治療高脂血癥的包含泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及預防或治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈硬化的組合物，其包含泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物作為活性成分。與天然泌酸調(diào)節(jié)肽相比，泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物具有高的激活GLP-1受體和胰高血糖素受體的能力，并具有降低通過高脂肪膳食而升高的血液總膽固醇、低密度膽固醇和三酰甘油水平，和提高高密度膽固醇水平以及高密度膽固醇/低密度膽固醇之比的作用。因此，泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可有效用于治療高脂血癥和相關(guān)疾病。
【專利說明】治療高脂血癥的包含泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及預防或治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈硬化的組合物，其包含泌酸調(diào) 節(jié)肽衍生物作為活性成分，并涉及使用所述組合物治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈硬化的 方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 近年來在韓國，由于經(jīng)濟增長和膳食習慣的西化，從食物中脂肪的攝入增加，且由 于缺乏運動而引起的代謝疾病如高脂血癥、糖尿病、高血壓、動脈硬化和脂肪肝病也增加。
[0004] 高脂血癥是指與血液中升高水平的脂質(zhì)如游離膽固醇、膽固醇酯、磷脂和三酰甘 油有關(guān)的狀況。高脂血癥可以以三種形式存在：（1)高膽固醇血癥，（2)高甘油三酯血癥，和 (3)混合性尚脂血癥（尚膽固醇血癥和尚甘油二醋血癥）。尚脂血癥通常劃分為原發(fā)性尚 脂血癥和繼發(fā)性尚脂血癥。原發(fā)性尚脂血癥通常由遺傳缺陷引起，而繼發(fā)性尚脂血癥由各 種疾病狀況、藥物和膳食習慣引起。此外，高脂血癥還由高脂血癥原發(fā)性和繼發(fā)性原因的組 合引起。通常使用220mg/dl或更高的總膽固醇水平和150mg/dl或更高的三酰甘油水平作 為尚脂血癥的診斷標準。
[0005] 在哺乳動物中自然存在各種形式的膽固醇。已知低密度（LDL)膽固醇對健康有 害，并已知LDL膽固醇的升高增加心臟病的風險（Assmanetal.，Am.J.Card，1996)。此 夕卜，高密度（HDL)膽固醇被視為好的膽固醇并且對健康至關(guān)重要，因為其預防動脈粥樣硬 化等。
[0006] 盡管高脂血癥獨自不顯示具體癥狀，但血液中過多的脂質(zhì)附著于血管壁，減小血 管尺寸并通過炎癥反應引起動脈粥樣硬化。由于這個原因，可出現(xiàn)冠心病、腦血管疾病、夕卜 周血管阻塞等（E.Falketal.，Circulation, 1995)。此外，過多的血脂在肝組織中累積，因 此可引起脂肪肝病。脂肪肝是指其中肝重量中脂肪的比例大于5%的狀況。脂肪肝不僅可 由過多的脂肪攝入引起，而且可由酒精的攝入引起。
[0007] 當前用于降低血脂水平的方法包括膳食療法、運動療法和藥物療法。然而，膳食療 法或運動療法難以嚴格控制和進行，并且其治療效果也受到限制。
[0008] 發(fā)展至目前，用于降低脂質(zhì)水平的藥物包括膽汁酸結(jié)合樹脂、降膽固醇藥如在膽 固醇生物合成中重要的HMG-CoA還原酶抑制劑、降三酰甘油藥如苯氧酸衍生物和煙酸等。 然而，據(jù)報道這些藥物具有副作用，如肝毒性、胃腸紊亂和致癌作用。因此，迫切需要開發(fā)可 用于治療高脂血癥和相關(guān)疾?。ɡ?，動脈粥樣硬化和脂肪肝?。┩瑫r具有較少副作用的 藥物。
[0009] 作為這類藥物的候選物，泌酸調(diào)節(jié)肽最近已經(jīng)受到關(guān)注。泌酸調(diào)節(jié)肽由胰高血糖 素原產(chǎn)生，并且是可與胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)和胰高血糖素受體結(jié)合以執(zhí)行雙功能的 肽。由于這些特征，已經(jīng)以各種目的研宄了泌酸調(diào)節(jié)肽，包括治療肥胖、高脂血癥和脂肪肝 病。然而，泌酸調(diào)節(jié)肽有其需要在高劑量下施用的問題，因為其在體內(nèi)具有短的半衰期，且 其活性不足以用于治療肥胖、高脂血癥和脂肪肝病。
[0010] 因此，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了與天然泌酸調(diào)節(jié)肽相比具有升高的活性的泌酸調(diào)節(jié)肽 衍生物，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物降低高脂血癥誘導的倉鼠模型的血液中脂質(zhì)的 含量和比例，表明該衍生物可有效用于治療高脂血癥疾病，由此完成本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 技術(shù)問題
[0012] 本發(fā)明的一個目的是提供預防或治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈粥樣硬化的組合 物，其含有泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物作為活性成分。
[0013] 本發(fā)明的另一個目的是提供治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈粥樣硬化的方法，該 方法包括將泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于對象的步驟。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物在制備用于預防或治療高脂血癥、 脂肪肝病或動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
[0015] 解決問題的方案
[0016] 為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供預防或治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈粥 樣硬化的組合物，其包含泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物作為活性成分。
[0017] 如本文中使用的，術(shù)語"泌酸調(diào)節(jié)肽"是指由胰高血糖素原產(chǎn)生的肽，所述胰高血 糖素原為胰高血糖素的前體。在本發(fā)明中，泌酸調(diào)節(jié)肽是指包括天然泌酸調(diào)節(jié)肽和其前體， 類似物（衍生物）、片段和變體。優(yōu)選地，泌酸調(diào)節(jié)肽具有氨基酸序列SEQIDNO:l(HSQGT FTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA)〇
[0018] 如本文中使用的，術(shù)語"泌酸調(diào)節(jié)肽變體"是這樣的一種肽，所述肽具有一個或多 個與天然泌酸調(diào)節(jié)肽氨基酸序列的氨基酸殘基不同的氨基酸殘基并具有激活GLP-1和胰 高血糖素受體的功能。泌酸調(diào)節(jié)肽變體可通過天然泌酸調(diào)節(jié)肽一些氨基酸的置換、添加、缺 失、修飾或其組合的任意一種來制備。
[0019] 如本文中使用的，術(shù)語"泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物"是指肽、肽衍生物或肽模擬物，所述 肽、肽衍生物或肽模擬物通過天然泌酸調(diào)節(jié)肽一些氨基酸的添加、缺失或置換來制備，并且 可以以與由天然泌酸調(diào)節(jié)肽激活的水平相比高水平地激活GLP-1受體和胰高血糖素受體。
[0020] 如本文中使用的，術(shù)語"泌酸調(diào)節(jié)肽片段"是指具有天然泌酸調(diào)節(jié)肽氨基或羧基端 一個或多個氨基酸的添加或缺失的片段，其中添加的氨基酸也可以是非天然存在的氨基酸 (例如，D型氨基酸）。這類氨基酸具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平的功能。
[0021] 制備泌酸調(diào)節(jié)肽變體、衍生物和片段的方法可單獨或組合使用。例如，本發(fā)明包括 這樣的肽，所述肽具有一個或多個與天然肽氨基酸不同的氨基酸以及N端氨基酸殘基的脫 氨基作用，并具有激活GLP-1受體和胰高血糖素受體的功能。
[0022] 根據(jù)IUPAC-IUB的命名規(guī)則，本文中提到的氨基酸縮寫如下：
[0023] 丙氨酸A; 精氨酸R;
[0024] 天冬酰胺N ; 天冬氨酸D;
[0025] 半胱氨酸C ; 谷氨酸E;
[0026] 谷氨酰胺Q ; 甘氨酸G;
[0027] 組氨酸H; 異亮氨酸I;
[0028] 亮氨酸L; 賴氨酸K;
[0029] 甲硫氨酸M; 苯丙氨酸F
[0030] 脯氨酸P ; 絲氨酸S;
[0031] 蘇氨酸T; 色氨酸W;
[0032] 酪氨酸Y ; 纈氨酸V。
[0033] 在本發(fā)明中，泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物包括任何這樣的肽，所述肽通過SEQIDNO:1的 氨基酸序列中氨基酸的置換、添加、缺失或翻譯后修飾（例如，甲基化、?；⒎核鼗蚍肿?內(nèi)共價鍵聯(lián)）來制備，并可激活胰高血糖素和GLP-1受體。憑借氨基酸的置換或添加，不 僅可使用人蛋白中常見的20種氨基酸，而且可使用非典型或非天然存在的氨基酸。非典 型氨基酸的商業(yè)來源包括Sigma_Aldrich、ChemPepInc?和GenzymePharmaceuticals。包 含這些氨基酸和非典型肽序列的肽可合成和購買自商業(yè)供應商，例如，AmericanPeptide Company或Bachem(USA)或Anygen(Korea)〇
[0034] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物是新型肽，其包括以下 式1的氨基酸序列：
[0035][式1]
[0036] R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2
[0037] 其中
[0038] R1為組氨酸、脫氨-組氨?；⒍谆?組氨?；∟-二甲基-組氨酰基）、0 -羥 基咪唑丙?；?、4-咪唑乙酰基、0 -羧基咪唑丙?；蚶野彼?；
[0039] XI為Aib(氨基異丁酸）、d-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N_甲基甘氨酸）、絲氨酸、或d-絲 氨酸；
[0040] X2為谷氨酸或谷氨酰胺；
[0041] X3為亮氨酸或酪氨酸；
[0042] X4為絲氨酸或丙氨酸；
[0043] X5為賴氨酸或精氨酸；
[0044]X6為谷氨酰胺或酪氨酸；
[0045] X7為亮氨酸或甲硫氨酸；
[0046] X8為天冬氨酸或谷氨酸；
[0047]X9為谷氨酸、絲氨酸、a-甲基-谷氨酸或缺失；
[0048] X10為谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或絲氨酸或缺失；
[0049] XII為丙氨酸、精氨酸或纈氨酸或缺失；
[0050] X12為丙氨酸、精氨酸、絲氨酸或纈氨酸或缺失；
[0051]X13為賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或a-甲基-谷氨酸或缺失；
[0052]X14為天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸或缺失；
[0053] X15為苯丙氨酸或缺失；
[0054] X16為異亮氨酸或纈氨酸或缺失；
[0055]X17為丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺或a-甲基-谷氨酸或缺失；
[0056] X18為色氨酸或缺失；
[0057] X19為丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、絲氨酸或纈氨酸或缺失；
[0058] X20為丙氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺或精氨酸或缺失；
[0059] X21為天冬酰胺或缺失；
[0060] X22為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸或缺失；
[0061] X23為半胱氨酸或賴氨酸或缺失；
[0062]X24為具有2至10個由丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸或缺失的組合組成的氨基酸的肽； 且
[0063]R2 為KRNRNNIA(SEQIDNO:35)，GPSSGAPPPS(SEQIDNO:36)，GPSSGAPPPSK(SEQ IDNO：37),HSQGTFTSDYSKYLD(SEQIDNO：38),HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQIDNO：39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQIDNO:40)或缺失（如果式 1 的氨基酸序列與SEQIDNO:1 的氨基酸序列相同，則不包括在內(nèi)）。
[0064] 為了提高用于胰高血糖素受體和GLP-1受體的野生型泌酸調(diào)節(jié)肽的活性，本發(fā)明 的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可用通過SEQIDNO:1氨基酸序列第1位的組氨酸a碳的缺失獲得 的4-咪唑乙酰基、通過N-端氨基的缺失獲得的脫氨-組氨?；?，通過用兩個甲基修飾N-端 氨基獲得的二甲基-組氨?；∟-二甲基-組氨?；?、通過用羥基置換N-端氨基獲得的 羥基咪唑丙?；?、或通過用羧基置換N-端氨基獲得的羧基咪唑丙?；脫Q。此外，GLP-1受體結(jié)合區(qū)可用增強疏水鍵和離子鍵或其組合的氨基酸置換。泌酸調(diào)節(jié)肽序列的部 分可用GLP-1或毒蜥外泌肽（艾塞那肽，Exendin)-4的氨基酸序列置換，以提高GLP-1受 體的活性。
[0065] 進一步，泌酸調(diào)節(jié)肽序列的部分可用增強a螺旋的序列置換。優(yōu)選地，式1氨基 酸序列第10、14、16、20、24和28位的氨基酸可用氨基酸或氨基酸衍生物置換，所述氨基酸 或氨基酸衍生物由已知穩(wěn)定a螺旋的Tyr(4-Me)、Phe、Phe(4-Me)、Phe(4-C1)、Phe(4-CN)、 Phe(4-N02)、Phe(4-NH2)、Phg、Pal、Nal、Ala(2-噻吩基）和Ala(苯并噻吩基）組成，將要 插入的穩(wěn)定a螺旋的氨基酸或氨基酸衍生物的類型和數(shù)量不受限制。
[0066] 優(yōu)選地，該氨基酸序列第10與14位、第12與16位、第16與20位、第20與24位、 以及第24與28位的氨基酸也可用谷氨酸或賴氨酸置換，以便形成環(huán)，并且將要插入的環(huán)的 數(shù)量不受限制。最優(yōu)選地，泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可具有從以下式1至式6中選擇的氨基酸序 列。
[0067] 在【具體實施方式】中，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物為新型肽，所述新型肽包括以下 式2的氨基酸序列，其通過用毒蜥外泌肽或GLP-1的氨基酸序列置換泌酸調(diào)節(jié)肽的氨基酸 序列而獲得：
[0068][式2]
[0069] R1-A-R3
[0070] 在另一種【具體實施方式】中，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物為新型肽，所述新型肽包 括以下式3的氨基酸序列，其通過憑借合適的氨基酸連接體連接泌酸調(diào)節(jié)肽氨基酸序列的 部分與毒蜥外泌肽或GLP-1氨基酸序列的部分而制備：
[0071][式3]
[0072] R1-B-C-R4
[0073] 在又一種【具體實施方式】中，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物為新型肽，所述新型肽包 括以下式4的氨基酸序列，其中泌酸調(diào)節(jié)肽氨基酸序列的部分用能夠增強對GLP-1受體的 結(jié)合親和力的氨基酸置換，例如，通過疏水相互作用與GLP-1受體結(jié)合的第26位的Leu用 疏水殘基lie或Val置換。
[0074][式 4]
[0075] R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3
[0076] 在又一種【具體實施方式】中，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物為新型肽，所述新型肽包 括以下式5的氨基酸序列，其中天然泌酸調(diào)節(jié)肽氨基酸序列的部分缺失、添加、或用其他氨 基酸置換，從而提高天然泌酸調(diào)節(jié)肽激活GLP-1受體和胰高血糖素受體的能力：
[0077][式 5]
[0078] R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5
[0079] 在式2至5中，R1與式1中所述的相同；
[0080] A選自：
[0081] SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO ：41),
[0082] SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQIDNO :42)、
[0083] SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQIDNO ：43),
[0084] GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQIDNO :44)、
[0085] GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQIDNO :45)、
[0086] GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQIDNO:46)和
[0087] SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQIDNO：47)；
[0088] B選自：
[0089] SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO ：41),
[0090] SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQIDNO :42)、
[0091] SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQIDNO ：43),
[0092] GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQIDNO :44)、
[0093] GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQIDNO :45)、
[0094] GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQIDNO：46),
[0095] SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQIDNO:47)、
[0096] GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW(SEQIDNO:48)和SQGTFTSDYSRYLD(SEQIDNO: 49)；
[0097] C為具有2至10個由丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸的組合組成的氨基酸的肽；
[0098] D1為絲氨酸、谷氨酸或精氨酸；
[0099] D2為精氨酸、谷氨酸或絲氨酸；
[0100] D3為精氨酸、丙氨酸或纈氨酸；
[0101] D4為精氨酸、纈氨酸或絲氨酸；
[0102] D5為谷氨酰胺、精氨酸或賴氨酸；
[0103] D6為異亮氨酸、纈氨酸或絲氨酸；
[0104] D7為甲硫氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；
[0105] D8為蘇氨酸、甘氨酸或丙氨酸；
[0106] E1為絲氨酸、Aib、Sar、d-丙氨酸或d-絲氨酸；
[0107] E2為絲氨酸或谷氨酸；
[0108] E3為精氨酸或賴氨酸；
[0109]E4為谷氨酰胺或賴氨酸；
[0110]E5為天冬氨酸或谷氨酸；
[0111] E6為谷氨酰胺、半胱氨酸或賴氨酸；
[0112] E7為半胱氨酸或賴氨酸或缺失；
[0113]R3 為KRNRNNIA(SEQIDNO:35)、GPSSGAPPPS(SEQIDNO:36)或GPSSGAPPPSK(SEQ IDNO：37)；
[0114]R4 為HSQGTFTSDYSKYLD(SEQIDNO:38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQIDNO:39)或 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQIDN0:40);且
[0115]R5 為KRNRNNIA(SEQIDNO:35)、GPSSGAPPPS(SEQIDNO:36)或GPSSGAPPPSK(SEQ IDNO:37)或缺失（如果式2至5的氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸序列相同，則不 包括在內(nèi)）。
[0116] 優(yōu)選地，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可以為以下式6的新型肽：
[0117][式 6]
[0118]R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2
[0119] 其中R1為組氨酸、脫氨-組氨?；?、4-咪唑乙?；蚶野彼?；
[0120] XI為Aib(氨基異丁酸）、甘氨酸、絲氨酸或d-絲氨酸；
[0121 ]X2為谷氨酸或谷氨酰胺；
[0122] X3為亮氨酸或酪氨酸；
[0123]X4為絲氨酸或丙氨酸；
[0124] X5為賴氨酸或精氨酸；
[0125] X6為谷氨酰胺或酪氨酸；
[0126] X7為亮氨酸或甲硫氨酸；
[0127] X8為天冬氨酸或谷氨酸；
[0128] X9為谷氨酸或a-甲基-谷氨酸或缺失；
[0129]X10為谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸或精氨酸或缺失；
[0130]XII為丙氨酸或精氨酸或缺失；
[0131]X12為丙氨酸或纈氨酸或缺失；
[0132]X13為賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或a-甲基-谷氨酸或缺失；
[0133]X14為天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸或缺失；
[0134]X15為苯丙氨酸或缺失；
[0135]X16為異亮氨酸或纈氨酸或缺失；
[0136]X17為丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或a-甲基-谷氨酸或缺失；
[0137]X18為色氨酸或缺失；
[0138]X19為丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸或缺失；
[0139]X20為丙氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸或精氨酸或缺失；
[0140]X21為天冬酰胺或缺失；
[0141]X22為蘇氨酸或缺失；
[0142]X23為半胱氨酸、賴氨酸或缺失；
[0143] X24為具有2至10個由甘氨酸組成的氨基酸的肽或缺失；且
[0144] R2 為KRNRNNIA(SEQIDNO:35)、GPSSGAPPPS(SEQIDNO:36)、GPSSGAPPPSK(SEQ IDN0:37)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQIDN0:38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQIDN0:39)或 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQIDN0:40)或缺失（如果式 6 的氨基酸序列與SEQIDN0:1 的氨基酸序列相同，則不包括在內(nèi)）。
[0145] 更優(yōu)選地，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可選自SEQIDNOs:2至34的肽。甚至更 優(yōu)選地，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可以是實施例2-1的表1中所述的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物。
[0146] 在本發(fā)明的實施例中，制備分別具有SEQIDNOs:2至34的氨基酸序列的泌酸調(diào) 節(jié)肽衍生物，并且發(fā)現(xiàn)泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物與天然泌酸調(diào)節(jié)肽（實施例2)相比顯示出優(yōu)異的 GLP-1受體和胰高血糖素受體活性。換言之，由以上結(jié)果可看出，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生 物通過激活GLP-1受體和胰高血糖素受體，表現(xiàn)出對高脂血癥、脂肪肝病或動脈粥樣硬化 優(yōu)異的治療效果。
[0147] 本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物以包括各種聚合物的綴合物的形式存在，從而提高衍 生物的治療效果和體內(nèi)半衰期。
[0148] 與天然泌酸調(diào)節(jié)肽相比，本發(fā)明的綴合物顯示作用的持續(xù)時間增加，長效綴合物 包括通過天然泌酸調(diào)節(jié)肽氨基酸的修飾、置換、添加或缺失而制備的泌酸調(diào)節(jié)肽，綴合至可 生物降解的聚合物如聚乙二醇（PEG)的泌酸調(diào)節(jié)肽，綴合至多糖諸如白蛋白、抗體、彈性蛋 白、纖連蛋白或殼多糖或綴合至長效蛋白如免疫球蛋白片段的泌酸調(diào)節(jié)肽，綴合至具有在 體內(nèi)連接至白蛋白能力的脂肪酸的泌酸調(diào)節(jié)肽，或包封在可生物降解的納米顆粒中的泌酸 調(diào)節(jié)肽，并且本發(fā)明中使用的長效綴合物的類型不受限制。
[0149] 優(yōu)選地，綴合物為這樣的綴合物，在該綴合物中具有選自SEQIDNOs:2至34的氨 基酸序列的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物通過非肽基聚合物連接至免疫球蛋白的Fc區(qū)。
[0150] 免疫球蛋白Fc區(qū)為在體內(nèi)被代謝的可生物降解多肽，因此作為藥物的載體而使 用是安全的。與整個免疫球蛋白分子相比，免疫球蛋白的Fc區(qū)具有低分子量，因此在綴合 物的制備、純化和生產(chǎn)方面是有利的。此外，由于抗體之間的氨基酸序列不同，F(xiàn)ab部分顯 示高的非同質(zhì)性，因此可大幅提高材料的同質(zhì)性，且也可降低誘導血液抗原性的可能性。
[0151] 如本文中使用的，術(shù)語"免疫球蛋白的Fc區(qū)"是指包含免疫球蛋白重鏈恒定區(qū) 2(CH2)和重鏈恒定區(qū)3(CH3)的蛋白質(zhì)，其不包括免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)、重鏈恒定 區(qū)1(CH1)和輕鏈恒定區(qū)1(CL1)。其可進一步包括處于重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)。并且，本發(fā) 明的免疫球蛋白Fc區(qū)可以是擴展的Fc區(qū)，其除了重鏈和輕鏈可變區(qū)之外，包括重鏈恒定區(qū) 1 (CH1)和/或輕鏈恒定區(qū)1 (CL1)的部分或全部，只要其具有與天然蛋白質(zhì)基本上相等或比 其更好的作用。并且，免疫球蛋白Fc區(qū)可以是這樣的區(qū)域，該區(qū)域具有對應于CH2和/或 CH3的部分相對長的氨基酸序列的缺失。具體地，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū)可包括1)CH1 結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和CH4結(jié)構(gòu)域，2)CH1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，3)CH1結(jié)構(gòu)域和 CH3結(jié)構(gòu)域，4)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，5) -個或多個結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)（或鉸 鏈區(qū)的部分）的組合，或6)重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的每個結(jié)構(gòu)域的二聚體。
[0152] 本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū)包括天然氨基酸序列及其序列衍生物（突變體）。如本 文中使用的，術(shù)語"氨基酸序列衍生物"是指由于天然氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基 的缺失、插入、非保守或保守置換或其組合而與天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgG Fc的實例中，在結(jié)合中已知重要的第214至238位、第297至299位、第318至322位、或第 327至331位的氨基酸殘基可用作修飾的合適部位。
[0153] 此外，其他各種衍生物是可能的，包括具有能夠形成二硫鍵的區(qū)域的缺失、或在天 然Fc的N-端一些氨基酸殘基的缺失或在天然Fc的N-端甲硫氨酸殘基的添加的衍生物。 另外，為了去除效應子功能，缺失可發(fā)生于補體結(jié)合部位如Clq結(jié)合部位和ADCC(依賴抗體 的細胞毒性）部位中。制備這類免疫球蛋白Fc區(qū)序列衍生物的技術(shù)公開于國際專利申請 號TO97/34631 和TO96/32478 中。
[0154] 蛋白質(zhì)和肽中的氨基酸交換是本領(lǐng)域公知的，其一般不改變蛋白質(zhì)或肽的活性 (H.Neurath,R.L.Hill,TheProteins,AcademicPress,NewYork, 1979)。最常發(fā)生的交換 為在兩個方向上的Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/ Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/ Gly。此外，如果有必要可通過磷酸化、硫酸鹽化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙酰 化、酰胺化等修飾Fc區(qū)。
[0155] 上述Fc衍生物顯示與本發(fā)明的Fc區(qū)的生物活性相等的生物活性或具有對熱、pH 等的提尚的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
[0156] 此外，該Fc區(qū)可獲自從人和其他動物包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和豚 鼠分離的天然形式，或可以是獲自轉(zhuǎn)化的動物細胞或微生物的其重組體或衍生物。本文中， 通過從活的人或動物體分離整個免疫球蛋白并用蛋白酶將其處理，F(xiàn)c區(qū)可獲自天然免疫球 蛋白。當整個免疫球蛋白用木瓜蛋白酶處理時，其消化成Fab和Fc區(qū)，當整個免疫球蛋白用 胃蛋白酶處理時，其消化成pF'c和F(ab)2片段。Fc或pF'c可使用尺寸排阻層析等分離。 優(yōu)選地，人源Fc區(qū)為獲自微生物的重組免疫球蛋白Fc區(qū)。
[0157] 此外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū)可以是具有天然糖鏈或與天然形式相比增加的 或減少的糖鏈的形式，或可以是去糖基化的形式。通過常規(guī)方法如化學法、酶促法和使用微 生物的基因工程法，可實現(xiàn)免疫球蛋白Fc糖鏈的增加、減少或去除。通過從Fc去除糖鏈而 獲得的Fc區(qū)顯示對第一補體成分C1的Clq部分的結(jié)合親和力顯著降低以及依賴抗體的細 胞毒性或依賴補體的細胞毒性的降低或喪失，因此不誘導體內(nèi)不必要的免疫應答。對此，去 糖基化或無糖基化形式的免疫球蛋白Fc區(qū)作為藥物載體可更適合于本發(fā)明的對象。
[0158] 如本文中使用的，術(shù)語"去糖基化"是指酶促地從Fc區(qū)去除糖部分，和術(shù)語"無糖 基化"是指在原核生物、優(yōu)選地為大腸桿菌中產(chǎn)生的未糖基化的Fc區(qū)。
[0159] 同時，免疫球蛋白Fc區(qū)可源自人或包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和豚鼠 的其他動物，并且優(yōu)選地源自人。
[0160] 此外，免疫球蛋白Fc區(qū)可源自1§6、1§4、1§0、1 §￡、1§11或其組合或雜合。優(yōu)選地， 其源自人血液中最豐富的蛋白質(zhì)中的IgG或IgM，且最優(yōu)選地源自IgG，已知其增強配體結(jié) 合蛋白的半衰期。
[0161] 如本文中使用的，術(shù)語"組合"是指編碼同源單鏈免疫球蛋白Fc區(qū)的多肽被連接 至不同源的單鏈多肽以形成二聚體或多聚體。具體地，二聚體或多聚體可由選自IgGFc、 IgAFc、IgMFc、IgDFc和IgEFc片段的兩個或多個片段形成。
[0162] 如本文中使用的，術(shù)語"雜合"是指對應于兩個或多個不同源免疫球蛋白Fc片段 的序列存在于單鏈免疫球蛋白Fc區(qū)中。在本發(fā)明中，各種形式的雜合是可能的。換言之， 由 1 至 4 個選自IgGFc、IgMFc、IgAFc、IgEFc和IgDFc的CH1、CH2、CH3 和CH4 的結(jié)構(gòu) 域組成的雜合是可能的，且其可包含鉸鏈。
[0163] 同時，IgG也可再分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4,且在本發(fā)明中，這些亞類的組合 或雜合也是可能的。優(yōu)選地，IgG為IgG2和IgG4亞類，最優(yōu)選地，其為基本上缺乏效應子 功能如依賴補體的細胞毒性（CDC)的IgG4的Fc區(qū)。
[0164] 換言之，本發(fā)明中最優(yōu)選的用作藥物載體的免疫球蛋白Fc區(qū)為源自人IgG4的Fc 區(qū)。人源Fc區(qū)比非人源Fc區(qū)更優(yōu)選，非人源Fc區(qū)可在人體內(nèi)充當抗原并引起不期望的免 疫應答如產(chǎn)生針對該抗原的新抗體。
[0165] 如本文中使用的，術(shù)語"非肽基聚合物"是指生物相容性聚合物，其包括兩個或多 個通過任何取代肽鍵的共價鍵相互連接的重復單位。在本發(fā)明中，非肽基聚合物可與非肽 基連接體可互換地使用。
[0166] 可在本發(fā)明中使用的非肽基聚合物可選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇/丙二醇 共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如 PLA(聚乳酸）和PLGA(聚乳酸-乙醇酸）、脂質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸和其組合。優(yōu)選 地，非肽基聚合物為聚乙二醇。此外，本領(lǐng)域公知的其衍生物和通過本領(lǐng)域公知的方法可容 易制備的衍生物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0167] 在通過常規(guī)框內(nèi)融合（inframefusion)方法獲得的融合蛋白中使用的肽連接體 具有在體內(nèi)容易被蛋白酶剪切的缺點，因此通過載體增加有效藥血清半衰期的充分作用不 能夠如所期望的那樣獲得。然而，在本發(fā)明中，與載體類似，對蛋白酶具有抗性的聚合物可 用于維持肽的血清半衰期。因此，在本發(fā)明中可使用任何非肽基聚合物而不受限制，只要其 為具有前述功能的聚合物，即在體內(nèi)對蛋白酶具有抗性的聚合物。非肽基聚合物的分子量 范圍為1至l〇〇kDa，且優(yōu)選地為1至20kDa。本發(fā)明的連接至免疫球蛋白Fc區(qū)的非肽基聚 合物，可為聚合物的一種聚合物或不同聚合物的組合。
[0168] 在本發(fā)明中使用的非肽基聚合物可具有能夠連接至免疫球蛋白Fc區(qū)和蛋白藥物 的反應基。非肽基聚合物兩端的反應基優(yōu)選地選自反應性醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞 胺基和琥珀酰亞胺衍生物。
[0169] 琥珀酰亞胺衍生物可以是琥珀酰亞胺基丙酸酯、羥基琥珀酰亞胺基、琥珀酰亞胺 基羧甲基、或琥珀酰亞胺基碳酸酯。特別地，當非肽基聚合物在其兩端均具有反應性醛基 時，非特異性反應可最小化，并且生理活性多肽和免疫球蛋白可分別有效結(jié)合至非肽基聚 合物的一端和另一端。通過使用醛鍵的還原烷基化而生成的最終產(chǎn)物比通過酰胺鍵連接的 最終產(chǎn)物更穩(wěn)定。醛反應基在低pH下選擇性地結(jié)合N-端，并可在高pH如pH9.0下與賴 氨酸殘基形成共價鍵。
[0170] 非肽基聚合物兩端的反應基可相同或不同。例如，非肽基聚合物可在一端具有馬 來酰亞胺基，在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。當在其兩端均具有反應性羥基的聚乙二 醇被用作非肽基聚合物時，羥基可通過公知的化學反應被激活成各種反應基，或可使用具 有商業(yè)上可獲得的經(jīng)修飾的反應基的聚乙二醇，以便制備本發(fā)明的長效綴合物。
[0171] 本發(fā)明的綴合物可以是其中非肽基聚合物的一端和另一端分別連接至免疫球蛋 白Fc區(qū)和泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的胺基或硫醇基的綴合物。
[0172] 本發(fā)明的非肽基聚合物在兩端均具有官能團，該官能團可連接至免疫球蛋白Fc 區(qū)或蛋白藥物。官能團可以是醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺衍生物 (即，琥珀酰亞胺基丙酸醋、羥基琥珀酰亞胺基、琥珀酰亞胺基羧甲基、或琥珀酰亞胺基碳酸 酯），但不限于此。
[0173] 在非肽基聚合物的連接體兩端的反應基可相同或不同。例如，非肽基聚合物可在 一端具有馬來酰亞胺基，且在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。例如，當非肽基聚合物在 一端具有反應性醛基并在另一端具有反應性馬來酰亞胺基時，非特異性反應可最小化，且 生理活性多肽和免疫球蛋白可有效結(jié)合至非肽基聚合物的兩端。根據(jù)本發(fā)明的實施方式， 綴合物通過使用非肽基聚合物PEG經(jīng)共價鍵將泌酸調(diào)節(jié)肽或其衍生物連接至免疫球蛋白 Fc區(qū)而被合成，該非肽基聚合物PEG只包含丙醛基或同時包含馬來酰亞胺基和醛基。
[0174] 本發(fā)明的藥物組合物可用于預防或治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈粥樣硬化。
[0175] 如本文中使用的，術(shù)語"預防"是指所有抑制或延遲目標疾病發(fā)展的作用。如本文 中使用的，術(shù)語"預防"意思是施用本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物以抑制或延遲高脂血癥、月旨 肪肝病或動脈粥樣硬化的發(fā)展，高脂血癥、脂肪肝病或動脈粥樣硬化顯示血液總膽固醇與 低密度膽固醇水平的升高以及高密度膽固醇水平的降低。
[0176] 如本文中使用的，術(shù)語"治療"是指所有緩解、減輕或緩和發(fā)展的疾病癥狀的作用。 如本文中使用的，術(shù)語"治療"是指施用本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物以緩解、減輕或緩和高 脂血癥、脂肪肝病或動脈粥樣硬化，高脂血癥、脂肪肝病或動脈粥樣硬化顯示血液總膽固醇 與低密度膽固醇水平的升高以及高密度膽固醇水平的降低。
[0177] 如本文中使用的，術(shù)語"高脂血癥"是指與血液中脂質(zhì)如游離膽固醇、膽固醇醋、磷 脂和三酰甘油的水平異常升高有關(guān)的狀況。雖然高脂血癥自身不顯示具體的癥狀，但血液 中過多的脂質(zhì)附著于血管壁，以降低血管尺寸并通過炎癥反應引起動脈粥樣硬化。由于這 個原因，可發(fā)生冠心病、腦血管疾病、外周血管阻塞等。
[0178] 因此，本發(fā)明的藥物組合物不僅可用于治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈粥樣硬化， 而且可用于治療冠心病、腦血管疾病、或外周血管阻塞。
[0179] 如本文中使用的，術(shù)語"脂肪肝病"是指在其中肝的重量中脂肪的比例大于5%的 狀況。在本發(fā)明中，脂肪肝病包括非酒精性脂肪肝病（NAFLD)、酒精性脂肪肝病、營養(yǎng)性脂肪 肝病、饑餓性脂肪肝病、肥胖性脂肪肝病、糖尿病性脂肪肝病或脂肪性肝炎。非酒精性脂肪 肝病是指包括原發(fā)性和繼發(fā)性非酒精性脂肪肝病，但可優(yōu)選地為由原發(fā)性高脂血癥、糖尿 病或肥胖引起的非酒精性脂肪肝病。
[0180] 此外，在本發(fā)明中，非酒精性脂肪肝病是指包括由這類疾病的發(fā)展引起的單純性 脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、以及肝纖維化和肝硬化。
[0181] 動脈粥樣硬化是指這樣的血管病，在該血管病中由于膽固醇在血管內(nèi)皮中的沉積 和內(nèi)皮細胞的增殖而形成動脈粥樣化。
[0182]在本發(fā)明的實施例中，通過使用聚乙二醇由共價鍵將泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物連接至免 疫球蛋白Fc區(qū)，制備長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物，所制備的綴合物被施加至具有由高脂 肪膳食的攝入引起的高脂血癥的倉鼠動物模型。結(jié)果顯示，與高脂血癥誘導的動物模型相 比，施用根據(jù)本發(fā)明的長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物的組顯示出血液三酰甘油水平（圖1) 的顯著降低，血液總膽固醇水平的顯著降低（圖2)，以及血液低密度（LDL)膽固醇水平的顯 著降低。此外，觀察到與高脂血癥誘導的動物模型相比，施用根據(jù)本發(fā)明的長效泌酸調(diào)節(jié)肽 衍生物綴合物的組顯示出血液高密度（HDL)膽固醇水平的顯著升高（圖4)和血液HDL-膽 固醇/LDL-膽固醇比的顯著升高（圖5)。
[0183] 另外，可見根據(jù)本發(fā)明的長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物與商業(yè)的長效GLP-1類似 物VICTOZA?相比，顯示出血液總膽固醇水平（圖6)的降低和血液LDL-膽固醇和三酰甘 油水平的降低（圖7)。此外，可見與施用VICTOZA? (FIGS. 8和9)相比，施用本發(fā)明的長 效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物顯示血液HDL-膽固醇水平以及HDL/LDL-膽固醇之比的升高。 具體地，與VICTOZA?相比，具有Fc的SEQIDNO:25肽的長效綴合物顯示出血液HDL水平 以及HDL/LDL-膽固醇之比的顯著升高。
[0184] 換言之，根據(jù)本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物降低血脂水平，因此可用作用于治療高 脂血癥、脂肪肝病或動脈硬化的劑。此外，本發(fā)明的綴合物具有與天然泌酸調(diào)節(jié)肽相比極佳 的激活GLP-1受體和胰高血糖素受體的能力，并顯示在體內(nèi)升高的血液半衰期，因此其活 性在體內(nèi)可保持以延長的時間。
[0185] 本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可提高調(diào)節(jié)涉及脂肪脂解的酶活性的因子（蛋白激 酶C-G或PKC-〇的活性，并提高涉及脂肪脂解的因子（Glut2)的表達，從而治療高脂血 癥、脂肪肝病或動脈硬化，但本發(fā)明的范圍不限于以上作用機制。
[0186] 本發(fā)明的藥物組合物可進一步包括表現(xiàn)出對高脂血癥、脂肪肝病或動脈硬化的預 防或治療效果的藥劑。具體地，本發(fā)明的組合物可進一步包括已知作為用于治療高脂血癥、 脂肪肝病或動脈硬化的劑的藥劑，從而組合本發(fā)明的衍生物施用藥劑。
[0187] 因此，本發(fā)明的組合物可單獨或組合其他藥物施用，從而預防或治療高脂血癥、月旨 肪肝病或動脈硬化。
[0188] 如本文中使用的，術(shù)語"施用"意思是通過任何適當?shù)姆椒▽⒔o定的物質(zhì)引入患 者。本發(fā)明衍生物可通過任何一般的途徑施用，只要其可到達目標組織。具體地，本發(fā)明的 衍生物可腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)口、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)或直腸內(nèi)施用，但不限于 此。然而，由于經(jīng)口給藥時肽被消化，優(yōu)選地配制經(jīng)口組合物以便活性成分被包被或避免在 胃中降解。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可以注射型形式施用。此外，可使用任何能夠?qū)⒒钚猿?分遞送至靶細胞的系統(tǒng)來施用本發(fā)明的藥物組合物。
[0189] 包含本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的藥物組合物可進一步包括藥學上可接受的載 體。對于經(jīng)口施用，藥學上可接受的載體包括黏合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散 劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、著色劑和調(diào)味劑。對于注射型制劑，藥學上可接受的載體包括緩沖劑、 防腐劑、鎮(zhèn)痛劑、增溶劑、等滲劑和穩(wěn)定劑。對于局部施用，藥學上可接受的載體包括主劑、 賦形劑、潤滑劑和防腐劑。
[0190] 本發(fā)明的藥物組合物可使用前述藥學上可接受的載體配制為各種劑型。例如，對 于經(jīng)口施用，藥物組合物可配制成片劑、含片、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊劑等。對 于注射型制劑，藥物組合物可以以單位劑量安瓿或多劑量容器的形式提供。藥物組合物也 可配制成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊和緩釋制劑。
[0191] 同時，適合于制劑的載體、賦形劑和稀釋劑的示例包括乳糖、葡萄糖、鹿糖、山梨糖 醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、金合歡膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、 纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、 滑石、硬脂酸鎂和礦物油。此外，本發(fā)明的藥物組合物可進一步包括充填劑、抗凝劑、潤滑 劑、潤濕劑、香料、防腐劑等。
[0192] 本發(fā)明的藥物組合物的劑量根據(jù)活性成分的種類，以及各種因素如待治療的疾 病，施用途徑，患者的年齡、性別和重量，和疾病的嚴重性來確定。
[0193] 本發(fā)明的藥物組合物具有長的體內(nèi)半衰期和優(yōu)異的效力，因此藥物組合物施用的 數(shù)量和頻率可顯著減少。
[0194] 在另一種實施方式中，本發(fā)明提供治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈硬化的方法，該 方法包括將本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于對象的步驟。
[0195] 以上泌酸調(diào)節(jié)肽、高脂血癥、脂肪肝病和動脈硬化如上所述。
[0196] 如本文中使用的，術(shù)語"對象"是指被懷疑具有高脂血癥、脂肪肝病或動脈硬化的 對象。具體的，該術(shù)語意為具有或受到患上述疾病的風險的哺乳動物，包括人、大鼠和家畜。 此外，該對象可以是任何可由本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物治療的對象。
[0197] 本發(fā)明治療方法可包括施用包含綴合物的藥學上有效量的藥物組合物。組合物的 日總劑量可通過醫(yī)師適當?shù)尼t(yī)學判斷確定，且組合物可施用一次或幾次。然而，鑒于本發(fā)明 的目的，針對每個具體患者的組合物的具體治療有效劑量可根據(jù)醫(yī)學領(lǐng)域公知的各種因素 而不同，該因素包括所實現(xiàn)的反應的種類和程度，根據(jù)其他劑是否伴隨其使用的具體組合 物，患者的年齡、體重、健康狀況、性別和日常膳食，施用時間和途徑，組合物的分泌率，治療 的持續(xù)時間，與本發(fā)明的組合物組合或同時使用的其他藥物，以及醫(yī)學領(lǐng)域公知的其他因 素。
[0198] 在又一個方面，本發(fā)明提供制備泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物的方法。
[0199] 該制備方法可包括步驟：（1)將具有反應性醛、馬來酰亞胺或琥珀酰亞胺基的非 肽基聚合物共價連接至泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物肽的胺或硫醇基；（2)從步驟（1)的反應混合物 分離泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物肽，該泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物肽具有在氨基端以外的位置與其共價結(jié)合 的非肽基聚合物；和（3)將免疫球蛋白Fc區(qū)共價連接至所連接的非肽基聚合物的另一端， 從而產(chǎn)生包含分別連接至非肽基聚合物的一端和另一端的免疫球蛋白Fc區(qū)和泌酸調(diào)節(jié)肽 衍生物肽的肽綴合物。
[0200] 更具體地，該制備方法可包括步驟：1)將分別在其一端和另一端具有反應性醛基 和反應性馬來酰亞胺基的非肽基聚合物共價連接至泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的半胱氨酸殘基； (2)從步驟（1)的反應混合物分離具有共價連接至半胱氨酸殘基的非肽基聚合物的泌酸調(diào) 節(jié)肽衍生物；和（3)將免疫球蛋白Fc區(qū)共價連接至所連接的非肽基聚合物的另一端，從而 產(chǎn)生包括分別連接至非肽基聚合物一端和另一端的免疫球蛋白Fc區(qū)和泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物 肽的肽綴合物。
[0201] 在又一個方面，本發(fā)明提供泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物在制備用于預防或治療高脂血癥、 脂肪肝病或動脈硬化的藥物中的應用。
[0202] 發(fā)明的有利效果
[0203] 本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物與天然泌酸調(diào)節(jié)肽相比具有高的激活GLP-1受體和 胰高血糖素受體的能力，且表現(xiàn)降低通過高脂肪膳食而升高的血液總膽固醇、低密度膽固 醇和三酰甘油水平，并升高高密度膽固醇水平以及高密度膽固醇/低密度膽固醇之比的作 用。因此，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可有效由于治療高脂血癥和相關(guān)疾病。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0204] 圖1為顯示通過將長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于高脂肪膳食誘導的高脂血癥倉 鼠而引起血液三酰甘油水平變化的圖（#:表示與普通膳食組相比在99. 9%的置信度內(nèi) (p〈0. 001)顯著升高；表示與高脂肪膳食組相比在99. 9%的置信度內(nèi)（p〈0. 001)顯著降 低）。
[0205] 圖2為顯示通過將長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于高脂肪膳食誘導的高脂血癥倉 鼠而引起血液總膽固醇水平的變化圖（#:表示與普通膳食組相比在99. 9%的置信度內(nèi) (p〈0. 001)顯著升高；表示與高脂肪膳食組相比在99. 9%的置信度內(nèi)（p〈0. 001)顯著降 低）。
[0206] 圖3為顯示通過將長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于高脂肪膳食誘導的高脂血癥倉 鼠而引起血液LDL-膽固醇水平變化的圖:表示與普通膳食組相比在99. 9%的置信度內(nèi) (p〈0. 001)顯著升高；表示與高脂肪膳食組相比在99. 9%的置信度內(nèi)（p〈0. 001)顯著降 低）。
[0207] 圖4為顯示通過將長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于高脂肪膳食誘導的高脂血癥倉 鼠而引起血液HDL-膽固醇水平變化的圖:表示與高脂肪膳食組相比在99%的置信度內(nèi) (p〈0.01)顯著降低）。
[0208] 圖5為顯示通過將長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于高脂肪膳食誘導的高脂血癥倉 鼠而引起血液HDL/LDL-膽固醇水平變化的圖:顯示與高脂肪膳食組相比在95%的置信 度內(nèi)（p〈0. 05)顯著降低）。
[0209] 圖6為顯示通過將VICTOZA?或長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于高脂肪膳食誘 導的高脂血癥倉鼠而引起血液總膽固醇水平變化的圖:表示與高脂肪膳食組相比在 99. 9%的置信度內(nèi)（p〈0. 001)顯著降低）。
[0210] 圖7為顯示通過施用將VICTOZA?或長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物適用于高脂肪膳食 誘導的高脂血癥倉鼠而引起血液LDL-膽固醇水平變化的圖:表示與高脂肪膳食組相 比在99. 9%的置信度內(nèi)（p〈0. 001)顯著降低）。
[0211] 圖8為顯示通過將VICTOZA?或長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于高脂肪膳食誘導 的高脂血癥倉鼠而引起血液HDL-膽固醇水平變化的圖:表示與高脂肪膳食組相比在 95%的置信度內(nèi)（p〈0. 05)顯著降低。
[0212] 圖9為顯示通過將VICTOZA?或長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于高脂肪膳食誘導 的高脂血癥倉鼠而引起血液HDL/LDL-膽固醇水平降低的圖:表示與高脂肪膳食組相比 在99%的置信度內(nèi)（p〈0. 01)顯著降低）。
[0213] 圖10為顯示通過將VICTOZA?或長效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施用于高脂肪膳食誘 導的高脂血癥倉鼠而引起血液三酰甘油水平變化的圖:表示與高脂肪膳食組相比在 99. 9%的置信度內(nèi)（p〈0. 001)顯著降低）。

【具體實施方式】
[0214] 在下文中，將引用實施例進一步詳細描述本發(fā)明。然而要理解的是，這些實施例僅 僅是為了說明的目的，而不旨在限制本發(fā)明的范圍。
[0215] 實施例1 :產(chǎn)牛用于體內(nèi)激活的細朐系
[0216] 實施例1-1 :產(chǎn)牛對GLP-1顯示cAMP應答的細朐系
[0217] 使用對應于人GLP-1 受體基因cDNA(OriGeneTechnologies,Inc.USA)ORF(可讀 框）的部分作為模板，利用分別包含Hindlll切割位點和EcoRI切割位點的反向和正向引 物進行PCR，從而獲得PCR產(chǎn)物。
[0218] 正向引物：5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3'（SEQIDNO:50)
[0219] 反向引物：5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3'（SEQIDNO:51)
[0220] PCR產(chǎn)物被克隆至已知的動物細胞表達載體xOGC/dhfr中，從而構(gòu)建重組載體 x0GC/GLP-1R〇
[0221] 重組載體xOGC/GLP-lR被引入CHODG44細胞系，在DMEM/F12(10%FBS)培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺（Invitrogene，USA)，以獲得轉(zhuǎn)化體。在含有l(wèi)mg/mLG418和10nM 氨甲蝶呤的選擇性培養(yǎng)基中溫育該轉(zhuǎn)化體，從中選擇單克隆細胞系。然后，最終從單克隆細 胞系中選擇對GLP-1顯示良好濃度依賴性cAMP應答的細胞系。
[0222] 實施例1-2 :產(chǎn)牛對腠高血糖素顯示cAMP應答的細朐系
[0223] 使用對應于人膜高血糖素受體基因的cDNA(OriGeneTechnologies,Inc.USA) ORF(可讀框）的部分作為模板，利用分別包含EcoRI切割位點和Xhol切割位點的反向和正 向引物進行PCR，從而獲得PCR產(chǎn)物。
[0224] 正向引物：5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'（SEQIDNO:52)
[0225] 反向引物：5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'（SEQIDNO:53)
[0226] PCR產(chǎn)物被克隆至已知的動物細胞表達載體xOGC/dhfr，從而構(gòu)建重組載體xOGC/ GCGR〇
[0227] 重組載體xOGC/GCGR被引入CHODG44細胞系，在DMEM/F12(10%FBS)培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺（Invitrogene，USA)，以獲得轉(zhuǎn)化體。在含有l(wèi)mg/mLG418和10nM氨甲 蝶呤的選擇性培養(yǎng)基中溫育該轉(zhuǎn)化體，從中選擇單克隆細胞系。然后，最終從單克隆細胞系 中選擇對胰高血糖素顯示良好濃度依賴性cAMP應答的細胞系。
[0228] 實施例2 :泌酸調(diào)節(jié)肽衍牛物的體內(nèi)活件
[0229] 實施例2-1 :泌酸調(diào)節(jié)肽衍牛物的合成
[0230] 為了測量泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的體內(nèi)活性，具有以下表1中顯示氨基酸序列的泌酸 調(diào)節(jié)肽衍生物。
[0231] 【表1】
[0232] 泌酸調(diào)節(jié)肽和泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物
[0233]

【權(quán)利要求】
1. 預防或治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈硬化的組合物，其包含泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物作 為活性成分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物具有選自SEQ ID NOs: 2至34的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的形式為連接至選自免 疫球蛋白片段、抗體、彈性蛋白、白蛋白和纖連蛋白的一種的綴合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述綴合物為這樣的綴合物，在其中具有選自 SEQ ID N0s:2至34的氨基酸序列的所述泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物通過非肽基聚合物連接至免疫 球蛋白Fc區(qū)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述非肽基聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙 二醇/丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、PLA(聚乳 酸）、PLGA(聚乳酸-乙醇酸）、脂質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸和其組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述非肽基聚合物的一端和另一端分別連接至 所述免疫球蛋白Fc區(qū)和所述泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的胺基或硫醇基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其進一步包括顯示對高脂血癥、脂肪肝病或動脈硬 化的預防或治療效果的藥劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂肪肝病為非酒精性脂肪肝病、酒精性脂 肪肝病、營養(yǎng)性脂肪肝病、饑餓性脂肪肝病、肥胖性脂肪肝病、糖尿病性脂肪肝病或脂肪性 肝炎。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述非酒精性脂肪肝病由高脂血癥、糖尿病或 肥胖所導致。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述非酒精性脂肪肝病選自單純性脂肪變性、 非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化。
11. 預防或治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈硬化的方法，其包括將泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物施 用于對象的步驟。
12. 泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物在制備用于預防或治療高脂血癥、脂肪肝病或動脈硬化的藥物 中的應用。
【文檔編號】A61K38/16GK104507492SQ201380039596
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月25日
【發(fā)明者】鄭圣燁, 金鎭善, 張明賢, 李相賢, 崔仁榮, 權(quán)世昌 申請人:韓美藥品株式會社