一種藥物組合物的新用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了含有下述重量配比的原料藥制備而成的藥物在制備治療酒精成癮或/和依賴的藥物中的用途：附子或烏頭3-10份,黃芪3-35份。本發(fā)明藥物組合物能有效的消除酒精成癮的心理與行為的“成癮記憶”，具有良好的戒除酒精成癮的作用，為臨床用藥提供了一種新的選擇。
【專利說明】一種藥物組合物的新用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物組合物的新用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 酒精成癮是一種失控性的飲酒行為，主要表現(xiàn)為對獲得酒精的強(qiáng)烈渴求，強(qiáng)迫性 地飲酒，并且發(fā)展為酒精耐受和酒精依賴。與其它成癮性藥物所致疾病一樣，酒精成癮的核 心特征是戒斷后仍長期存在的復(fù)飲行為。
[0003] 對于酒精依賴患者來說，如何消除酒精的"成癮記憶"是從根本上實現(xiàn)治療和成功 的關(guān)鍵，由于患者往往存在對酒精的強(qiáng)烈渴望以及中毒癥狀的隱蔽性，在臨床上要完全實 現(xiàn)戒酒是非常困難的。目前針對酒精成癮患者的治療主要以藥物治療為主，美國FDA批準(zhǔn) 上市的針對酒癮的藥物主要有戒酒硫、納曲酮和阿坎酸。這三種藥物在臨床使用中可能有 一定效果，但對于消除酒精成癮患者強(qiáng)烈的心理渴求、戒斷之后的復(fù)飲行為的發(fā)生并沒有 作用，并且戒酒硫臨床副作用大，納曲酮存在相關(guān)的肝損害、其確切的療效及機(jī)制仍需進(jìn)一 步研究?？偟膩碚f，西醫(yī)對于酒精成癮患者戒酒的治療并沒有取得理想的進(jìn)展。
[0004] 我國傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)，明確記載有使用中醫(yī)藥治療酒精性疾病的歷史至少上千年，形 成了一套自身完整的而又獨特的理論體系。認(rèn)為酒為外在的濕熱之邪，過量飲酒之后，首 先損及脾胃，而脾又喜燥而惡濕，故濕濁內(nèi)生從而阻滯中焦，脾土壅滯，近而肝絡(luò)不暢，體內(nèi) 氣、血、痰、瘀等病理產(chǎn)物與濕熱相互瘀結(jié)，隨著病情的發(fā)展最后累及腎臟，成為"頑疾"。并 且傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)自古就有中草藥能解酒毒、戒毒的文獻(xiàn)記載。如在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，就已記 載："葛根解諸毒"，唐·孫思邈《千金方》也有"葛根主解酒毒之說"，明代本草巨著《本草綱 目》中解酒藥的內(nèi)容非常豐富，書中記載了解酒藥約計100種，廣泛分布于礦物藥、動物藥、 植物藥之中，至清代隨著一系列有關(guān)戒毒的專著問世，中醫(yī)藥戒毒應(yīng)運而生至今已有200 多年的歷史，積累了寶貴的經(jīng)驗，創(chuàng)立了一系列中醫(yī)戒毒方法，包括單純中醫(yī)辨證戒斷方 藥，中醫(yī)辨證加鴉片遞減戒毒方藥，洋金花戒毒等，確立了扶正祛邪、滋陰助陽、補(bǔ)益臟 腑、祛除煙毒、調(diào)暢氣血等總的治療原則。加之，中草藥自身的高效、低毒、價廉、多靶點等優(yōu) 勢，因此，中醫(yī)藥治療酒精成癮具有一定的優(yōu)勢。
[0005] 附子，功能主治：回陽救逆，補(bǔ)火助陽，逐風(fēng)寒濕邪；黃芪的功能主治：補(bǔ)氣 固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌。目前已有將兩味藥物組合使用的報道，如申請?zhí)枺?200410013941. 5 ;發(fā)明名稱：一種治療心動過緩的中藥，一種治療心動過緩的中藥，由40? 60%的黃芪和附子為原料加工得到的口服制劑。本發(fā)明經(jīng)大鼠胺碘酮與心得安兩種慢性心 律模型的藥效學(xué)試驗證明，均可明顯升高這兩種模型心動過緩的心率。且長期服用安全、無 毒副作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了 一種藥物組合物的新用途。
[0007] 本發(fā)明提供了含有下述重量配比的原料藥在制備治療酒精成癮或/和依賴的藥 物中的用途：附子或烏頭3-10份，黃芪3-35份。
[0008] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的藥物是由下述重量配比的原料藥制備而成的制劑：
[0009] 附子或烏頭3-10份，黃芪3-35份。
[0010] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的原料藥重量配比為：附子或烏頭5-10份，黃芪10-35份。
[0011] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的原料藥重量配比為：附子或烏頭1〇份，黃芪35份。
[0012] 其中，所述的附子為生附子和/或制附子；所述的烏頭為川烏或草烏；所述的黃芪 為生黃芪和/或炙黃芪。
[0013] 所述的制劑是口服制劑。
[0014] 其中，所述的口服制劑是顆粒劑、散劑、丸劑、膠囊劑、軟膠囊劑、片劑或口服液。
[0015] 所述的藥物的制備方法包括如下步驟：
[0016] a、稱取原料藥；
[0017] b、將原料藥直接打粉，或加水煎煮，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備 成藥學(xué)上常用的制劑。
[0018] 所述的藥物是治療長期飲酒導(dǎo)致脾胃濕熱，日久濕從寒化，損傷陽氣，形成的脾腎 陽虛之證的藥物。
[0019] 為了消除酒精成癮患者對于酒精強(qiáng)烈的精神渴求與戒斷之后的高復(fù)飲率，本發(fā)明 采用國際公認(rèn)的研究藥物性成癮精神依賴的條件位置偏愛與行為依賴的行為敏化動物兩 種經(jīng)典的動物模型，提供一種藥效良好、低毒、多靶點、價廉的治療酒精成癮的理想藥物組 合物，及其制備方法和用途。
[0020] 目前己公認(rèn)"整體觀念"、"辨證施治"、"復(fù)方使用"、"復(fù)方配伍用藥如用兵"是中醫(yī) 最科學(xué)最有效的幾大優(yōu)勢，其中"復(fù)方配伍用藥如用兵"是菲?？茖W(xué)的中醫(yī)藥原創(chuàng)理論。中 醫(yī)組方中并藥如行兵布陣那樣環(huán)環(huán)相扣的嚴(yán)密配伍，是其優(yōu)于西藥配方的有效手段。中醫(yī) 方劑理論認(rèn)為，每一方劑，不僅需要根據(jù)病因病機(jī)選擇合適的藥物妥善配伍，同時也應(yīng)符合 組方的基本結(jié)構(gòu)，即"君、臣、佐、使"的組方配伍，所謂"君、臣、佐、使"的組方配伍，就是其 建立在對疾病病機(jī)的全方位判斷基礎(chǔ)上的科學(xué)配比。中醫(yī)用方通過多環(huán)節(jié)、多靶點整合調(diào) 節(jié)的生物學(xué)機(jī)制，對酒精成癮及依賴這樣機(jī)制復(fù)雜難查、西醫(yī)療效、治療非常困難的疾患或 癥狀進(jìn)行凋控，可以取得比西藥更好、更徹底的治療效果，而這種療效是建立在上述中醫(yī)傳 統(tǒng)原創(chuàng)理論的確切指導(dǎo)之上的，本發(fā)明組方遵循了這一原則。
[0021] 中醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，酒性濕，為辛溫燥烈之品，長期飲酒，易耗氣傷血，損陰及 陽，累及腎臟，命門火衰，其成癮機(jī)制的形成與脾、腎二臟的關(guān)系最為密切。酒為濕邪，脾喜 躁而惡濕，飲酒初期濕邪入里，脾土先傷，濕從寒化，則脾陽不升，臨床可見健忘、頭暈等癥。 同時脾胃又為氣血生化之源，為后天之本，腎藏先天之精，是生命本原，為先天之本，腎精 及其化生的人體陰陽之氣，賴脾氣運化的水谷之精及其化生的谷氣的不斷充養(yǎng)和培養(yǎng)，方 能充盛。脾虛水谷，寒濕困脾，清陽不升，不能滋養(yǎng)先天，病久可致腎臟失養(yǎng)，命門火衰，本虛 標(biāo)實互見，氣、血、水俱病。成癮患者在后期臨床往往出現(xiàn)耳鳴心跳，肌肉關(guān)節(jié)、腰背部彌漫 性疼痛，四肢困倦、消瘦，便秘或腹瀉，早衰，陽痿，頭脹眩暈，失眠，胸悶，心悸，厭食厭水，嘔 噦，脈緩或弦滑，舌淡胖苔白等脾腎陽虛的臨床表現(xiàn)。
[0022] 本發(fā)明藥物由附子、黃芪兩味藥組成，其中君以附子功效溫補(bǔ)脾腎之陽，化寒祛 濕，直指酒精成癮之主癥，臣以黃芪益氣健脾，補(bǔ)脾腎氣血，兩藥合用共奏溫陽健脾之功。全 方制劑組方嚴(yán)謹(jǐn)，療效確切。本發(fā)明藥物組合物能有效的消除酒精成癮的心理與行為的"成 癮記憶"，具有良好的戒除酒精成癮的作用，為臨床用藥提供了一種新的選擇。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1各組小鼠適應(yīng)期的自主活動測試基線，由圖可見，與正常對照組比較，中藥 組、酒精組、中藥+酒精組各組小鼠的自主活動基線并沒有統(tǒng)計學(xué)差異，P>〇. 05。
[0024] 圖2、經(jīng)歷10天5次小鼠自主活動測試結(jié)果顯示：酒精組與鹽水相比，在5次測 試期間小鼠的自主活動次數(shù)明顯增加具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異/P < 〇. 01.第4、5次測試期，小 鼠的自主活動次數(shù)高于前3次，#P〈0. 05 ;在第4、5次測試期，中藥+酒精組與鹽水對照組、 中藥組相比小鼠的自主活動次數(shù)增加明顯有統(tǒng)計學(xué)差異，AP〈〇.〇5 ;在第2、3、4、5測試期， 酒精模型組與中藥+酒精組相比小鼠的活動次數(shù)具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，TP〈〇. 01.
[0025] 圖3 :小鼠在激發(fā)階段（3-3)分別接受酒精（2.2g/kg)、中藥（1.8g/kg)、中藥+酒 精、鹽水的激發(fā)結(jié)果顯示：模型組酒精激發(fā)與鹽水激發(fā)相比小鼠自主活動增加差異性顯著 *P< 0.01，模型組酒精激發(fā)與中藥+酒精激發(fā)相比同樣具有顯著差異性AP〈0. 01，而在形 成期（3-4)中藥+酒精組在接受酒精激發(fā)后與鹽水組激發(fā)相比，小鼠的自主活動次數(shù)并沒 有增加，沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>〇. 05).
[0026] 圖4 :在小鼠行為敏化表達(dá)期，酒精組小鼠多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)含量與鹽水 組相比顯著升高ΓΡ〈〇. 01)，與酒精模型組相比，中藥復(fù)方干預(yù)組小鼠的多巴胺（DA)、谷氨 酸（GLU)水平明顯減少（#Ρ〈0. 01).三組在γ -氨基丁酸（GABA)的組間比較中，我們發(fā)現(xiàn) 與鹽水對照組相比，酒精模型組（GABA)減少較顯著fP〈0. 01)，而中藥干預(yù)組與酒精模型 組相比，能夠增加小鼠腦內(nèi)（GABA)的釋放（#Ρ〈0. 01)。
[0027] 圖5、在小鼠行為敏化表達(dá)期酒精組小鼠多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)含量與鹽水組 相比仍顯著升高ΓΡ〈〇. 01)，與酒精模型組相比，中藥復(fù)方干預(yù)組小鼠的多巴胺（DA)、谷氨 酸（GLU)水平明顯減少（#Ρ〈0. 01).同樣的三組在γ -氨基丁酸（GABA)的組間比較中，我 們發(fā)現(xiàn)與鹽水對照組相比，酒精模型組（GABA)減少較顯著ΓΡ〈0. 01)，而中藥干預(yù)組與酒 精模型組相比，能夠增加小鼠腦內(nèi)（GABA)的釋放（#Ρ〈0. 01)。
[0028] 圖6 :小鼠在黑色箱子停留時間為609. 97 士 4. 466 (S)，白色箱子停留時間為 365. 75 士 67. 686 (s) (Ρ〈0. 01).
[0029] 圖7 :經(jīng)過10天5個訓(xùn)練周期后，測試期結(jié)果顯示，中藥組在白色伴藥箱停留時間 為249. 58 士 20. 586S，鹽水組為268. 33. 士 41. 033S兩組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（Ρ>0. 05). 而酒精組小鼠在測試期白色伴藥箱停留時間為546. 67 士 57. 917S，相對于生理鹽水組具有 顯著性差異ΓΡ〈〇.〇1).
[0030] 圖8 :中藥干預(yù)組與酒精組在3個測試期的均可以顯著抑制酒精誘導(dǎo)的小鼠 CPP 的形成ΓΡ〈〇. 05)，而到第3個測試階段顯示，中藥干預(yù)組對于酒精誘導(dǎo)的CPP形成具有 明顯的抑制作用（#Ρ〈〇.〇1)。
[0031] 圖9:各組小鼠適應(yīng)期的自主活動測試基線，由圖可見，與正常對照組比較，中藥 組、酒精組、中藥+酒精組各組小鼠的自主活動基線并沒有統(tǒng)計學(xué)差異，Ρ>〇. 05。
[0032] 圖10、經(jīng)歷10天5次小鼠自主活動測試結(jié)果顯示：酒精組與鹽水相比，在5次測 試期間小鼠的自主活動次數(shù)明顯增加具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異/Ρ < 〇. 01.第4、5次測試期，小 鼠的自主活動次數(shù)高于前3次，#P〈0. 05 ;在第4、5次測試期，中藥+酒精組與鹽水對照組、 中藥組相比小鼠的自主活動次數(shù)增加明顯有統(tǒng)計學(xué)差異，AP〈〇.〇5 ;在第2、3、4、5測試期， 酒精模型組與中藥+酒精組相比小鼠的活動次數(shù)具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，TP〈〇. 01.
[0033] 圖11 :小鼠在激發(fā)階段（3-3)分別接受酒精（2.2g/kg)、中藥（1.8g/kg)、中藥+ 酒精、鹽水的激發(fā)結(jié)果顯示：模型組酒精激發(fā)與鹽水激發(fā)相比小鼠自主活動增加差異性顯 著乍< 0. 01，模型組酒精激發(fā)與中藥+酒精激發(fā)相比同樣具有顯著差異性AP〈0. 01，而在 形成期（3-4)中藥+酒精組在接受酒精激發(fā)后與鹽水組激發(fā)相比，小鼠的自主活動次數(shù)并 沒有增加，沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>〇. 05).
[0034] 圖12在小鼠行為敏化表達(dá)期，酒精組小鼠多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)含量與鹽水 組相比顯著升高ΓΡ〈〇. 01)，與酒精模型組相比，中藥復(fù)方干預(yù)組小鼠的多巴胺（DA)、谷氨 酸（GLU)水平明顯減少（#Ρ〈0. 01).三組在γ -氨基丁酸（GABA)的組間比較中，我們發(fā)現(xiàn) 與鹽水對照組相比，酒精模型組（GABA)減少較顯著fP〈0. 01)，而中藥干預(yù)組與酒精模型 組相比，能夠增加小鼠腦內(nèi)（GABA)的釋放（#Ρ〈0. 01)。
[0035] 圖13、在小鼠行為敏化表達(dá)期酒精組小鼠多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)含量與鹽水 組相比仍顯著升高ΓΡ〈〇. 01)，與酒精模型組相比，中藥復(fù)方干預(yù)組小鼠的多巴胺（DA)、谷 氨酸（GLU)水平明顯減少（#Ρ〈0. 01).同樣的三組在γ -氨基丁酸（GABA)的組間比較中， 我們發(fā)現(xiàn)與鹽水對照組相比，酒精模型組（GABA)減少較顯著ΓΡ〈0. 01)，而中藥干預(yù)組與 酒精模型組相比，能夠增加小鼠腦內(nèi)（GABA)的釋放（#Ρ〈0. 01)。
[0036] 圖14:小鼠在黑色箱子停留時間為589. 97 士 4. 466(S)，白色箱子停留時間為 265. 75 士 67. 686 (s) (P〈0. 01).
[0037] 圖15 :經(jīng)過10天5個訓(xùn)練周期后，測試期結(jié)果顯示，中藥組在白色伴藥箱停留時 間為249. 58 士 20. 586S，鹽水組為268. 33. 士 41. 033S兩組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0. 05). 而酒精組小鼠在測試期白色伴藥箱停留時間為553. 67 士 57. 917S，相對于生理鹽水組具有 顯著性差異ΓΡ〈〇.〇1).
[0038] 圖16、中藥干預(yù)組與酒精組在3個測試期均可以顯著抑制酒精誘導(dǎo)的小鼠CPP的 形成ΓΡ〈0. 05)，而到第3個測試階段顯示，中藥干預(yù)組對于酒精誘導(dǎo)的CPP形成具有明 顯的抑制作用（#Ρ〈〇.〇1)。

【具體實施方式】
[0039] 實施例1本發(fā)明藥物組合物的制備
[0040] 取附子l〇g，黃芪30g。各藥味按量稱取，摻與足量的凈水，文火煎煮附子lh以上 去麻，后入黃芪煎煮。收集水煎液；藥渣再加水煎煮2次，合并各次水煎液，即得湯劑。
[0041] 本方中，附片用量稍大，取其溫陽化濕之功。
[0042] 實施例2本發(fā)明藥物組合物的制備
[0043] 取實施例1制備的湯劑，濃縮后，加適當(dāng)?shù)矸?、糊精混勻后制?！?br> [0044] 實施例3本發(fā)明藥物組合物的制備
[0045] 取烏頭10g，黃芪30g。各藥味按量稱取，摻與適量的凈水，文火煎煮附子lh以上 去麻，后入黃芪煎煮。收集水煎液；藥渣再加水煎煮2次，合并各次水煎液，濃縮后，干燥，力口 入適量糊精、可溶性淀粉制粒后，壓片，即得片劑。
[0046] 實施例4本發(fā)明藥物組合物的制備
[0047] 取附子10g，黃芪30g。各藥味按量稱取，先煎附子，文火煎煮lh去麻，后入黃芪煎 1小時，收集水煎液；藥渣再加水煎煮2次，合并各次水煎液，濃縮后，干燥后，加適量微晶纖 維素，混勻后，裝膠囊，即得膠囊劑。
[0048] 實施例5本發(fā)明藥物組合物的制備
[0049] 取烏頭10g，黃芪30g。各藥味按量稱取，摻與足量的凈水，文火煎煮烏頭lh以上 去麻，后入黃芪煎煮。收集水煎液；藥渣再加水煎煮2次，合并各次水煎液，即得湯劑。
[0050] 本方中，烏頭用量稍大，取其溫陽化濕之功。
[0051] 實施例6本發(fā)明藥物組合物的制備
[0052] 取實施例5制備的湯劑，濃縮后，加適當(dāng)?shù)矸?、糊精混勻后制?！?br> [0053] 實施例7本發(fā)明藥物組合物的制備
[0054] 取烏頭10g，黃芪30g。各藥味按量稱取，摻與足量的凈水，文火煎煮烏頭lh以上 去麻，后入黃芪煎煮。收集水煎液；藥渣再加水煎煮2次，合并各次水煎液，濃縮后，干燥，力口 入適量糊精、可溶性淀粉制粒后，壓片，即得片劑。
[0055] 實施例8本發(fā)明藥物組合物的制備
[0056] 取烏頭10g，黃芪30g。各藥味按量稱取，摻與足量的凈水，文火煎煮烏頭lh以上 去麻，后入黃芪煎煮。收集水煎液；藥渣再加水煎煮2次，合并各次水煎液，濃縮后，干燥后， 加適量微晶纖維素，混勻后，裝膠囊，即得膠囊劑。
[0057] 以下通過藥效學(xué)實驗證明本發(fā)明的有益效果。
[0058] 試驗例1本發(fā)明藥物對酒精成癮小鼠行為敏化動物模型和條件位置偏愛模型影 響的實驗研究。
[0059] 1.實驗材料
[0060] 1. 1實驗動物：3個月大雄性清潔級昆明株小鼠，進(jìn)入實驗室的體重25?30g之 間。小鼠及飼料均由成都達(dá)碩動物實驗公司提供，動物合格證編號：SCXK(ll)2013-24。購 入后置于成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟腑實驗室（國家二級）飼養(yǎng)。
[0061] 1. 2實驗藥物：實施例1方法所述的原料用量及方法制備，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué) 院中藥制劑研究室提供。批號：20130111 ;臨床擬定劑量為每日服用原生藥材40g，按成人 體重一般60kg計算，人用劑量為原生藥材0. 66g/kg體重。實驗室配成分別為5. 94g/kg/ d(相當(dāng)于臨床擬定劑量的9倍）。給藥體積0. lml/10g體重。
[0062] 1. 3實驗器材：小鼠飼養(yǎng)裝置、灌胃針（成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗室），小鼠腦組織切取 裝置及液氮儲存罐（成都里來生物科技有限公司），CPP-100條件位置偏好實驗儀、ZZ-6 自發(fā)活動測試儀（成都泰盟科技有限公司），計算機(jī)：型號：TFT185W80PS (冠捷顯示科技有 限公司）、酶標(biāo)儀：型號：Multlskan Mk3 (賽默飛世爾儀器有限公司）、電子恒溫水浴鍋：型 號DZKW-4(北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。
[0063] 1. 4實驗試劑：多巴胺（DA) ELISA檢測試劑盒：Abeam公司生產(chǎn)，北京輝瑞生物科 技有限公司分裝，生產(chǎn)批號：E-30236。
[0064] 谷氨酸（GLU)ELISA檢測試劑盒：Abeam公司生產(chǎn)，北京輝瑞生物科技有限公司分 裝，生產(chǎn)批號：E-30324。
[0065] Y -氨基丁酸（GABA) ELISA檢測試劑盒：Abeam公司生產(chǎn)，北京輝瑞生物科技有限 公司分裝，生產(chǎn)批號：E-31033。
[0066] 2.實驗設(shè)計及方案
[0067] 2. 1行為敏化實驗
[0068] 2. 1. 1實驗裝置ZZ-6小鼠自發(fā)活動分析系統(tǒng)：2排X3個的六宮格自發(fā)活動箱（同 時測量六只小鼠自發(fā)活動、高分辨率的36個紅外陣列探頭裝置及PC機(jī)數(shù)據(jù)通訊采集分析 功能。材料為雙層鋁塑板，隔音隔光，具有通風(fēng)裝置。由紅外探頭記錄動物活動狀況，計算 動物的自發(fā)活動次數(shù)。
[0069] 2. 1. 2實驗方法及實驗流程
[0070] 適應(yīng)階段：在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周的同時，稱重所有的實驗小鼠，灌胃等量的生理鹽 水后立即放入自主活動測試儀中，使小鼠能夠適應(yīng)測試的實驗環(huán)境，時間為15分鐘。第7 天適應(yīng)后，所有的小鼠放入自主活動測試儀中測試小鼠的自主活動基線，隨后被隨機(jī)分為4 個大組。適應(yīng)期的目的是讓KM小鼠適應(yīng)測試裝置，排除環(huán)境、灌胃等因素對小鼠自主活動 的影響，并記錄它們正常的活動次數(shù)。
[0071] 形成階段：在測試自主活動基線后，小鼠在半小時之前灌胃中藥或者鹽水，隨后灌 胃（2. 2g/kg)的酒精或者生理鹽水，即形成鹽水組+鹽水組（S+S組，η = 40,中藥組+鹽水 組（z+s，η = 40)，鹽水組+酒精組（s+e，η = 40.)，中藥組+酒精組（z+e, η = 40)在酒精 或者生理鹽水灌胃5min后立即放入測試儀中測試15分鐘，實驗隔天進(jìn)行一次，總共10天、 進(jìn)行5次。在經(jīng)歷48小時轉(zhuǎn)換期之后，激發(fā)階段開始。
[0072] 激發(fā)階段：每個實驗大組組，再次被組內(nèi)隨機(jī)分成4個亞組。藥物激發(fā)階段小鼠分 別接受鹽水，酒精組、中藥組、中藥+酒精組的激發(fā)，5min后立即放入自主活動測試儀中，測 試15分鐘。測試完成后，將鹽水+鹽水+酒精組（η = 10)，鹽水+酒精組+酒精組（s+e+e， η = 10)小鼠，鹽水+酒精組+中藥組+酒精組（s+e+z+e, η = 10)小鼠，中藥組+酒精組 +酒精組（s+e+e，n= 10)小鼠，這4個亞組的小鼠立即斷頭處死，取腦組織，檢測中腦邊緣 腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA)及其投射區(qū)伏隔核的（NAC)的多巴胺（DA)，海馬區(qū)、杏仁核區(qū)的谷氨酸 (GLU)，腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA)和NAC區(qū)的γ-氨基丁酸（GABA)這3個神經(jīng)遞質(zhì)中藥干預(yù)前后 的變化。
[0073] 2. 2條件位置偏好實驗（CPP)
[0074] 2. 2. 1實驗裝置CPP-100條件位置偏愛測試儀：它通過將小鼠置于測試箱的灰色 觀察區(qū)域，然后觀察實驗動物在測試箱的三個（白色箱長X寬X高=280X210 X 210mm、 灰色箱長X寬X高=120X210X210mm、黑色箱長X寬X高=280X210X21mm)區(qū)域的 活動情況，從而得到實驗動物是喜好呆在暗色區(qū)域還是明色區(qū)域的定量結(jié)果數(shù)據(jù)，是用于 評價藥物的獎賞效應(yīng)和尋找抗覓藥行為的有效依據(jù)。
[0075] 2. 2. 2實驗步驟本實驗采用偏性實驗程序。實驗分為預(yù)適應(yīng)期、訓(xùn)練期、表達(dá)測試 3個階段，在整個實驗過程中保證箱內(nèi)光線、色調(diào)、氣味等環(huán)境條件的一致。
[0076] 預(yù)適應(yīng)期（第_3?-1天），將小鼠放入CPP箱中，由中間箱放入，打開閘門讓其自 由穿梭15分鐘，每天一次，連續(xù)3天，并且每天灌胃生理鹽水，以消除實驗操作對小鼠的影 響，第3天記錄小鼠在黑、白、中間箱中停留的時間，記錄15min時間內(nèi)小鼠在不同區(qū)域中停 留的時間，作為小鼠天然偏愛效應(yīng)的指標(biāo)，停留時間長的一側(cè)作為非伴藥箱，停留時間短 的一側(cè)作為伴藥箱。并且剔除對黑箱和白箱有明顯偏愛的小鼠（將在一側(cè)停留時間>650S 的剔除）。在本實驗條件下，小鼠天然偏愛黑色，故我們采用有偏性的實驗設(shè)計，選白箱為伴 藥箱，黑箱為非伴藥箱。
[0077] 形成期（第1?10天），每只小鼠每天接受一次訓(xùn)練，酒精每隔一天給藥一次。具 體為，若第一天腹腔灌胃酒精（2. 2g/kg)或者中藥，放入伴藥箱訓(xùn)練15分鐘，則第二天皮下 灌胃相同體積的生理鹽水（NS)，放入非伴藥箱訓(xùn)練15分鐘。鹽水對照組均注射生理鹽水， 中藥復(fù)方在酒精灌胃之前半小時予以提前給藥。依次類推，5個訓(xùn)練周期，形成4各組，即鹽 水組（s+s)、酒精對照組（e+s)、中藥組（z+s)、中藥干預(yù)組（z+e)。訓(xùn)練時間固定為每天上 午的8點到9點之間。
[0078] 測試期（第11天），考慮訓(xùn)練前期小鼠天然偏愛差異并不顯著，因此我們在第五 天訓(xùn)練開始之后，每對酒精與生理鹽水訓(xùn)練后為條件訓(xùn)練期，故在每個條件訓(xùn)練期后24小 時，分別在第6、8、10天測試CPP的表達(dá)。在第11天的測試階段，測試之前小鼠不給藥直接 放入中間箱打開隔板，測定15min內(nèi)小鼠在伴藥箱和非伴藥箱的停留時間，測量小鼠 CPP獲 得的情況。
[0079] 2. 3觀察指標(biāo)及檢測方法
[0080] 2. 3. 1采用ZZ-6小鼠自發(fā)活動測試儀測定行為敏化實驗小鼠實驗中的自發(fā)活動 次數(shù)。
[0081] 2. 3. 2采用CPP-100條件位置偏好測試儀測定CPP實驗組各組小鼠在伴藥箱和非 伴藥箱的停留時間。
[0082] 2. 3. 3采用ELISA分析法測定小鼠腦組織，檢測多巴胺、谷氨酸、γ -氨基丁酸的濃 度水平。
[0083] 3.統(tǒng)計學(xué)方法
[0084] 各組實驗數(shù)據(jù)均以表示，采用SPSS17. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組比較采用 t檢驗；多組間比較采用One-Way AN0VA分析，然后用LSD法進(jìn)行兩兩比較；行為敏化實驗 激發(fā)期多組間比較采用協(xié)方差分析方法。
[0085] 4.實驗結(jié)果
[0086] 4. 1行為敏化的實驗結(jié)果
[0087] 4. 1. 1實驗適應(yīng)期各組小鼠的自主活動基線比較：如圖1所示為各組小鼠適應(yīng)期 的自主活動測試基線，由圖可見，與正常對照組比較，中藥組、酒精組、中藥+酒精組各組 小鼠的自主活動基線并沒有統(tǒng)計學(xué)差異，P>〇. 05。
[0088] 4. 1. 2中藥復(fù)方本發(fā)明重復(fù)給藥對小鼠自主活動的影響：圖2所示為小鼠10 天5次測試期間，鹽水組，中藥組，酒精組（2. 2g/kg)，中藥+酒精組各組之間自主活動的 比較。重復(fù)測量方差分析的結(jié)果顯示交互作用時間X處理（F = 18.573, P〈0. 01，予以 Huynh-Feldt 法矯正），時間因素 （F = 40. 098, Ρ〈(λ 01，予以 Huynh-Feldt 法矯正），處理 因素（F= 198. 010，P〈0. 01)，各處理組之間隨著隨著測試天數(shù)的變化連趨勢有著顯著的差 異。Bonferroni posttests法進(jìn)行多重比較的結(jié)果顯示，第4、5次測試小鼠總的自主活動 次數(shù)顯著高于前三組（P〈〇. 01)。中藥組與鹽水對照組之間小鼠的自主活動沒有統(tǒng)計學(xué)差異 (P>0. 05)，提示中藥復(fù)方本身對小鼠的自主活動并沒有影響。酒精模型組與鹽水組對照組 相比在5次測試期間小鼠的自主活動具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P〈0.01)，提示酒精組小鼠的 自主活動明顯高于鹽水對照組，酒精能夠引起小鼠的高活動性。在第1、2、3次測試結(jié)果顯 示，中藥+酒精組與鹽水組、中藥組相比小鼠的自主活動并沒有差異（P>〇. 05)，而在第4、5 次中藥+酒精組小鼠的活動次數(shù)高于鹽水對照組，中藥組（P〈〇. 05)。中藥+酒精組與酒精 模型組相比，在第2、3、4、5次測試期小鼠的自主活動次數(shù)明顯低于酒精模型組，提示在酒 精灌胃之前，予以中藥復(fù)方能夠減少酒精誘導(dǎo)的小鼠自主活動次數(shù)，即說明中藥復(fù)方對酒 精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化的形成過程具有作用。
[0089] 4. 1. 3中藥復(fù)方本發(fā)明本身對小鼠行為敏化形成期與表達(dá)期的影響（圖3)
[0090] 4. 1. 3. 1中藥復(fù)方本發(fā)明本身對小鼠行為敏化形成與表達(dá)的影響。
[0091] 如圖3-1所示，中藥復(fù)方，分別接受酒精（2. 2g/kg)、中藥（1.8g/kg)、中藥+酒精 激發(fā)下各組小鼠的自主活動次數(shù)并沒有差異性（P>〇. 05)，提示中藥復(fù)方對小鼠行為敏化模 型形成與表達(dá)并沒有作用。
[0092] 4. 1. 3. 2酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化動物模型的建立。
[0093] 如圖3-2所示，酒精模型組接受酒精激發(fā)之后，與鹽水激發(fā)相比小鼠的自主活動 表現(xiàn)出差異性顯著（p〈0.01)，表明由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化動物模型已經(jīng)建立。
[0094] 4. 1. 3. 3中藥復(fù)方本發(fā)明聯(lián)合酒精干預(yù)對小鼠行為敏化表達(dá)的影響。如圖3--3所 示：酒精模型組在接受中藥激發(fā)后，與鹽水激發(fā)組相比小鼠的自主活動次數(shù)并沒有統(tǒng)計學(xué) 差異（P>0. 05)，提示復(fù)方并不能影響酒精組小鼠行為敏化的表達(dá)。而在小鼠予以酒精激發(fā) 之前半小時，我們予以中藥復(fù)方提前灌胃，結(jié)果顯示與單純酒精激發(fā)組相比，中藥+酒精組 激發(fā)對小鼠行為敏化的表達(dá)具有顯著的抑制作用，兩組存在顯著差異性（P〈〇. 01)，提示中 藥復(fù)方與酒精聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化的表達(dá)。
[0095] 4. 1. 3. 4中藥復(fù)方本發(fā)明聯(lián)合酒精干預(yù)對小鼠行為敏化形成的影響。
[0096] 如圖3-4所示，中藥+酒精組在接受酒精激發(fā)后與鹽水組激發(fā)相比，小鼠的自主活 動次數(shù)并沒有增加，沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>〇. 05)。提示在經(jīng)過10天中藥與酒精聯(lián)合、重復(fù)給 藥后，中藥+酒精組小鼠沒有形成行為敏化，而接受相同劑量酒精灌胃后的小鼠在酒精激 發(fā)后（圖3-4)，顯示出顯著的小鼠行為敏化，證明中藥復(fù)方對小鼠的行為敏化的形成具有 抑制作用。
[0097] 4. 1.4中藥復(fù)方本發(fā)明對由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化動物模型形成期多巴胺 (DA)、谷氨酸（GLU)、γ-氨基丁酸（GABA)含量的變化（圖4)。在由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為 敏化形成期，酒精行為敏化組小鼠多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)含量與鹽水組相比顯著升高 (P〈0. 01)。中藥復(fù)方干預(yù)組的多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)水平與鹽水對照組相比并沒有差 異（P>0. 05)，而與酒精模型組相比，中藥復(fù)方干預(yù)組小鼠的多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)水平 明顯減少（P〈〇. 01)。同樣的，在氨基丁酸（GABA)三組的組間比較中，我們發(fā)現(xiàn)，與鹽水 對照組相比，酒精模型組（GABA)減少較顯著（P〈0. 01)，而中藥干預(yù)組與酒精敏化模型組相 t匕，能夠增加小鼠腦內(nèi)（GABA)的釋放。
[0098] 4. 1.5本發(fā)明中藥復(fù)方對由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化動物模型表達(dá)期多巴胺 (DA)、谷氨酸（GLU)、γ-氨基丁酸（GABA)含量的變化（圖5)。在由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為 敏化的表達(dá)期，中藥復(fù)方干預(yù)組小鼠的多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)水平與酒精模型組相比， 明顯減少（P〈〇.〇l)。同樣的，在氨基丁酸（GABA)三組的組間比較中，中藥干預(yù)組與酒 精敏化模型組相比，能夠增加小鼠腦內(nèi)（GABA)的釋放。
[0099] 4. 2條件位置偏好實驗（CPP)的實驗結(jié)果
[0100] 4. 2. 1小鼠的天然偏好效應(yīng)實驗（圖6):如圖6所示，小鼠在900S的預(yù)測試時間 中，在黑色盒子停留時間為609. 97 士 4. . 466S，365. 75 士 67. 686 (P〈0. 01)。結(jié)果提示，小 鼠對四周為黑色、底面為粗糙網(wǎng)狀盒子具有天然偏愛性，因此，我們采用有偏性的實驗設(shè) 計將白色盒子作為伴藥盒，黑色盒子作為非伴藥盒。
[0101] 4. 2. 2中藥復(fù)方本發(fā)明自身的位置偏愛及酒精誘導(dǎo)的小鼠 CPP的建立（圖7): 如圖7所示，經(jīng)過10天5個訓(xùn)練期后，測試期中藥組在白色伴藥箱停留時間為259. 58 士 20. 586S，鹽水組為268. 33. 士 41. 033S兩組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0. 05)，提示中藥復(fù)方 組自身對小鼠的天然位置偏愛選擇沒有影響。而酒精組小鼠在測試期白色伴藥箱停留時間 為546. 67 士 57. 917S，相對于生理鹽水組具有顯著性差異（P〈0. 01)，結(jié)果提示酒精（2. 2g/ kg)可以誘導(dǎo)小鼠條件位置性偏愛形成。
[0102] 4. 2. 3中藥復(fù)方本發(fā)明對酒精誘導(dǎo)小鼠 CPP形成期影響（圖8):如圖8所示，與酒 精組相比，中藥復(fù)方呈時程相關(guān)性抑制酒精誘導(dǎo)的小鼠條件位置偏愛的形成過程。中藥復(fù) 方在3個測試期的結(jié)果顯示均可以顯著抑制酒精誘導(dǎo)的小鼠 CPP的形成（P〈0. 05)，而到第 3個測試階段顯示，中藥對于酒精誘導(dǎo)的CPP形成具有明顯的抑制作用（P〈0. 01)。
[0103] 5.結(jié)論
[0104] 本發(fā)明復(fù)方不僅能降低酒精引起的小鼠高活動性，對酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化的 形成和表達(dá)都有顯著抑制的作用，表明本發(fā)明復(fù)方能夠干預(yù)酒精成癮小鼠軀體依賴的形成 及戒酒之后發(fā)生的復(fù)飲行為。CPP實驗中，本發(fā)明復(fù)方具有防止酒精誘導(dǎo)的小鼠條件位置偏 好模型的形成，即能夠干預(yù)小鼠對于的精神依賴的形成。至為關(guān)鍵的是，本發(fā)明復(fù)方能夠減 少小鼠中腦邊緣獎賞系統(tǒng)DA、Glu神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GBBA的傳遞，從而 奠定了本發(fā)明防治小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性變化的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，從而起到戒除酒精 成癮心理與行為依賴的作用，為中醫(yī)藥防治酒精成癮及酒精依賴提供新的治法和制劑。
[0105] 試驗例2本發(fā)明藥物對酒精成癮小鼠行為敏化動物模型和條件位置偏愛模型影 響的實驗研究。
[0106] 1.實驗材料
[0107] 1. 1實驗動物：3個月大雄性清潔級昆明株小鼠，進(jìn)入實驗室的體重25?30g之 間。小鼠及飼料均由由成都達(dá)碩動物實驗公司提供，動物合格證編號：SCXK(11)2013-24。 購入后置于成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟腑實驗室（國家二級）飼養(yǎng)。
[0108] 1. 2實驗藥物：實施例5所述的原料用量及方法制備，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中 藥制劑研究室提供。批號：20130111 ;臨床擬定劑量為每日服用原生藥材40g，按成人體重 一般60kg計算，人用劑量為原生藥材0. 66g/kg體重。實驗室配成分別為5. 94g/kg/d(相 當(dāng)于臨床擬定劑量的9倍）。給藥體積0. lml/10g體重。
[0109] 1. 3實驗器材：小鼠飼養(yǎng)裝置、灌胃針（成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗室），小鼠腦組織切取 裝置及液氮儲存罐（成都里來生物科技有限公司），CPP-100條件位置偏好實驗儀、ZZ-6 自發(fā)活動測試儀（成都泰盟科技有限公司），計算機(jī)：型號：TFT185W80PS (冠捷顯示科技有 限公司）、酶標(biāo)儀：型號：Multlskan Mk3 (賽默飛世爾儀器有限公司）、電子恒溫水浴鍋：型 號DZKW-4(北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。
[0110] 1. 4實驗試劑：多巴胺（DA) ELISA檢測試劑盒：Abeam公司生產(chǎn)，北京輝瑞生物科 技有限公司分裝，生產(chǎn)批號：E-30236。
[0111] 谷氨酸（GLU)ELISA檢測試劑盒：Abeam公司生產(chǎn)，北京輝瑞生物科技有限公司分 裝，生產(chǎn)批號：E-30324。
[0112] 氨基丁酸（GABA) ELISA檢測試劑盒：Abeam公司生產(chǎn)，北京輝瑞生物科技有限 公司分裝，生產(chǎn)批號：E-31033。
[0113] 2.實驗設(shè)計及方案
[0114] 2.1行為敏化實驗
[0115] 2. 1. 1實驗裝置ZZ-6小鼠自發(fā)活動分析系統(tǒng)：2排X3個的六宮格自發(fā)活動箱（同 時測量六只小鼠自發(fā)活動、高分辨率的36個紅外陣列探頭裝置及PC機(jī)數(shù)據(jù)通訊采集分析 功能。材料為雙層鋁塑板，隔音隔光，具有通風(fēng)裝置。由紅外探頭記錄動物活動狀況，計算 動物的自發(fā)活動次數(shù)。
[0116] 2. 1. 2實驗方法及實驗流程
[0117] 適應(yīng)階段：在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周的同時，稱重所有的實驗小鼠，灌胃等量的生理鹽 水后立即放入自主活動測試儀中，使小鼠能夠適應(yīng)測試的實驗環(huán)境，時間為15分鐘。第7 天適應(yīng)后，所有的小鼠放入自主活動測試儀中測試小鼠的自主活動基線，隨后被隨機(jī)分為4 個大組。適應(yīng)期的目的是讓KM小鼠適應(yīng)測試裝置，排除環(huán)境、灌胃等因素對小鼠自主活動 的影響，并記錄它們正常的活動次數(shù)。
[0118] 形成階段：在測試自主活動基線后，小鼠在半小時之前灌胃中藥或者鹽水，隨后灌 胃（2. 2g/kg)的酒精或者生理鹽水，即形成鹽水組+鹽水組（s+s組，η = 40,中藥組+鹽水 組（Z+S，η = 40)，鹽水組+酒精組（s+e，η = 40.)，中藥組+酒精組（Ζ+Ε, Ν = 40)在酒精 或者生理鹽水灌胃5min后立即放入測試儀中測試15分鐘，實驗隔天進(jìn)行一次，總共10天、 進(jìn)行5次。在經(jīng)歷48小時轉(zhuǎn)換期之后，激發(fā)階段開始。
[0119] 激發(fā)階段：每個實驗大組組，再次被組內(nèi)隨機(jī)分成4個亞組。藥物激發(fā)階段小鼠分 別接受鹽水，酒精組、中藥組、中藥+酒精組的激發(fā)，5min后立即放入自主活動測試儀中，測 試15分鐘。測試完成后，將鹽水+鹽水+酒精組（η = 10)，鹽水+酒精組+酒精組（s+e+e， η = 10)小鼠，鹽水+酒精組+中藥組+酒精組（s+e+z+e, η = 10)小鼠，中藥組+酒精組 +酒精組（s+e+e，n= 10)小鼠，這4個亞組的小鼠立即斷頭處死，取腦組織，檢測中腦邊緣 腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA)及其投射區(qū)伏隔核的（NAC)的多巴胺（DA)，海馬區(qū)、杏仁核區(qū)的谷氨酸 (GLU)，腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA)和NAC區(qū)的γ-氨基丁酸（GABA)這3個神經(jīng)遞質(zhì)中藥干預(yù)前后 的變化。
[0120] 2. 2條件位置偏好實驗（CPP)
[0121] 2. 2. 1實驗裝置CPP-100條件位置偏愛測試儀：它通過將小鼠置于測試箱的灰色 觀察區(qū)域，然后觀察實驗動物在測試箱的三個（白色箱長X寬X高=280X210 X 210mm、 灰色箱長X寬X高=120X210X210mm、黑色箱長X寬X高=280X210X21mm)區(qū)域的 活動情況，從而得到實驗動物是喜好呆在暗色區(qū)域還是明色區(qū)域的定量結(jié)果數(shù)據(jù)，是用于 評價藥物的獎賞效應(yīng)和尋找抗覓藥行為的有效依據(jù)。
[0122] 2. 2. 2實驗步驟本實驗采用偏性實驗程序。實驗分為預(yù)適應(yīng)期、訓(xùn)練期、表達(dá)測試 3個階段，在整個實驗過程中保證箱內(nèi)光線、色調(diào)、氣味等環(huán)境條件的一致。
[0123] 預(yù)適應(yīng)期（第-3?-1天），將小鼠放入CPP箱中，由中間箱放入，打開閘門讓其自 由穿梭15分鐘，每天一次，連續(xù)3天，并且每天灌胃生理鹽水，以消除實驗操作對小鼠的影 響，第3天記錄小鼠在黑、白、中間箱中停留的時間，記錄15min時間內(nèi)小鼠在不同區(qū)域中停 留的時間，作為小鼠天然偏愛效應(yīng)的指標(biāo)，停留時間長的一側(cè)作為非伴藥箱，停留時間短 的一側(cè)作為伴藥箱。并且剔除對黑箱和白箱有明顯偏愛的小鼠（將在一側(cè)停留時間>650S 的剔除）。在本實驗條件下，小鼠天然偏愛黑色，故我們采用有偏性的實驗設(shè)計，選白箱為伴 藥箱，黑箱為非伴藥箱。
[0124] 形成期（第1?10天），每只小鼠每天接受一次訓(xùn)練，酒精每隔一天給藥一次。具 體為，若第一天腹腔灌胃酒精（2. 2g/kg)或者中藥，放入伴藥箱訓(xùn)練15分鐘，則第二天皮下 灌胃相同體積的生理鹽水（NS)，放入非伴藥箱訓(xùn)練15分鐘。鹽水對照組均注射生理鹽水， 中藥復(fù)方在酒精灌胃之前半小時予以提前給藥。依次類推，5個訓(xùn)練周期，形成4各組，即鹽 水組（s+s)、酒精對照組（e+s)、中藥組（z+s)、中藥干預(yù)組（z+e)。訓(xùn)練時間固定為每天上 午的8點到9點之間。
[0125] 測試期（第11天），考慮訓(xùn)練前期小鼠天然偏愛差異并不顯著，因此我們在第五 天訓(xùn)練開始之后，每對酒精與生理鹽水訓(xùn)練后為條件訓(xùn)練期，故在每個條件訓(xùn)練期后24小 時，分別在第6、8、10天測試CPP的表達(dá)。在第11天的測試階段，測試之前小鼠不給藥直接 放入中間箱打開隔板，測定15min內(nèi)小鼠在伴藥箱和非伴藥箱的停留時間，測量小鼠 CPP獲 得的情況。
[0126] 2. 3觀察指標(biāo)及檢測方法
[0127] 2. 3. 1采用ZZ-6小鼠自發(fā)活動測試儀測定行為敏化實驗小鼠實驗中的自發(fā)活動 次數(shù)。
[0128] 2. 3. 2采用CPP-100條件位置偏好測試儀測定CPP實驗組各組小鼠在伴藥箱和非 伴藥箱的停留時間。
[0129] 2. 3. 3采用ELISA分析法測定小鼠腦組織，檢測多巴胺、谷氨酸、氨基丁酸的濃 度水平。
[0130] 3.統(tǒng)計學(xué)方法
[0131] 各組實驗數(shù)據(jù)均以i士表示，采用SPSS17. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組比較采用 t檢驗；多組間比較采用One-Way AN0VA分析，然后用LSD法進(jìn)行兩兩比較；行為敏化實驗 激發(fā)期多組間比較采用協(xié)方差分析方法。
[0132] 4.實驗結(jié)果
[0133] 4. 1行為敏化的實驗結(jié)果
[0134] 4. 1. 1實驗適應(yīng)期各組小鼠的自主活動基線比較：如圖9所示為各組小鼠適應(yīng)期 的自主活動測試基線，由圖可見，與正常對照組比較，中藥組、酒精組、中藥+酒精組各組 小鼠的自主活動基線并沒有統(tǒng)計學(xué)差異，P>〇. 05。
[0135] 4. 1. 2中藥復(fù)方本發(fā)明重復(fù)給藥對小鼠自主活動的影響：圖10所示為小鼠10 天5次測試期間，鹽水組，中藥組，酒精組（2. 2g/kg)，中藥+酒精組各組之間自主活動的 比較。重復(fù)測量方差分析的結(jié)果顯示交互作用時間X處理（F= 19.473, P〈0. 01，予以 Huynh-Feldt法矯正），時間因素 （F = 4L 098, Ρ〈(λ 01，予以Huynh-Feldt法矯正），處理 因素（F= 198. 030，P〈0. 01)，各處理組之間隨著隨著測試天數(shù)的變化連趨勢有著顯著的差 異。Bonferroni posttests法進(jìn)行多重比較的結(jié)果顯示，第4、5次測試小鼠總的自主活動 次數(shù)顯著高于前三組（P〈〇. 01)。中藥組與鹽水對照組之間小鼠的自主活動沒有統(tǒng)計學(xué)差異 (P>0. 05)，提示中藥復(fù)方本身對小鼠的自主活動并沒有影響。酒精模型組與鹽水組對照組 相比在5次測試期間小鼠的自主活動具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P〈0.01)，提示酒精組小鼠的 自主活動明顯高于鹽水對照組，酒精能夠引起小鼠的高活動性。在第1、2、3次測試結(jié)果顯 示，中藥+酒精組與鹽水組、中藥組相比小鼠的自主活動并沒有差異（P>〇. 05)，而在第4、5 次中藥+酒精組小鼠的活動次數(shù)高于鹽水對照組，中藥組（P〈〇. 05)。中藥+酒精組與酒精 模型組相比，在第2、3、4、5次測試期小鼠的自主活動次數(shù)明顯低于酒精模型組，提示在酒 精灌胃之前，予以中藥復(fù)方能夠減少酒精誘導(dǎo)的小鼠自主活動次數(shù)，即說明中藥復(fù)方對酒 精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化的形成過程具有作用。
[0136] 4. 1. 3中藥復(fù)方本發(fā)明本身對小鼠行為敏化形成期與表達(dá)期的影響（圖11)
[0137] 4. 1. 3. 1中藥復(fù)方本發(fā)明本身對小鼠行為敏化形成與表達(dá)的影響。
[0138] 如圖11-1所示，中藥復(fù)方，分別接受酒精（2. 2g/kg)、中藥（1.8g/kg)、中藥+酒精 激發(fā)下各組小鼠的自主活動次數(shù)并沒有差異性（P>〇. 05)，提示中藥復(fù)方對小鼠行為敏化模 型形成與表達(dá)并沒有作用。
[0139] 4. 1. 3. 2酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化動物模型的建立。
[0140] 如圖11-2所示，酒精模型組接受酒精激發(fā)之后，與鹽水激發(fā)相比小鼠的自主活動 明顯增加表現(xiàn)出顯著的差異性（P〈〇. 01)，表明由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化動物模型已經(jīng)建 立。
[0141] 4. 1. 3. 3中藥復(fù)方本發(fā)明聯(lián)合酒精干預(yù)對小鼠行為敏化表達(dá)的影響。如圖11-3所 示：酒精模型組在接受中藥激發(fā)后，與鹽水激發(fā)組相比小鼠的自主活動次數(shù)并沒有統(tǒng)計學(xué) 差異（P>0. 05)，提示復(fù)方并不能影響酒精組小鼠行為敏化的表達(dá)。而在小鼠予以酒精激發(fā) 之前半小時，我們予以中藥復(fù)方提前灌胃，結(jié)果顯示與單純酒精激發(fā)組相比，中藥+酒精組 激發(fā)對小鼠行為敏化的表達(dá)具有顯著的抑制作用，兩組存在顯著差異性（P〈〇. 01)，提示中 藥復(fù)方與酒精聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化的表達(dá)。
[0142] 4. 1. 3. 4中藥復(fù)方本發(fā)明聯(lián)合酒精干預(yù)對小鼠行為敏化形成的影響。
[0143] 如圖11-4所示，中藥+酒精組在接受酒精激發(fā)后與鹽水組激發(fā)相比，小鼠的自主 活動次數(shù)并沒有增加，沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>〇. 05)。提示在經(jīng)過10天中藥與酒精聯(lián)合、重復(fù) 給藥后，中藥+酒精組小鼠沒有形成行為敏化，而接受相同劑量酒精灌胃后的小鼠在酒精 激發(fā)后，顯示出顯著的小鼠行為敏化，證明中藥復(fù)方對小鼠的行為敏化的形成具有抑制作 用。
[0144] 4. 1.4中藥復(fù)方本發(fā)明對由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化動物模型形成期多巴胺 (DA)、谷氨酸（GLU)、γ -氨基丁酸（GABA)含量的變化（圖12)。在由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為 敏化形成期，酒精行為敏化組小鼠多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)含量與鹽水組相比顯著升高 (P〈0. 01)。中藥復(fù)方干預(yù)組的多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)水平與鹽水對照組相比并沒有差 異（P>0. 05)，而與酒精模型組相比，中藥復(fù)方干預(yù)組小鼠的多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)水平 明顯減少（P〈〇. 01)。同樣的，在氨基丁酸（GABA)三組的組間比較中，我們發(fā)現(xiàn)，與鹽水 對照組相比，酒精模型組（GABA)減少較顯著（P〈0. 01)，而中藥干預(yù)組與酒精敏化模型組相 t匕，能夠增加小鼠腦內(nèi)（GABA)的釋放。
[0145] 4. 1.4中藥復(fù)方本發(fā)明對由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化動物模型表達(dá)期多巴胺 (DA)、谷氨酸（GLU)、γ -氨基丁酸（GABA)含量的變化（圖13)。在由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為 敏化的表達(dá)期，中藥復(fù)方干預(yù)組小鼠的多巴胺（DA)、谷氨酸（GLU)水平與酒精模型組相比， 明顯減少（P〈〇.〇l)。同樣的，在氨基丁酸（GABA)三組的組間比較中，中藥干預(yù)組與酒 精敏化模型組相比，能夠增加小鼠腦內(nèi)（GABA)的釋放。
[0146] 4. 2條件位置偏好實驗（CPP)的實驗結(jié)果
[0147] 4. 2. 1小鼠的天然偏好效應(yīng)實驗（圖14):如圖14所示，小鼠在900S的預(yù)測試時 間中，在黑色盒子停留時間為589. 97 士 4. 466S，386. 75 士 67. 686 (P〈0. 01)。結(jié)果提示， 小鼠對四周為黑色、底面為粗糙網(wǎng)狀盒子具有天然偏愛性，因此，我們采用有偏性的實驗 設(shè)計將白色盒子作為伴藥盒，黑色盒子作為非伴藥盒。
[0148] 4. 2. 2中藥復(fù)方本發(fā)明自身的位置偏愛及酒精誘導(dǎo)的小鼠 CPP的建立（圖15): 如圖15所示，經(jīng)過10天5個訓(xùn)練期后，測試期中藥組在白色伴藥箱停留時間為249. 58 士 20. 586S，鹽水組為268. 33. 士 41. 033S兩組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0. 05)，提示中藥復(fù)方 組自身對小鼠的天然位置偏愛選擇沒有影響。而酒精組小鼠在測試期白色伴藥箱停留時間 為533. 67 士 57. 917S，相對于生理鹽水組具有顯著性差異（P〈0. 01)，結(jié)果提示酒精（2. 2g/ kg)可以誘導(dǎo)小鼠條件位置性偏愛形成。
[0149] 4. 2. 3中藥復(fù)方本發(fā)明對酒精誘導(dǎo)小鼠 CPP形成期影響（圖16)如圖16所示，與 酒精組相比，中藥復(fù)方呈時程相關(guān)性抑制酒精誘導(dǎo)的小鼠條件位置偏愛的形成過程。中藥 復(fù)方在3個測試期的結(jié)果顯示均可以顯著抑制酒精誘導(dǎo)的小鼠 CPP的形成（P〈0. 05)，而到 第3個測試階段顯示，中藥對于酒精誘導(dǎo)的CPP形成具有明顯的抑制作用（P〈0. 01)。
[0150] 5.結(jié)論
[0151] 本發(fā)明復(fù)方不僅能降低酒精引起的小鼠高活動性，對酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化的 形成和表達(dá)都有顯著抑制的作用，表明本發(fā)明復(fù)方能夠干預(yù)酒精成癮小鼠軀體依賴的形成 及戒酒之后發(fā)生的復(fù)飲行為。CPP實驗中，本發(fā)明復(fù)方具有防止酒精誘導(dǎo)的小鼠條件位置偏 好模型的形成，即能夠干預(yù)小鼠對于的精神依賴的形成。至為關(guān)鍵的是，本發(fā)明復(fù)方能夠減 少小鼠中腦邊緣獎賞系統(tǒng)DA、Glu神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GBBA的傳遞，從而 奠定了本發(fā)明防治小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性變化的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，從而起到戒除酒精 成癮心理與行為依賴的作用，為中醫(yī)藥防治酒精成癮及酒精依賴提供新的治法和制劑。
【權(quán)利要求】
1. 含有下述重量配比的原料藥在制備治療酒精成癮或/和依賴的藥物中的用途：附子 或烏頭3-10份，黃芪3-35份。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述的藥物是由下述重量配比的原料藥 制備而成的制劑： 附子或烏頭3-10份，黃芪3-35份。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：所述的原料藥重量配比為：附子或烏頭 5-10份，黃芪10-35份。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于：所述的原料藥重量配比為：附子或烏頭 10份，黃芪35份。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述的用途，其特征在于：所述的附子或烏頭為生附子 和/或制附子；所述的烏頭為川烏或草烏；所述的黃芪為生黃芪和/或炙黃芪。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項所述的用途，其特征在于：所述的制劑是口服制劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于：所述的口服制劑是顆粒劑、散劑、丸劑、膠 囊劑、軟膠囊劑、片劑或口服液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述的藥物的制備方法包括如下步驟： a、 稱取原料藥； b、 將原料藥直接打粉，或加水煎煮，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥 學(xué)上常用的制劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述的藥物是治療長期飲酒導(dǎo)致脾胃濕 熱，日久濕從寒化，損傷陽氣，形成的脾腎陽虛之證的藥物。
【文檔編號】A61K36/714GK104083461SQ201410363383
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】扈曉宇, 林武, 扈曉剛 申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院