含有天然薯蕷甾醇的陽離子脂質(zhì)體、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及合成脂質(zhì)體基因輸送功能載體材料領(lǐng)域，特別涉及一種含有天然薯蕷 甾醇的陽離子脂質(zhì)體、制備方法及其作為小分子干擾基因 Bcl-2SiRNA轉(zhuǎn)染試劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，基于小分子干擾RNA(SiRNA)技術(shù)的基因治療方法引起了人們的極大興 趣。由于SiRNA可直接在胞漿內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，具有起效快速且給藥的時間間隔靈活可控的優(yōu) 點(diǎn)。因此，通過SiRNA輸送進(jìn)行基因治療相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，該技術(shù)可 單獨(dú)使用或與其它治療手段聯(lián)用以治療系列基因缺陷型疾病，如遺傳型疾病、病毒感染性 疾病、以及腫瘤等。在腫瘤治療方面，近來研宄較多的小分子干擾RNA為Bcl-2 SiRNA (正 義鏈 GUA CAU CCA UUA UAA GCU Gdtdt，反義鏈 CAG CUU AUA AUG GAU GUA Cdtdt)，其可以 通過抑制bcl-2抗凋亡基因的表達(dá)有效抑制Bcl-2蛋白的合成，從而恢復(fù)細(xì)胞的正常凋亡 調(diào)控能力，最終達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。實現(xiàn)SiRNA輸送基因治療的關(guān)鍵在于以下兩個 方面：其一為SiRNA基因序列的選擇，其須對靶mRNA基因產(chǎn)生高度序列特異性的結(jié)合；其 二是SiRNA須在遞送過程中保持穩(wěn)定，不被體液、細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)中的酶降解，亦須避免其與 環(huán)境中的生物活性物種產(chǎn)生特異性的結(jié)合。因此，目前作為SiRNA基因輸送的載體大多為 合成陽離子有機(jī)功能分子、高分子，其實現(xiàn)基因負(fù)載與輸送的原理為利用載體陽離子功能 分子、高分子中質(zhì)子化氨基官能團(tuán)的正電荷（+)與SiRNA基因序列中磷酸基團(tuán)所攜帶的負(fù) 電荷（_)的靜電相互作用，結(jié)合組裝形成穩(wěn)定的聚集體納米復(fù)合物粒子（Polyplex)，保護(hù) 所負(fù)載的SiRNA不易被細(xì)胞內(nèi)外的核酸酶降解，同時可提高聚集復(fù)合體粒子在體內(nèi)的穩(wěn)定 性，從而實現(xiàn)提高SiRNA基因轉(zhuǎn)染的效率。上述因素使SiRNA基因高效輸送的相關(guān)功能載 體材料的研宄成為生命科學(xué)和材料科學(xué)交叉領(lǐng)域最為活躍的研宄方向之一。
[0003] 然而，到目前為止，雖然國內(nèi)外已經(jīng)開發(fā)報道了多種陽離子功能分子如陽離子聚 合物、陽離子脂質(zhì)體等，并作為載體應(yīng)用于體外或體內(nèi)細(xì)胞/組織水平的SiRNA輸送與轉(zhuǎn)染 研宄，但在實際應(yīng)用中，大多數(shù)脂質(zhì)陽離子功能分子在血液循環(huán)中不穩(wěn)定，容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮 系統(tǒng)吞噬后清除而導(dǎo)致其失活。且許多陽離子載體具有免疫原性，可刺激、誘導(dǎo)細(xì)胞的免疫 應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致毒副作用。以上這些因素限制了陽離子功能分子在SiRNA基因治療中 的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，如何改善合成基因載體的生物相容性、減低毒性及增強(qiáng)SiRNA基因的 轉(zhuǎn)染效果，具有重要的研宄和實用價值。
[0004] 近年來，人們發(fā)現(xiàn)，研宄采用具有生物相容性的脂質(zhì)化合物構(gòu)建新型陽離子生物 載體成為合成功能脂質(zhì)分子研宄開發(fā)應(yīng)用的重要方向之一。許多具有重要生理活性的天 然甾體化合物，具有較強(qiáng)的疏水性和良好的生物相容性，可合成制備新型脂質(zhì)陽離子有機(jī) 功能分子，降低合成脂質(zhì)陽離子的細(xì)胞毒性，有可能應(yīng)用作為新型生物相容性基因載體。近 年來，國內(nèi)外合成報道了多種由天然留體衍生的陽離子脂質(zhì)，如膽固醇陽離子氨基脂質(zhì)，膽 固醇陽離子多肽（Int. J. Pharm. 2014, 468, 83, J. Control. Release, 2013, 172, 159, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 3837)等，它們表現(xiàn)出了良好的藥物和基因負(fù)載、可控緩釋以及 基因輸送與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效果（Mol. Pharm. 2012, 9, 3579)。在此基礎(chǔ)上，人們又繼續(xù)合成 了其它天然留體衍生的陽離子脂質(zhì)，以圖發(fā)展更為有效可控的基因輸送載體體系。在相 關(guān)前期的工作中，申請者發(fā)明了系列基于二硫鍵的膽固醇脂質(zhì)基因載體（Biomaterials 2011，11,3507 ;中國專利：ZL201010182428. 4)，發(fā)現(xiàn)二硫化學(xué)鍵的引入對降低合成脂質(zhì)載 體的細(xì)胞毒性具有重要作用。進(jìn)一步制備了系列基于天然生物相容性膽固醇的類脂質(zhì)陽離 子有機(jī)功能分子作為基因轉(zhuǎn)染試劑（中國專利申請?zhí)?01110040189. 3)應(yīng)用于質(zhì)粒DNA的 高效細(xì)胞轉(zhuǎn)染。隨后發(fā)展了系列精氨酸修飾的動物固醇陽離子脂質(zhì)體其表現(xiàn)出了非常高的 DNA轉(zhuǎn)染效率（中國專利申請?zhí)?01410060042. 4)。然而，上述作為基因輸送載體的合成甾 體類脂質(zhì)大多集中應(yīng)用于質(zhì)粒DNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面，用于SiRNA轉(zhuǎn)染的甾體類脂質(zhì)還較少。 因此，研宄和開發(fā)生物相容性好、轉(zhuǎn)染效率高的留體類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子，進(jìn)一步拓 展其作為小分子干擾SiRNA功能載體的應(yīng)用，對于開發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的生物功能 載體材料具有重要意義，其也是本發(fā)明所致力解決的目標(biāo)。
[0005] 發(fā)明的內(nèi)容
[0006] 本發(fā)明的目的之一是提供一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體。
[0007] 本發(fā)明的目的之二是提供上述一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體的制備方 法。
[0008] 本發(fā)明的目的之三是提供一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體作為SiRNA基 因輸送載體功能材料的用途。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明所提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體，其由下列兩組分構(gòu) 成：
[0010]
[0011] 其中，天然薯蕷留醇精氨酸陽離子脂質(zhì)（Dios-Arg)和輔助脂質(zhì)二油酰磷脂酰乙 醇胺（DOPE)的摩爾比為1:0.1~5.0,優(yōu)先摩爾比為1:0. 5~2。
[0012] 本發(fā)明的上述含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體是一種50~500納米的陽離子 脂質(zhì)體，優(yōu)選為100~200納米的陽離子脂質(zhì)體。
[0013] 本發(fā)明的上述含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體具有10~50毫伏的表面電位， 優(yōu)選20~40暈伏的表面電位。
[0014] 依據(jù)本發(fā)明中所述的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體的制備方法，主要為 以下步驟：
[0015] 將一定配比的天然薯蕷留醇精氨酸陽離子脂質(zhì)Dios-Arg和輔助脂質(zhì)二油酰磷脂 酰乙醇胺DOPE溶于充分脫水干燥的色譜級有機(jī)溶劑中，隨后加入少量醇進(jìn)行增溶，在室 溫~90°C下蒸除去有機(jī)溶劑，如采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸除去有機(jī)溶劑，待瓶底形成一層均勻 的脂質(zhì)薄膜后；加入一定量的去離子水，超聲水化2~4h后得到一種含有天然薯蕷留醇的 陽離子脂質(zhì)體。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明中所提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體的制備方法中， 所述的天然薯蕷留醇精氨酸陽離子脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)二油酰磷脂酰乙醇胺的摩爾比為 1:0. 1~5. 0,優(yōu)先摩爾比為1:0. 5~2。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明中所提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體的制備方法中， 所述的天然薯蕷留醇精氨酸陽離子脂質(zhì)，有機(jī)溶劑，醇和去離子水的毫摩爾和體積比為 Immol :80 ~150ml :0· 5 ~2ml :80 ~120ml ;優(yōu)先選擇 lmmol :100ml :1ml :100ml。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明中所提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體的制備方法中，所 述的有機(jī)溶劑包括乙酸乙醋、四氫呋喃、1，4_二氧六環(huán)、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、乙腈、丙 酮或它們的混合有機(jī)溶劑。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明中所提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體的制備方法中，所 述的醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、正戊醇、異戊醇、叔戊醇或 它們的混合醇溶劑。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體，可以進(jìn)一步應(yīng) 用作為新型高效低毒的類脂質(zhì)SiRNA基因轉(zhuǎn)染試劑。與已有的相關(guān)報道相比（Mol. Pharmaceutics. 2008,5,128)以及本發(fā)明人先前的工作（Biomaterials2011, 11，3507 ;中 國專利申請?zhí)?01010182428. 4,201110040189. 3)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)：（1)本發(fā)明中所 提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體其組分之一 Dios-Arg來源于具有我國特色 的天然產(chǎn)物薯蕷留醇和天然精氨酸，易于大量規(guī)?；苽?。另一組分為商品化的二油酰磷 脂酰乙醇胺（DOPE)，原料易得。對比可知，采用上述系列脂質(zhì)體作為SiRNA基因載體，在人 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87中的基因轉(zhuǎn)染效率評價結(jié)果表明其具有較高的SiRNA轉(zhuǎn)染效率，可 開發(fā)作為新型高效低毒的類脂質(zhì)SiRNA基因轉(zhuǎn)染試劑得到應(yīng)用。
【附圖說明】
[0021] 圖1、本發(fā)明實施例1-3中所述的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質(zhì)體 Dios-DOPE 2/1、Dios-DOPE 1/1、Dios-DOPE 1/2 在人肺癌細(xì)胞 H1299 中的體外細(xì)胞毒性 評價。實驗對照組采用市售基因轉(zhuǎn)染試劑bPEI-25K，從圖中結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)依據(jù)該發(fā)明所 制備的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子及其脂質(zhì)體在相同質(zhì)量濃度下的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于參照