫苗原液用含30mM氯化鋼的等滲葡萄糖溶液稀釋至血凝素抗 原 10 μ g/ml。
[00引]準確稱取D0TAP30mg至茄型瓶中，加入甲醇、氯仿各2ml，充分溶解后，在30°C， 30rpm條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2小時，至有機溶劑完全揮發(fā)，D0TAP在瓶底形成均勻的脂膜。 [003引加入10ml含冊N1型血凝素抗原10 μ g/ml的稀釋后的冊N1型流感裂解疫苗原液， 30°C，6化pm旋轉(zhuǎn)茄型瓶2小時，使脂膜與抗原溶液充分融合。
[0033] 將復水后的脂質(zhì)體抗原溶液分別通過800皿、400皿、200皿孔徑的碳酸纖維醋膜 各擠壓4次得到微乳光澄清透明溶液。
[0034] 馬爾文粒度分析儀檢測脂質(zhì)體粒徑，平均粒徑應(yīng)在200nm±，粒徑分散指數(shù)PDI值 應(yīng)《0. 25,和zata電位為正電荷。
[003引實施例2含冊N1型血凝素抗原50 μ g/ml，D0TAP3000 μ g/ml的陽離子脂質(zhì)體佐劑 疫苗的制備。
[0036] 將冊N1型流感裂解疫苗原液用含30mM氯化鋼的5%葡萄糖溶液稀釋至血凝素抗 原 50 μ g/ml。
[0037] 準確稱取D0TAP30mg至茄型瓶中，加入甲醇、氯仿各2ml，充分溶解后，在30°C， 3化pm條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2小時，至有機溶劑完全揮發(fā)，D0TAP在瓶底形成均勻的脂膜。 [003引加入10ml含冊N1型血凝素抗原50 μ g/ml的稀釋后的冊N1型流感裂解疫苗原液， 30°C，6化pm旋轉(zhuǎn)茄型瓶2小時，使脂膜與抗原溶液充分融合。
[0039] 將復水后的脂質(zhì)體抗原溶液分別通過800皿、400皿、200皿孔徑的碳酸纖維醋膜 各擠壓4次得到微乳光澄清透明溶液。
[0040] 馬爾文粒度分析儀檢測脂質(zhì)體粒徑，平均粒徑應(yīng)在200nm±，粒徑分散指數(shù)PDI值 應(yīng)《0. 25,和zata電位為正電荷。
[0041] 實施例3冊N1型流感陽離子脂質(zhì)體佐劑疫苗與其它佐劑疫苗的免疫原性比較。 [004引將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為D0TAP陽離子脂質(zhì)體流感疫苗組 (D0TAP300 yg/只）、裂解疫苗組、裂解疫苗加侶佐劑組（A1 500 yg/只）、裂解疫苗加 CPG-0DN佐劑組（CPG-0DN10 μ g/只）、PBS空白對照組。W 0. 1，1，10 μ g/只HA作為免疫劑 量，每個劑量10只小鼠，于0, 21天皮下注射，0, 21，42天采血分離血清，血凝抑制實驗化I) 檢測各組免疫后21，42天小鼠血清血凝抑制抗體水平，ELISA法檢測各組42天血清總IgG 抗體、亞型抗體（IgGl，IgG2a)水平。將各組幾何平均滴度取對數(shù)后進行組與組之間雙側(cè)t 檢驗，W P<0. 05作為有統(tǒng)計學差異標準。
[0043] 表1冊N1型流感陽離子脂質(zhì)體佐劑疫苗與其它佐劑疫苗的免疫原性比較的實驗 分組
[0044]
[0045] 表2免疫后21天各實驗組血凝抑制抗體的幾何平均滴度
[0046]
[0047]
[0048] 表3加強免疫后21天（42天）各實驗組血凝抑制抗體的幾何平均滴度
[0049]
[0050] 表4加強免疫后21天（42天）各實驗組血凝抑制抗體的幾何平均滴度的統(tǒng)計分 析（*表示有統(tǒng)計學差異，P<〇. 05)
[0051]
[0052] 表5加強免疫后21天（42天）各實驗組血清抗體保護率比較
[0053]
[0054]
[00巧]表6加強免疫后21天（42天）各實驗組總IgG抗體的幾何平均滴度
[0056]
[0057] 表7加強免疫后21天（42天）各實驗組總IgG抗體的幾何平均滴度的統(tǒng)計分析 (*表示有統(tǒng)計學差異，P<〇. 05)
[0058]
[0059] 表8加強免疫后21天（42天）各實驗組亞型抗體IgGl的幾何平均滴度
[0060]
[0061] 表9加強免疫后21天（42天）各實驗組亞型抗體IgGl的幾何平均滴度的統(tǒng)計分 析（*表示有統(tǒng)計學差異，P<〇. 05)
[0062]
[0063]

[0064] 表10加強免疫后21天（42天）各實驗組亞型抗體IgG2a的幾何平均滴度
[0065]
[0066] 表11加強免疫后21天（42天）各實驗組亞型抗體IgG2a的幾何平均滴度的統(tǒng)計 分析（*表示有統(tǒng)計學差異，P<〇. 05)
[0067]
[0068] 血凝抑制實驗化I)檢測結(jié)果顯示，各組初次免疫后21天血凝抑制抗體水平均較 低，加強免疫后21天血凝抑制抗體水平大幅升高（圖1，2, 3)。W加強免疫后21天血凝抑制 抗體水平進行比較，D0TAP陽離子脂質(zhì)體流感疫苗組在低、中、高劑量組其血凝抑制抗體滴 度均明顯高于裂解苗組，其中在中、高劑量組有顯著性差異（P<〇. 05) ;D0TAP陽離子脂質(zhì)體 流感疫苗與侶佐劑在不同劑量組均無明顯性差異（P〉〇. 05)，和CpG-ODN佐劑相比中、高劑 量組無顯著性差異（P〉〇. 05)，低劑量組明顯低于CpG-ODN佐劑組（P<0. 05)(見表2 - 4)血 凝抑制抗體是流感疫苗接種后誘導機體產(chǎn)生的保護性抗體，一般認為，血凝抑制抗體滴度 達到1 :40 W上就有免疫保護作用。W加強免疫后21天各組之間血清抗體保護率的比較發(fā) 現(xiàn)，D0TAP陽離子脂質(zhì)體組保護率在中、低劑量組要高于侶佐劑（圖4)。從W上結(jié)果可W看 出，DOTAP陽離子脂質(zhì)體具有明顯的佐劑效應(yīng)，并且其誘導流感疫苗中和抗體的能力明顯不 低于甚至優(yōu)于傳統(tǒng)侶佐劑，在中、高劑量組也不低于目前已廣泛應(yīng)用的核酸佐劑CPG-0DN。
[0069] 42天各組血清總IgG抗體的水平檢測結(jié)果顯示，D0TAP陽離子脂質(zhì)體組42天總抗 體水平在低、中、高劑量組均顯著性高于裂解疫苗組（P<〇. 05);在中、高劑量組均高于侶佐 劑和CpG-ODN佐劑，其中在高劑量組與侶佐劑和CpG-ODN佐劑相比有顯著性差異（P<0. 05); 在低劑量組低于侶佐劑和CpG-ODN佐劑，其中與CpG-ODN佐劑組有顯著性差異（P<0. 05)。 (見表6 - 7)運一結(jié)果與血凝抑制抗體檢測的結(jié)果基本一致。進一步表明了 D0TAP陽離子 脂質(zhì)體良好的佐劑效果。
[0070] 不同類型的佐劑在協(xié)助抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答過程中，可刺激抗原提呈細胞釋放不同 類型的細胞因子誘導化細胞分化為Thl或Th2型細胞，Thl細胞通過釋放Thl型細胞因子 IFN-丫、TNF- β等誘導免疫應(yīng)答傾向細胞免疫應(yīng)答，同時誘導產(chǎn)生IgG2a亞型抗體（在小 鼠體內(nèi)）；而Th2型細胞通過釋放Th2型細胞因子IL - 10、IL - 4等誘導免疫應(yīng)答傾向體 液免疫應(yīng)答，并誘導產(chǎn)生IgGl亞型抗體（在小鼠體內(nèi)）。因此我們比較了 D0TAP佐劑組與 其它組別免疫后42天血清亞型抗體的差異。結(jié)果顯示，D0TAP佐劑流感疫苗產(chǎn)生的抗體主 要為高滴度的IgGl型抗體，但IgG2a型抗體水平在低、中、高劑量組均顯著性高于裂解疫苗 組（P<0. 05)在中、高劑量組高于侶佐劑組，其中在高劑量組顯著性高于侶佐劑（P<0. 05); CPG-ODN佐劑作為一個常用的細胞免疫刺激劑，我們的研究發(fā)現(xiàn)其誘導產(chǎn)生的IgG2a型抗 體水平在低、高劑量組要顯著性明顯高于D0TAP佐劑（P<0. 05);侶佐劑通常不能誘導細胞 免疫，我們的研究發(fā)現(xiàn)，侶佐劑流感疫苗免疫后，產(chǎn)生了高滴度的IgGl型抗體，但IgG2a型 抗體水平較低（見表8-11)。
[0071] 實施例4比較不同劑量D0TAP作為冊N1型流感病毒裂解疫苗佐劑的免疫效果差 異。
[0072] 將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為3組，每組10只，于0,21天分別免疫含低、 中、高劑量D0TAP的陽離子脂質(zhì)體流感疫苗，D0TAP佐劑劑量分別為100 μ g/只、300 μ g/ 只、600 μ g/只，抗原劑量為2 μ gHA/只。0, 21，42天采血分離血清，血凝抑制實驗檢測不同 D0TAP劑量組免疫后42天小鼠血清血凝抑制抗體化I)水平；ELISA法檢測各組血清21天、 42天總IgG抗體水平。將各劑量組幾何平均滴度取對數(shù)后進行組與組之間雙側(cè)t檢驗，W P<〇. 05作為有統(tǒng)計學差異標準。
[0073] 結(jié)果顯示，免疫后21天、42天小鼠血清總抗體水平和42天的血凝抑制抗體水平在 D0TAP低、中、高劑量組之間存在明顯的量效關(guān)系。除42天總抗體水平300 μ g組和600 μ g 組之間無顯著性差異（P〉〇. 05)外，其余各組抗體水平和血凝抑制抗體水平水平在不同劑 量之間均存在顯著性差異（P<〇. 05)。（見表12 - 16) W上結(jié)果進一步表明D0TAP的佐劑 效應(yīng)不僅僅是通過D0TAP陽離子脂質(zhì)體對抗原包裝后，促進了抗原提呈細胞對抗原的攝取 和提呈，D0TAP本身具有對抗原提呈細胞的活化能力，而運種活化能力存在運一定的量效關(guān) 系。
[0074] 表12不同劑量D0TAP佐劑冊N1型流感病毒裂解疫苗免疫后總IgG抗體幾何平均 滴度
[00 巧]
[0076] 表13不同劑量DOTAP佐劑冊N1型流感病毒裂解疫苗免疫21天后總IgG抗體幾 何平均滴度統(tǒng)計分析（*表示有統(tǒng)計學差異，P<〇. 05)
[0077]
[0078] 表14不同劑量DOTAP佐劑冊N1型流感病毒裂解疫苗加強免疫后21天（42天） 總IgG抗體幾何平均滴度統(tǒng)計分析（*表示有統(tǒng)計學差異，P<0. 05)
[0079]
[0080] 表15不同劑量DOTAP佐劑冊N1型流感病毒裂解疫苗加強免疫后21天（42天） 血凝抑制抗體幾何平均滴度
[0081]
[0082]
[0083] 表16不同劑量DOTAP佐劑冊N1型流感病毒裂解疫苗加強免疫后21天（42天） 血凝抑制抗體幾何平均滴度統(tǒng)計分析（*表示有統(tǒng)計學差異，P<〇. 05)
[0084]
[0085] 比較DOTAP陽離子脂質(zhì)體流感疫苗與冊N1型流感全病毒疫苗、裂解疫苗、侶佐劑 裂解疫苗、CPG-0DN佐劑裂解疫苗免疫后小鼠脾臟淋己細胞細胞因子分泌的差異。
[008引將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為D0TAP陽離子脂質(zhì)體流感疫苗組、冊N1型流 感全病毒疫苗組、裂解疫苗組、侶佐劑裂解疫苗組、CPG-0DN佐劑裂解疫苗組，W 2 μ g HA作 為免疫劑量，每組5只，于0, 21天皮下注射免疫小鼠，于初次免疫后42天取小鼠脾臟單個 核細胞體外培養(yǎng)，抗原刺激后，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-2、比-4、IL - 10、IFN - 丫水 平。
[0087] 實施例5小鼠脾臟淋己細胞體外抗原刺激和細胞因子檢測
[0088] 無菌取小鼠脾臟，剪碎后研磨，并用100目的尼龍網(wǎng)過濾，將細胞懸液置于5ml 淋己細胞分離液上層，150化pm，20分鐘速度區(qū)帶離屯、，取中間層單個核細胞，0. 01M PBS， 2000巧m，10分鐘離屯、洗2次，細胞計數(shù)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將細胞懸 液稀釋到2 X 1〇6個活細胞/ml后，加入96孔細胞板，0. 1ml/孔，補加1640培養(yǎng)基100 μ 1， 同時加入冊Ν1裂解疫苗原液1 μg/ml ;37°C，5% C〇2培養(yǎng)72小時，收上清，采用細胞因子 ELISA檢測試劑盒進行檢測，檢測方法按試劑盒說明書要求進行。
[0089] 表17不同實驗組小鼠脾臟淋己細胞細胞因子分泌的差異
[0090]
[0091]
[0092] 免疫后小鼠脾臟淋己細胞體外經(jīng)抗原刺激后細胞因子檢測的結(jié)果顯示，所有實驗 組均分泌高水平的IL-2提示脾臟淋己細胞中存在抗原特異性淋己細胞。D0TAP陽離子脂質(zhì) 體流感疫苗組既分泌高水平的Thl型細胞因子IFN-T，同時也分泌一定水平的證2型細胞 因子IL-4 ;侶佐劑組僅分泌較高水平的化2型細胞因子IL-4,幾乎不分泌化1型細胞因子 IFN- 丫；CPG-0DN佐劑組IFN- 丫水平較高，但化2型細胞因子IL-4分泌水平較低。W上結(jié) 果進一步提示D0TAP脂質(zhì)體佐劑即可誘導流感疫苗產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，又可誘導細胞免疫 應(yīng)答，而侶佐劑僅能誘導體液免疫應(yīng)答，CPG-ODN佐劑誘導的細胞免疫應(yīng)答較強。沒有加任 何佐劑的裂解疫苗IFN- 丫、IL-4水平均很低，提示在沒有佐劑的情況下，其免疫應(yīng)答強度 較低，運與前面抗體水平的檢測結(jié)果是一致的。
[0093] 脂質(zhì)體化iposomes)是由脂質(zhì)雙分子層組成的內(nèi)部為水相的閉合囊泡型球型微 粒。1965年由Ban曲am首次發(fā)現(xiàn)并命名[1]，1971年Ryman將其用作藥物載體，可作為小分 子藥物、多膚、核酸W及蛋白質(zhì)分子的運載系統(tǒng)，脂質(zhì)體在體內(nèi)能迅速被祀細胞所捕獲，具 有高效祀向性，同時具有緩釋效應(yīng)巧]。目前聚乙二醇化脂質(zhì)體和與抗體結(jié)合的免疫脂質(zhì)體 已廣泛應(yīng)用于腫瘤的祀向治療。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，部分脂質(zhì)體顆粒還具有刺激機體免疫 應(yīng)答的作用。D0TAP化3-二油氧基丙基Ξ甲基氯化錠）是目前較為常用的一類陽離子脂質(zhì) 體，它是一個季胺鹽化合物，由兩條不飽和脂肪酸通過脂鍵相連構(gòu)成，含季胺基團和脂鍵的 部分為其親水端，兩條不飽和脂肪酸為其疏水端。長期W來，D0TAP -直被用作一種DNA體 外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)染試劑。然而正是在D0TAP被用作DNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染的過程中，人們發(fā)現(xiàn)，D0TAP 脂質(zhì)體實際上是一種很好的免疫佐劑，它可增強體液免疫應(yīng)答，同時誘導更強的Thl細胞 免疫應(yīng)答，研究表明，D0TAP脂質(zhì)體可能并不通過核因子NF- K B途徑激活樹突狀細胞，而是 通過啟動MAPK (胞外信號調(diào)控激酶和P38)途徑激活樹突狀細胞，導致樹突狀細胞高表達協(xié) 同刺激分子CD80XD83和CD86,從而誘導CD4+Thl細胞和CD 8+T細胞的免疫應(yīng)答巧]。由 于避開了核因子NF- K B途徑激活，D0TAP脂質(zhì)體作為疫苗佐劑，免疫后產(chǎn)生更少的炎癥因 子]X-l、TNF-a等，因而免疫副反應(yīng)更小。美國PDS Biotechnology公司將Merc陸prova 公司專有的手性脂質(zhì)D0TAP化loride包裹HPV相關(guān)多膚抗原制備的納米脂質(zhì)體疫苗，用于 人類乳頭瘤病毒引起的宮頸癌等相關(guān)疾病的治療，臨床前研究結(jié)果顯示該治療性疫苗可明 顯提高抗原特異性的CD8+T細胞的細胞免疫功能，抑瘤效果明顯，并且安全性良好[4]。該 藥物已進入I期臨床研究。但目前D0TAP作為預防用疫苗佐劑研究的報道還較少。
[0094] 本研究W重組乙肝疫苗作為實驗抗原，意在探討了 D0TAP對預防用蛋白質(zhì)類疫苗 的免疫增強效果。在本研究中，我們選擇了傳統(tǒng)的侶佐劑和CpG-ODN核酸佐劑作為對照佐 劑，初步比較了 D0TAP作為乙肝疫苗佐劑與傳統(tǒng)佐劑對乙肝疫苗體液免疫增強效果上的差 異。為進一步開發(fā)新型乙肝疫苗佐劑奠定了基礎(chǔ)。
[0095] 材料和方法
[009引抗原：重組乙肝表面抗原她SAg)從北京天壇生物股份有限公司購買。
[0097] 試劑D0TAP購置于加拿大TRC公司；侶佐劑購置于SIGM公司；核酸佐劑CPG - 0DN由上海生工合成；HRP標記羊抗鼠 IgG抗體，HRP標記羊抗鼠 IgGl亞型抗體、HRP標記羊 抗鼠 IgG2a亞型抗體購置于Biolegend公司；BCA法蛋白質(zhì)微量檢測試劑盒購置于化ermo 公司，畑E酶購置于SIGMA公司。
[009引實驗動物：6周齡SPF級雌性BABL/c小鼠武漢生物制品研究所有限責任公司實驗 動物室飼養(yǎng)。
[0099] 儀器設(shè)備：RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，馬爾文粒度分析儀，酶標檢測儀
[0100] 實施例6薄膜蒸發(fā)復水法制備D0TAP陽離子脂質(zhì)體乙肝疫苗
[010。 將D0TAP溶解于1 :1的甲醇和氯仿溶劑中，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2小時后，加入一定濃度 的重組乙肝表面抗原原液，30°C充分混合2小時后，通過一定孔徑的碳酸纖維膜多次擠壓 制備而成。馬爾文粒度分析儀檢測脂質(zhì)體粒徑和zata電位。
[01 0引實施例7 DOTAP陽離子脂質(zhì)體包封率檢測
[010引 W 40000g的離屯、力超速離心將脂質(zhì)體完全沉淀，用BCA法檢測上清中的游離抗 原的蛋白濃度，從而計算脂質(zhì)體包封率的檢測方法。計算公式為：包封率=[1-(上清中 抗原濃度X溶液體積）/(抗原給藥濃度X給藥體積）]X 100 %
[0104] 實施例8 SDS-PAGE電泳檢測
[010引將皿SAg原液、皿sAg脂質(zhì)體溶液、皿sAg脂質(zhì)體超速離屯、后沉淀、皿sAg脂質(zhì)體超 速離屯、后上清W及空白脂質(zhì)體樣品進行SDS-PAGE電泳，然后銀染，觀察皿SAg在各組分中 的分布。
[0106] 實施例9投射電鏡檢測
[0107] 用憐鶴酸負染法制備化sAg陽離子脂質(zhì)體電鏡樣品，將制備好的負染色樣品置于 220kV透射電鏡觀察室，抽真空，觀察脂質(zhì)體并照相。
[0108] 實施例10動物免疫
[0109] 將BALB/c小鼠隨機分為D0TAP陽離子脂質(zhì)體乙肝疫苗組、不加佐劑的乙肝疫苗 組、乙肝疫苗加侶佐劑組、乙肝疫苗加 CPG-0DN佐劑組W及PBS組作為對照，W 0. 2 μ g/ 只，2 μ g/只重組乙肝表面抗原作為免疫劑量，每個劑量10只小鼠，于0, 28天肌肉免疫， 0,14, 28,42天采血分離血清，ELISA法檢測各組血清抗皿S特異性IgG抗體、亞型抗體 (IgGl, IgG2a)滴度。
[0110] 表18. DOTAP陽離子脂質(zhì)乙肝疫苗與其它對照佐劑乙肝疫苗免疫原性比較的實驗 分組
[0111]
[0112] 實施例11小鼠血清IgG抗體、IgGl, IgG2a亞型抗體水平檢測
[0113] W lμg/ml的重組乙肝表面抗原包被酶標板，0. 1ml/孔，4°C過夜；加入1%的 BSA，150 μ 1/孔，37°C封閉4小時；加入系列對倍稀釋的血清，0. 1ml/孔，37°C溫育1小時； PBST洗涂5次，加入工作濃度的羊抗鼠 IgG-HRP或羊抗鼠 IgGl，2a-HRP。0. 1ml/孔，37°C溫 育1小時，PBST洗涂5次，加入底物A、B液，各50 μ 1/孔，37°C溫育10分鐘；加入2mol/ IH2SO4, 50 μ 1/孔，經(jīng)酶標儀檢測A450吸光值，W吸光值〉0. 1的血清最高稀釋度作為血清 抗體滴度。
[0114] 1. 5. 7統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 19軟件進行統(tǒng)計分析，將抗體滴度進行對數(shù)處理后，采 用組間單樣本雙測學生t檢驗，w P<0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。
[011引實驗結(jié)果
[0116] 1通過薄膜蒸發(fā)復水法制備的含D0TAP陽離子脂質(zhì)體乙肝疫苗呈乳白色膠體狀， 粒徑分布均勻，集中度好，脂質(zhì)體帶正電荷，W 2 μ g/ml和20 μ g/ml抗原濃度制備的脂質(zhì)體 包封率均達到50% W上。（見表19)。
[0117] 表19. 1000 μ g/mlDOTAP條件下，不同濃度的皿SAg陽離子脂質(zhì)體的物理特征。 [011 引
[0119] 2 SDS-PAGE電泳后銀染結(jié)果顯示（圖12)，通過超速離屯、可將皿SAg陽離子脂質(zhì) 體完全沉淀，皿SAg主要分布在脂質(zhì)體沉淀中，上清中抗原明顯較少。W上結(jié)果提示皿SAg 陽離子脂質(zhì)體疫苗有較高的包封率，大部分抗原都包裹在了陽離子脂質(zhì)體中，游離抗原相 對較少。
[0120] 3透射電鏡檢測的結(jié)果顯示，皿SAg陽離子脂質(zhì)體呈圓形，外表光滑，粒徑在皿（見 圖 14)。
[0121] 4動物免疫后血清學檢測結(jié)果顯示，各實驗組在初次免疫后12天和28天抗皿S IgG抗體均維持在較低的水平，但D0TAP陽離子脂質(zhì)體佐劑組和其它對照佐劑組均明顯高 于不加佐劑的皿S組，加強免疫后14天（42天）各實驗組抗體水平均顯著性升高，W 42天 各實驗組抗體幾何平均滴度進行比較顯示，D0TAP陽離子脂質(zhì)體佐劑組在0. 2 μ g和2 μ g 劑量組均高于皿S組，其中2 μ g劑量組有顯著性差異（P<0. 05)，DOTAP陽離子脂質(zhì)體佐 劑0. 2 μ g劑量組IgG抗體幾何平均滴度與皿S組2 μ g劑量組相當；D0TAP陽離子脂質(zhì)體 佐劑組在0. 2 μ g和2 μ g劑量組與侶佐劑組均無顯著性差異（P〉0. 05)，在2 μ g劑量組與 CPG-0DN佐劑組無顯著性差異（P〉0. 05)，但在0. 2 μ g劑量組要顯著性低于CPG-0DN佐劑組 (P<0. 05)(見表 19,20)。
[0122] 表20.不同實驗組在初次免疫后14, 21，42天皿S IgG抗體的幾何平均滴度。
[0123]
[0124] 表21.不同實驗組在初次免疫后42天皿S IgG抗體的幾何平均滴度的統(tǒng)計學分 析（*表示有統(tǒng)計學差異，P<〇. 05)。
[0125]
[0126] 免疫后42天的血清亞型抗體IgGl、IgG2a檢測結(jié)果顯示，DOTAP佐劑皿sAg疫苗 可同時產(chǎn)生高滴度的IgGl型和IgG2a抗體。D0TAP佐劑皿sAg疫苗產(chǎn)生的IgGl型抗體滴 度與侶佐劑相當，沒有顯著性差異（P〉〇. 05)，但是IgG2a型抗體滴度明顯高于侶佐劑，低、 高劑量組都有顯著性差異（P<〇. 05) ;D0TAP佐劑皿sAg疫苗產(chǎn)生的IgGl型、IgG2a型抗體 滴度略低于CpG-ODN-HBsAg疫苗，但均無顯著性差異（P〉0. 05 ;D0TAP佐劑皿sAg疫苗產(chǎn)生 的IgGl型、IgG2a型抗體滴度相對于單獨使用皿sAg，有大幅的提高，除低劑量IgGl型抗體 夕1>，都具有顯著性差異任<〇.〇5)。
[0127] 表22.不同實驗組在初次免疫后42天皿S亞型抗體IgGl、IgG2a的幾何平均滴度 [012 引
[0129] 表23.不同實驗組在初次免疫后42天皿S亞型抗體IgGl、IgG2a幾何平均滴度的 統(tǒng)計學分析（*表示有統(tǒng)計學差異，P<〇. 05)。
[0130]
[0131] 討論
[0132] 本研究W重組乙肝疫苗作為實驗抗原，探討了陽離子脂質(zhì)體D0TAP作為蛋白質(zhì)疫 苗佐劑的免疫增強效果。在實驗中我們選取了傳統(tǒng)的侶佐劑和核酸佐劑CPG-0DN作為對照 佐劑。侶佐劑是目前乙肝疫苗所使用的佐劑，其安全性和有效性得到了公認，成為人用疫苗 中使用最廣泛的一種佐劑。但侶佐劑存在的最大的缺點在于只能誘導產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答， 不能誘導產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答，還可誘導產(chǎn)生I姐抗體，增加了發(fā)生超敏反應(yīng)的危險[5]。與 侶佐劑進行比較，主要在于評估陽離子脂質(zhì)體D0TAP作為蛋白質(zhì)疫苗佐劑對體液免疫應(yīng)答 的增強作用。核酸佐劑CPG-ODN是目前一種常用的細胞免疫刺激劑，具有較強的Thl細胞 的激活能力[6]。與核酸佐劑CPG-0DN進行比較意在評估離子脂質(zhì)體D0TAP作為蛋白質(zhì)疫 苗佐劑潛在的誘導細胞免疫應(yīng)答的能力。
[0133] 在小鼠免疫后的血清學研究中我們對不同實驗組特異性IgG抗體和IgG亞型抗體 IgGl和IgG2a進行了檢測。檢測特異性IgG抗體水平在于比較D0TAP與其它佐劑對體液免 疫應(yīng)答增強作用的差異。我們的研究發(fā)現(xiàn)，D0TAP確實具有很好的體液免疫應(yīng)答增強作用， 其對體液免疫應(yīng)答的增強作用明顯不劣于侶佐劑和CPG-0DN佐劑，僅在低劑量組免疫后42 天低于CPG-0DN佐劑。
[0134] 不同類型的佐劑在協(xié)助抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答過程中，可刺激抗原提呈細胞釋放不同 類型的細胞因子，誘導化細胞分化為Thl或Th2型細胞，Thl細胞通過釋放Thl型細胞因 子IFN-丫、TNF- β等誘導免疫應(yīng)答傾向細胞免疫應(yīng)答，同時誘導產(chǎn)生IgG2a亞型抗體（在 小鼠體內(nèi)）；而化2型細胞通過釋放化2型細胞因子IL - 4、IL - 10等誘導免疫應(yīng)答傾向 體液免疫應(yīng)答，并誘導產(chǎn)生IgGl亞型抗體（在小鼠體內(nèi)），因此，血清中IgGl和IgG2a亞 型抗體水平的差異可在一定程度上反應(yīng)出免疫應(yīng)答類型的差異[7]。我們對免疫后小鼠血 清中IgG亞型抗體IgGl和IgG2a檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D0TAP佐劑乙肝疫苗可同時產(chǎn)生高滴度的 IgGl型和IgG2a抗體。特別是IgGl型抗體的水平與CPG-0DN佐劑相比無顯著性差異，而侶 佐劑乙肝疫苗僅產(chǎn)生了高度的IgG2a型抗體，IgGl型抗體水平顯著性低于D0TAP佐劑。運 一結(jié)果說明D0TAP佐劑可能與CPG-0DN佐劑一樣，具有較強的細胞免疫刺激作用。我們在 另外一個D0TAP佐劑流感病毒裂解疫苗的研究中，對免疫后小鼠脾臟淋己細胞的細胞因子 譜進行了檢測，發(fā)現(xiàn)D0TAP佐劑組小鼠既高表達Thl型細胞因子IFN-丫，也高表達Th2型細 胞因子IL - 4、IL - 10,運和我們W上的結(jié)果是一致的。
[0135] 綜上所述，D0TAP陽離子脂質(zhì)體可能是一種很好的疫苗佐劑，其克服了侶佐劑只能 誘導體液免疫應(yīng)答，不能誘導細胞免疫應(yīng)答的缺點，而且其對體液免疫應(yīng)答的增強作用不 劣于侶佐劑。
【主權(quán)項】
1. 一種疫苗，其特征在于，所述疫苗包含由2, 3-二油氧基丙基三甲基氯化銨（DOTAP) 制成的作為佐劑的陽離子脂質(zhì)體和單價或多價的蛋白質(zhì)抗原，優(yōu)選地，所述陽離子脂質(zhì)體 由作為陽離子脂質(zhì)的2, 3-二油氧基丙基三甲基氯化銨組成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述單價或多價的蛋白質(zhì)抗原為裂解疫 苗原液，優(yōu)選為流感裂解疫苗原液或重組乙肝表面抗原，更優(yōu)選為H5N1流感裂解疫苗原 液、H5N2流感裂解疫苗原液、H7N2流感裂解疫苗原液、H7N3流感裂解疫苗原液、H7N7流感 裂解疫苗原液、H9N2流感裂解疫苗原液、H10N7流感裂解疫苗原液和H7N9流感裂解疫苗原 液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項所述的疫苗，其特征在于，所述2, 3-二油氧基丙基三甲基 氯化銨為2, 3-二油氧基丙基三甲基氯化銨的旋光異構(gòu)體，優(yōu)選R-2, 3-二油氧基丙基三甲 基氯化銨。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的疫苗，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)體和蛋白質(zhì)抗 原的比例為1000:1-10:1，優(yōu)選為50:1-500:1，更優(yōu)選為300:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的疫苗，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)體僅包含 2, 3-二油氧基丙基三甲基氯化銨，而不包含其他脂質(zhì)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的疫苗，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)體還包含其他 脂質(zhì)，優(yōu)選包含膽固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)等中性脂質(zhì)，更優(yōu)選為二油酰基磷 脂酰乙醇胺（DOPE)，優(yōu)先比例為DOTAP :D0PE 2:1-10:1。7. -種根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述疫苗的制備方法，將DOTAP溶解于1 :1的甲醇和 氯仿溶劑中，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成脂膜，加入蛋白質(zhì)抗原，25-36Γ充分混合0.5-5小時后，分 別通過800nm、400nm、200nm孔徑的碳酸纖維酯膜進行4次擠壓。8. -種根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述疫苗在治療和預防流感和/或乙肝的藥劑中的用 途。9. 一種包含DOTAP或由DOTAP組成的陽離子脂質(zhì)體在誘導細胞免疫應(yīng)答的藥物中的用 途。
【文檔編號】A61K39/29GK105920599SQ201510599234
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年9月17日
【發(fā)明人】喻剛, 趙巍, 郝鵬亮, 韓錫鑫, 韓靜, 劉洋, 張家友, 楊曉明
【申請人】武漢生物制品研究所有限責任公司