一種用于運(yùn)載抗腫瘤藥物的核酸納米結(jié)構(gòu)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于運(yùn)載抗腫瘤藥物的核酸納米結(jié)構(gòu)及其制備方法和應(yīng)用。所述核酸納米結(jié)構(gòu)是通過DNA折紙技術(shù)構(gòu)建的任意二維和/或三維納米結(jié)構(gòu)，具體是腳手架鏈與輔助折疊的訂書釘鏈通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交完成自組裝而形成的核酸納米結(jié)構(gòu)。所述核酸納米結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物的載體不但能夠保證其運(yùn)載的抗腫瘤藥物的抗腫瘤活性，而且能夠提高抗腫瘤藥物的靶向性，使抗腫瘤藥物在腫瘤組織中富集，顯著降低抗腫瘤藥物由于非特異性而產(chǎn)生的全身毒性。其制備方法工藝簡單、成本低且方便易行。
【專利說明】-種用于運(yùn)載抗腫瘤藥物的核酸納米結(jié)構(gòu)及其制備方法和 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物載體【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及一種用于運(yùn)載抗腫瘤藥物 的核酸納米結(jié)構(gòu)及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病。小分子抗腫瘤藥物缺乏特異性， 致使化學(xué)治療過程產(chǎn)生極大的副作用，常導(dǎo)致化療失敗。應(yīng)用納米技術(shù)發(fā)展抗腫瘤藥物靶 向運(yùn)輸和可控釋放的藥物運(yùn)載系統(tǒng)是解決該問題的關(guān)鍵，已成為當(dāng)前腫瘤治療研究領(lǐng)域的 執(zhí)占。
[0003] 以納米顆粒作為抗腫瘤藥物載體進(jìn)行抗腫瘤治療的研究始于上世紀(jì)50年代，研 究較多的如高分子納米材料，脂質(zhì)體或金納米粒子等。大量納米顆粒已被成功用于藥物轉(zhuǎn) 運(yùn)和抗腫瘤研究與治療之中，如美國FDA批準(zhǔn)的脂質(zhì)體內(nèi)包阿霉素（Doxorubicin)和聚乙 二醇（PEG)干擾素 -a 2a (Pegasys) (Nature Reviews Drug Discovery, 2010, 9, 615-627; Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4, 145 - 160 ；J.Drug Target. 2006, 14, 301 - 310 ； Nature Review Cancer2006, 6, 688 - 701.)。基于納米技術(shù)，雖然有很多藥物運(yùn)載體系已經(jīng) 成功應(yīng)用，但是要進(jìn)一步解決抗腫瘤藥物缺乏特異性和高毒性的問題，在靶向運(yùn)輸和可控 釋放抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域仍然存在許多關(guān)鍵問題尚未解決。因此，探索新的制備方法，獲得 新型納米材料作為抗腫瘤藥物載體并進(jìn)行細(xì)胞及動物水平的抗腫瘤實驗具有重要的理論 意義和潛在的應(yīng)用價值。要解決上述問題，其核心是構(gòu)建高效、低毒、靶向、可控的生物大分 子微米或納米結(jié)構(gòu)作為藥物運(yùn)輸和釋放系統(tǒng)，該藥載系統(tǒng)需滿足形態(tài)和粒徑容易控制、化 學(xué)結(jié)構(gòu)容易修飾從而實現(xiàn)功能化、生物相容性較好等必要條件。
[0004] 在自然界的各種生命體中，生物大分子脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA)是遺傳信息的載體。而在結(jié)構(gòu)DNA技術(shù)（structural DNA nanotechnology)中，DNA 不再作為遺傳信息的載體，而是通過預(yù)先進(jìn)行特定的設(shè)計，形成納米結(jié)構(gòu)的基元。DNA折紙 技術(shù)（DNA origami)是一種新穎而獨(dú)特的DNA自組裝納米技術(shù)，即利用長的單鏈核苷酸序 列與若干條短的寡核苷酸序列通過堿基互補(bǔ)配對進(jìn)行雜交形成預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在被廣 泛用來從DNA自下而上（Bottom-up)地制作各種納米尺度的二維和/或三維的DNA圖案和 形狀（Nature, 2006, 440, 297-302.)。利用DNA折紙技術(shù)構(gòu)造的納米結(jié)構(gòu)具有結(jié)構(gòu)可控、易 于修飾的特點(diǎn)，具有成為小分子抗腫瘤藥物載體的可能，在藥物運(yùn)載方面有非常廣闊的潛 在應(yīng)用前景?；诤怂嵝蛄械奶匦赃M(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物運(yùn)輸載體相比，核 酸納米結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢十分明顯：1)能夠生物降解，具有其它載體不可比擬的良好的生物相容 性；2)沒有明顯的細(xì)胞毒性和免疫原性；3)結(jié)構(gòu)具有高度可預(yù)測性；4)可以構(gòu)造出所需要 的圖形結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步構(gòu)建復(fù)雜可控的納米級圖案和形狀；5)可以利用其結(jié)構(gòu)本身直接裝載 與DNA分子相互作用的抗腫瘤藥物，也可利用其形成的納米結(jié)構(gòu)包載藥物；6)內(nèi)部可以進(jìn) 行功能化修飾，因此能夠有效裝載多種藥物或成像試劑，從而實現(xiàn)載體的多功能性，以達(dá)到 多種藥物聯(lián)合給藥、治療與檢測同時完成的功能；7)具有良好的穩(wěn)定性，對于內(nèi)部裝載的藥 物將起到很好的保護(hù)作用；8)可在選擇的部位進(jìn)行靶向性功能基團(tuán)的修飾，增強(qiáng)載藥系統(tǒng) 的靶向性；9)可通過修飾使得結(jié)構(gòu)在特定條件下能夠可控的開啟和關(guān)閉，從而達(dá)到控制藥 物釋放的目的。
[0005] 雖然，通過分析可知核酸納米結(jié)構(gòu)具有上述優(yōu)勢，但是目前尚無將核酸納米結(jié)構(gòu) 作為抗腫瘤藥物的載體應(yīng)用于人或動物腫瘤治療的報道。主要是因為核酸納米結(jié)構(gòu)作為抗 腫瘤藥物的載體對抗腫瘤藥物的動物水平上的特異性及全身毒性的影響還缺乏認(rèn)識。換句 話說，目前還沒有研究能夠證明核酸納米結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物的載體是否能夠促進(jìn)抗腫瘤 藥物在腫瘤組織中的富集以及是否能夠顯著降低抗腫瘤藥物對動物的全身毒性。
[0006] 因此，本領(lǐng)域亟需相關(guān)研究以證明核酸納米結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物載體的價值的大 小。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明人經(jīng)過大量試驗和創(chuàng)造性的勞動，預(yù)料不到地發(fā)現(xiàn) 核酸納米結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物的載體不但能夠保證其運(yùn)載的抗腫瘤藥物的抗腫瘤活性，而 且能夠提高抗腫瘤藥物的靶向性，使抗腫瘤藥物在腫瘤組織中富集，顯著降低抗腫瘤藥物 由于非特異性而產(chǎn)生的全身毒性。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于運(yùn)載抗腫瘤藥物 的核酸納米結(jié)構(gòu)及其制備方法和應(yīng)用。
[0008] 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用以下技術(shù)方案：
[0009] 在第一方面，本發(fā)明提供一種用于運(yùn)載抗腫瘤藥物的核酸納米結(jié)構(gòu)，所述核酸納 米結(jié)構(gòu)是通過DNA折紙技術(shù)（DNA origami)構(gòu)建的任意二維和/或三維納米結(jié)構(gòu)，具體是 腳手架鏈（scaffold chains)與輔助折疊的訂書釘鏈（staple strands)通過堿基互補(bǔ)配對 原則進(jìn)行雜交完成自組裝而形成的核酸納米結(jié)構(gòu)；優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物為順鉬、環(huán)磷酰 胺、紫杉醇和阿霉素中的一種或多種，優(yōu)選阿霉素。
[0010] 在本發(fā)明一個具體實施方案中，發(fā)明人研究了阿霉素作為抗腫瘤藥物由本發(fā)明的 核酸納米結(jié)構(gòu)運(yùn)載進(jìn)入動物細(xì)胞及動物體后的藥理學(xué)或毒理學(xué)方面的效果。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員能夠知曉，目前的抗腫瘤藥物及以后研發(fā)出來的抗腫瘤藥物均可以本發(fā)明的核酸納米 結(jié)構(gòu)作為載體。
[0011] 本發(fā)明的核酸納米結(jié)構(gòu)可以是M13噬菌體基因組DNA、基于M13噬菌體基因組DNA 進(jìn)行改造的各種單鏈環(huán)狀DNA、Lambda噬菌體基因組DNA、通過PCR得到的M13噬菌體基因 組DNA片段或Lambda噬菌體基因組DNA片段和/或利用體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA片段與人工 合成的寡核苷酸序列通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交完成自組裝而形成的，優(yōu)選M13噬菌 體基因組DNA與人工合成的寡核苷酸序列通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交完成自組裝而 形成的。
[0012] 本發(fā)明對腳手架鏈和輔助折疊的訂書釘鏈的序列沒有特別要求，只要滿足特定位 點(diǎn)上的堿基互補(bǔ)配對，使得訂書釘鏈能夠輔助腳手架鏈進(jìn)行折疊自組裝形成核酸納米結(jié)構(gòu) 即可。
[0013] 本發(fā)明的核酸納米結(jié)構(gòu)形狀可以是三角形、長方形、納米管狀、四面體、巴基球形、 納米片狀、帶狀或籠狀，優(yōu)選為三角形。
[0014] 在第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法，將輔 助折疊的訂書釘鏈加入到腳手架鏈溶液中，混勻后，從溫度90?100°C、優(yōu)選92?98°C、更 優(yōu)選95°C開始，逐漸降溫退火至溫度15?25°C、優(yōu)選18?22°C、更優(yōu)選20°C，降溫退火即 孵育時間為8?28h、優(yōu)選10?26h、更優(yōu)選12?24h，得到所述核酸納米結(jié)構(gòu)；優(yōu)選地，所 述腳手架鏈與所述訂書釘鏈的摩爾比為1:2?1:50,優(yōu)選1:5?1:30,更優(yōu)選1:10?1:25， 特別優(yōu)選1:20。
[0015] 在本發(fā)明的核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，所述腳手架鏈與所述訂書釘鏈的摩爾比 可以是 1:2、1:3、1:4、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:22、1:28、1:32、1:35、1:38、 1:40、1:42、1:45、1:48 或 1:49。
[0016] 在本發(fā)明的核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，降溫起始溫度可以是90°C、91°C、92°C、 93°C、94°C、95t：、96t：、97t：、98t：、99t：*l(KrC。
[0017] 在本發(fā)明的核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，降溫終止溫度可以是15°C、16°C、17°C、 18°C、19°C、2(rC、2rC、22t：、23t：、24t：*25t：。
[0018] 在本發(fā)明的核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，孵育時間可以是9h、llh、13h、14h、15h、 18h、20h、21h、22h、23h、25h 或 27h。
[0019] 在第三方面，本發(fā)明提供一種載藥核酸納米結(jié)構(gòu)，所述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)包括如 第一方面所述的核酸納米結(jié)構(gòu)及嵌入所述核酸納米結(jié)構(gòu)中的抗腫瘤藥物；優(yōu)選地，所述抗 腫瘤藥物為順鉬、環(huán)磷酰胺、紫杉醇和阿霉素中的一種或多種，優(yōu)選阿霉素。
[0020] 在第四方面，本發(fā)明提供一種如第三方面所述的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法， 將所述核酸納米結(jié)構(gòu)與所述抗腫瘤藥物接觸形成所述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)；優(yōu)選地，將所述 核酸納米結(jié)構(gòu)的溶液與所述抗腫瘤藥物的溶液混合，振蕩孵育，離心，棄上清，得到所述載 藥核酸納米結(jié)構(gòu)；更優(yōu)選地，將所述核酸納米結(jié)構(gòu)與所述抗腫瘤藥物按照摩爾比為1: IO7? I: IO5數(shù)量級、優(yōu)選I: IO6數(shù)量級混合于溶液中，在溫度20?30°C、優(yōu)選22?28°C、更優(yōu)選 24?26°C，轉(zhuǎn)速30?120rpm、優(yōu)選60?90rpm條件下，振蕩孵育20?50h、優(yōu)選24?48h， 然后在溫度20?30°C、優(yōu)選22?28°C、更優(yōu)選24?26°C條件下，轉(zhuǎn)速5000?lOOOOrpm、 優(yōu)選7000?8000rpm離心5?20min、優(yōu)選10?15min，棄上清，得到所述載藥核酸納米結(jié) 構(gòu)。
[0021] 在本發(fā)明的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，所述核酸納米結(jié)構(gòu)與所述抗腫瘤 藥物按照摩爾比可以是 1: 1〇7、1:2 X 107、1:4 X 107、1:5 X 107、1:8 X 107、1:9 X 107、1:106、 1:2 X 106、1:4 X 106、1:5 X 106、1:8 X 106、1:9 X IO6 或 1:105。
[0022] 在本發(fā)明的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，振蕩孵育的溫度可以是20°C、21°C、 22°C、23°C、24t：、25t：、26t：、27t：、28t：、29t：*3(rC。
[0023] 在本發(fā)明的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，振蕩孵育的轉(zhuǎn)速可以是30rpm、 40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm、IlOrpm 或 120rpm〇
[0024] 在本發(fā)明的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，振蕩孵育的時間可以是20h、22h、 24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h 或 50h。
[0025] 在本發(fā)明的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，離心的溫度可以是2 (TC、21°C、 22°C、23°C、24t：、25t：、26t：、27t：、28t：、29t：*3(rC。
[0026] 在本發(fā)明的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，離心的轉(zhuǎn)速可以是5100rpm、 5200rpm、5500rpm、5800rpm、6200rpm、6500rpm、6800rpm、7000rpm、7500rpm、8000rpm、 8200rpm、8500rpm、8900rpm、9100rpm、9500rpm 或 9800rpm〇
[0027] 在本發(fā)明的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法中，離心的時間可以是5min、6min、 7min、8min、9min、lOmin、llmin、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min 或 20min〇
[0028] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，本發(fā)明載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法并不必然依賴 于上述詳細(xì)工藝及參數(shù)，此處給出的僅僅是較優(yōu)的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)其 經(jīng)驗將所述核酸納米結(jié)構(gòu)與所述抗腫瘤藥物接觸形成所述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)。
[0029] 在本發(fā)明一個具體實施方案中，載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法包括以下步驟：
[0030] (1)將M13噬菌體基因組DNA與所述人工合成的寡核苷酸序列按摩爾比為1:2? 1:50、優(yōu)選1:5?1:30、更優(yōu)選1:10?1:25、特別優(yōu)選1:20混合于溶液中，從90?100°C、 優(yōu)選92?98 °C、更優(yōu)選95 °C開始，逐漸降溫退火至15?25 °C、優(yōu)選18?22 °C、更優(yōu)選 20°C，降溫退火即孵育時間為8?28h、優(yōu)選10?26h、更優(yōu)選12?24h，得到核酸納米結(jié) 構(gòu)；
[0031] (2)將步驟（1)得到的核酸納米結(jié)構(gòu)與阿霉素按照摩爾比為I: IO7?I: IO5數(shù)量級、 優(yōu)選I: IO6數(shù)量級混合于溶液中，在20?30°C、優(yōu)選22?28 °C、更優(yōu)選24?26 °C，30? 120rpm、優(yōu)選60?90rpm條件下，振蕩孵育20?50h、優(yōu)選24?48h ;
[0032] (3)將步驟（2)得到的溶液在20?30°C、優(yōu)選22?28°C、更優(yōu)選24?26°C條件 下，5000?lOOOOrpm、優(yōu)選7000?8000rpm離心5?20min、優(yōu)選10?15min，棄上清，得 到所述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)。
[0033] 在第五方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括如第三方面所述 的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)，任選地，還包括藥學(xué)上可接受的載體；優(yōu)選地，所述藥物組合物的活 性成分為所述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)或其在藥學(xué)上可接受的鹽、酯或溶劑合物，用于治療和/ 或預(yù)防腫瘤，或者抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
[0034] 在第六方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的核酸納米結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物的 載體的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺 細(xì)胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的至少一種。
[0035] 在第七方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的核酸納米結(jié)構(gòu)或如第三方面所述 的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)在制備用于治療和/或預(yù)防腫瘤或者抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物中的 應(yīng)用，優(yōu)選地，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細(xì)胞癌、 前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的至少一種。
[0036] 本發(fā)明中，術(shù)語"訂書釘鏈"、"寡核苷酸序列"和"短鏈核苷酸序列"雖然是不同 的名詞，但其含義和其所指對象的功能是相同的，即均指通過堿基互補(bǔ)配對原則對腳手架 鏈起到輔助折疊作用以使其自組裝形成特定二維和/或三維結(jié)構(gòu)的短的核苷酸序列，稱為 "訂書釘鏈"是一種形象的表達(dá)，意指其像訂書釘一樣將腳手架鏈的不同位點(diǎn)釘在一起。
[0037] 本發(fā)明中，術(shù)語"腳手架鏈"是指長的DNA或RNA序列，尤其是指單鏈DNA序列，其 是形成核酸納米結(jié)構(gòu)的主體原料，在訂書釘鏈的輔助折疊作用下自組裝形成特定二維和/ 或三維結(jié)構(gòu)。
[0038] 本發(fā)明中，術(shù)語"核酸納米結(jié)構(gòu)"是指腳手架鏈在訂書釘鏈的輔助折疊作用下自組 裝形成的特定二維和/或三維結(jié)構(gòu)，需要說明的是，該名稱雖然含有"納米"一詞，但其實際 所指的對象并不一定要限定為納米級別，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，雖然納米級別的顆 粒作為藥物載體是常見的，但也有些藥物載體能夠達(dá)到微米的級別，因此，本發(fā)明納米只是 一個統(tǒng)稱，核酸納米結(jié)構(gòu)實際上代表納米或微米級別的具備本發(fā)明技術(shù)特征的結(jié)構(gòu)。
[0039] 本發(fā)明中，術(shù)語"載藥核酸納米結(jié)構(gòu)"是指核酸納米結(jié)構(gòu)負(fù)載和/或嵌入相應(yīng)藥物 (本發(fā)明特指抗腫瘤藥物）或其活性成分形成的結(jié)構(gòu)復(fù)合體。
[0040] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明通過DNA折紙技術(shù)，即腳手架鏈與輔助折疊的訂書 釘鏈通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交完成自組裝而形成核酸納米結(jié)構(gòu)，該核酸納米結(jié)構(gòu)可 作為抗腫瘤藥物的載體，細(xì)胞水平和動物水平的實驗證明其不但能夠保證其運(yùn)載的抗腫瘤 藥物的抗腫瘤活性，而且能夠提高抗腫瘤藥物的靶向性，使抗腫瘤藥物在腫瘤組織中富集， 顯著降低抗腫瘤藥物由于非特異性而產(chǎn)生的全身毒性。本發(fā)明制備所述核酸納米結(jié)構(gòu)的方 法，只需要按照合適的比例將輔助折疊的訂書釘鏈加入到腳手架鏈溶液中，混勻后，在適宜 的溫度范圍內(nèi)降溫以實現(xiàn)自組裝，不需要太多的人為干預(yù)，因此工藝簡單、成本低且方便易 行。本發(fā)明制備的核酸納米結(jié)構(gòu)嵌入抗腫瘤藥物可以制成載藥核酸納米結(jié)構(gòu)，作為抗腫瘤 藥物組合物的活性成分，用于治療和/或預(yù)防腫瘤或者抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1為三角形的未裝載阿霉素的核酸納米結(jié)構(gòu)及裝載阿霉素的載藥核酸納米結(jié) 構(gòu)的原子力顯微鏡照片，標(biāo)尺為lOOnm。
[0042] 圖2為阿霉素組及裝載阿霉素的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)組對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的 抑制效果的對比圖，其中藥物濃度均指阿霉素的濃度。
[0043] 圖3為阿霉素組及裝載阿霉素的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)組在移植瘤中匯聚的對比圖， 標(biāo)尺為50 μ m。
[0044] 圖4為對照組(生理鹽水組)、阿霉素組及裝載阿霉素的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)組的荷 瘤鼠腫瘤體積的對比圖。
[0045] 圖5為對照組、阿霉素組、核酸納米結(jié)構(gòu)組及裝載阿霉素的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)組 的荷瘤鼠體重的對比圖。

【具體實施方式】
[0046] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理 解，以下實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本 發(fā)明的范圍。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實驗材料，如無特殊說明， 均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。下述實施例中的定量實驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié) 果取平均值。
[0047] 本發(fā)明所用的器材和材料：
[0048] 器材：Mastercycler Pro 梯度 PCR 儀（Eppendorf，德國），5810R 小型高速離心機(jī) (Eppendorf，德國)，UV-2450紫外-可見分光光度計（島津，日本)，全波長酶標(biāo)儀（TECAN，瑞 士)，Veeco MultiMode8原子力顯微鏡（Veeco,美國），突光顯微鏡（Olympus,日本)。
[0049] 原料：短鏈核苷酸序列（訂書釘鏈，Nature，2006,440, 297-302)購自上海英濰捷基 生物技術(shù)有限公司，M13噬菌體基因組DNA購自New England Biolabs公司，阿霉素購自北 京華奉聯(lián)博科技有限公司。
[0050] 試劑：實驗中所用的緩沖溶液有TAE/Mg2+緩沖溶液（pH8. 0 )和PBS緩沖溶液 (ρΗ7·4)。其中，ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩沖溶液（ρΗ8·0)的組分為：4Xl(T 2mol I^TrisJXK^mol 171乙酸，2.0父10-3111〇117屯0了4和1.25\10-2111〇117 1醋酸鎂；1\?85緩沖溶液化!17.4)的組 成為：136.9Xl(T3mol 1^(8. OOg ONaCU 68Xl(T3mol rHOJOg Οκα,ΙΤδΧΚΓ^ιοΙ Γ1 (L 56g Γ1) Na2HPO4 ·Η20 和 L 47 X l(T3mol Γ1 ((λ 20g Γ1) KH2PO4 ;這些緩沖溶液所用的試 劑均為分析純，購自Sigma-Aldrich公司。細(xì)胞活力實驗所使用的細(xì)胞計數(shù)試劑盒購自日 本同仁化學(xué)。
[0051] 細(xì)胞：人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞 中心。
[0052] 培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清，細(xì)胞接種于IOOmm2培養(yǎng)皿中，置于 5%C0 2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度80%左右時傳代；所用培養(yǎng)基和胎牛血清購 自 ThermoFisher Scientific 公司。
[0053] BALB/c裸鼠：購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。
[0054] 實施例1制備核酸納米結(jié)構(gòu)和載藥核酸納米結(jié)構(gòu)
[0055] 將50 μ L終濃度為5nM的M13噬菌體基因組DNA與100 μ L終濃度為50nM的訂書 釘鏈混合溶液充分混勻在ImL I XTAE/Mg2+ (pH=8. 0)溶液中，從95°C開始，逐漸降溫退火 至20°C，退火孵育時間為12?24h，制備得到具有預(yù)先設(shè)計幾何外形的核酸納米結(jié)構(gòu)。
[0056] 取5mM的阿霉素溶液ImL加入到5nM的核酸納米結(jié)構(gòu)溶液ImL中，混合均勻，在 22?28°C，70rpm的條件下，振蕩孵育24h裝載阿霉素。
[0057] 將上述裝載阿霉素的混合溶液在22?28°C條件下，7000?8000rpm離心10? 15min，以去除上清液中未裝載的阿霉素，得到裝載阿霉素核酸納米結(jié)構(gòu)，同時通過測定上 清液中未裝載的阿霉素含量，利用如下計算式計算確定已裝載阿霉素的濃度。
[0058] DOX裝載量=DOX總投入量-DOX未裝載量，（D0X為阿霉素）。
[0059] 使用原子力顯微鏡觀察并拍攝上述核酸納米結(jié)構(gòu)和載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的照片，由 圖1可見裝載阿霉素的過程對于核酸納米結(jié)構(gòu)沒有明顯的影響。
[0060] 實施例2載藥核酸納米結(jié)構(gòu)對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制效果
[0061] 培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞至對數(shù)生長期，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃 度為5 X IO4個/mL，接種96孔板，每孔100 μ L。將96孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜， 吸出培養(yǎng)液，加入不同濃度（阿霉素0. 01，0. 1，1，10,100 μ Μ)的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)，每個濃 度組5個復(fù)孔,另選5組分別加入不同濃度（0. 01,0. 1,1,10,100 μ Μ)阿霉素。另設(shè)一組為 空白對照組(接種細(xì)胞，不加藥)。將已加藥處理的MDA-MB-231細(xì)胞繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，吸棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入0. 5mg/mL的CCK-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基）-3-(4-硝 苯基）-5-(2, 4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽）溶液100 μ L，繼續(xù)孵育2h，用酶標(biāo)儀（450nm) 檢測每孔的OD值。根據(jù)OD值計算出腫瘤細(xì)胞抑制率，計算公式為
[0062] 抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值。
[0063] 由圖2可見核酸納米結(jié)構(gòu)能夠運(yùn)載抗腫瘤藥物阿霉素，在細(xì)胞水平上具有抑制腫 瘤細(xì)胞增殖的作用，在相同阿霉素濃度條件下，其抑制效果與單獨(dú)阿霉素的抑制效果相當(dāng)。
[0064] 實施例3載藥核酸納米結(jié)構(gòu)在腫瘤組織中的靶向性富集
[0065] 培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞至對數(shù)生長期，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃 度為I X IO7個/mL，取100 μ L原位接種于5-6周雌性BALB/c裸鼠右下乳房，進(jìn)行原位乳 腺移植瘤建模。建模1周后，分為3組進(jìn)行給藥處理，分別為生理鹽水組，阿霉素組(阿霉素 6mg/kg/天)，載藥核酸納米結(jié)構(gòu)組（即裝載阿霉素的核酸納米結(jié)構(gòu)，給藥含量相當(dāng)于阿霉素 6mg/kg/天，核酸納米結(jié)構(gòu)0. 071mg/kg/天)，靜脈注射藥物。24小時后，摘取腫瘤進(jìn)行冰凍 切片，在熒光顯微鏡綠光激發(fā)（450?520nm激發(fā)，優(yōu)選激發(fā)波長為480nm)下，觀察腫瘤組 織切片中藥物的紅色熒光。
[0066] 通過冰凍切片的熒光照片（圖3)，可見阿霉素在腫瘤部分有很弱的熒光信號，說明 小分子藥物本身基本對于腫瘤組織沒有靶向性，載藥核酸納米結(jié)構(gòu)在腫瘤部分有很強(qiáng)的熒 光信號，說明載藥核酸納米結(jié)構(gòu)具有明顯的腫瘤靶向性。
[0067] 實施例4載藥核酸納米結(jié)構(gòu)對荷瘤鼠腫瘤治療的藥效及毒性研究 [0068] 培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞至對數(shù)生長期，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃 度為I X IO7個/mL，取100 μ L原位接種于5-6周雌性BALB/c裸鼠右下乳房，進(jìn)行原位乳 腺移植瘤建模。建模1周后，分為4組進(jìn)行給藥處理，分別為生理鹽水組，阿霉素組(阿霉素 6mg/kg/天)，核酸納米結(jié)構(gòu)組(核酸納米結(jié)構(gòu)0. 071mg/kg/天)，載藥核酸納米結(jié)構(gòu)組（即裝 載阿霉素的核酸納米結(jié)構(gòu)組，給藥含量相當(dāng)于阿霉素6mg/kg/天，核酸納米結(jié)構(gòu)0. 071mg/ kg/天)，連續(xù)靜脈注射12天。隔日稱量荷瘤鼠體重，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長度和寬度，計 算腫瘤大小，計算公式為：
[0069] 腫瘤大小=Π XaXb2/6, Π 為圓周率，a為腫瘤長度，b為腫瘤寬度。
[0070] 由圖4可見，對照組(生理鹽水組)荷瘤鼠的腫瘤體積隨時間延長持續(xù)增大，單獨(dú)阿 霉素組和載藥核酸納米結(jié)構(gòu)組荷瘤鼠的腫瘤體積隨給藥時間延長而縮小，但阿霉素組荷瘤 鼠未能完成全部給藥周期而死亡(實驗平行作3次均是相同結(jié)果)，反應(yīng)出單獨(dú)阿霉素嚴(yán)重 的副作用。該結(jié)果進(jìn)一步證明載藥核酸納米結(jié)構(gòu)具有良好的抗腫瘤作用，而且能夠降低抗 腫瘤藥物(阿霉素）由于非特異性而產(chǎn)生的全身毒性。
[0071] 實驗結(jié)束時，進(jìn)一步檢測每組荷瘤鼠的血常規(guī)指標(biāo)(表1 )。
[0072] 表1荷瘤鼠血常規(guī)指標(biāo)
[0073]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于運(yùn)載抗腫瘤藥物的核酸納米結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述核酸納米結(jié)構(gòu)是通過 DNA折紙技術(shù)構(gòu)建的任意二維和/或三維納米結(jié)構(gòu)，具體是腳手架鏈與輔助折疊的訂書釘 鏈通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交完成自組裝而形成的核酸納米結(jié)構(gòu)；優(yōu)選地，所述抗腫 瘤藥物為順鉬、環(huán)磷酰胺、紫杉醇和阿霉素中的一種或多種，優(yōu)選阿霉素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸納米結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述核酸納米結(jié)構(gòu)是M13噬菌 體基因組DNA、基于M13噬菌體基因組DNA進(jìn)行改造的各種單鏈環(huán)狀DNA、Lambda噬菌體基 因組DNA、通過PCR得到的M13噬菌體基因組DNA片段或Lambda噬菌體基因組DNA片段和 /或利用體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA片段與人工合成的寡核苷酸序列通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行 雜交完成自組裝而形成的，優(yōu)選M13噬菌體基因組DNA與人工合成的寡核苷酸序列通過堿 基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交完成自組裝而形成的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸納米結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述核酸納米結(jié)構(gòu)形狀呈三 角形、長方形、納米管狀、四面體、巴基球形、納米片狀、帶狀或籠狀，優(yōu)選為三角形。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一項所述的核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，將輔助折 疊的訂書釘鏈加入到腳手架鏈溶液中，混勻后，從溫度90?100°C、優(yōu)選92?98°C、更優(yōu)選 95°C開始，逐漸降溫退火至溫度15?25°C、優(yōu)選18?22°C、更優(yōu)選20°C，降溫退火即孵育 時間為8?28h、優(yōu)選10?26h、更優(yōu)選12?24h，得到所述核酸納米結(jié)構(gòu)；優(yōu)選地，所述腳 手架鏈與所述訂書釘鏈的摩爾比為1:2?1:50,優(yōu)選1:5?1:30,更優(yōu)選1:10?1:25,特 別優(yōu)選1:20。
5. -種載藥核酸納米結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)包括如權(quán)利要求1至3 中任一項所述的核酸納米結(jié)構(gòu)及嵌入所述核酸納米結(jié)構(gòu)中的抗腫瘤藥物；優(yōu)選地，所述抗 腫瘤藥物為順鉬、環(huán)磷酰胺、紫杉醇和阿霉素中的一種或多種，優(yōu)選阿霉素。
6. 如權(quán)利要求5所述的載藥核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，將所述核酸納米 結(jié)構(gòu)與所述抗腫瘤藥物接觸形成所述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)；優(yōu)選地，將所述核酸納米結(jié)構(gòu)的 溶液與所述抗腫瘤藥物的溶液混合，振蕩孵育，離心，棄上清，得到所述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)； 更優(yōu)選地，將所述核酸納米結(jié)構(gòu)與所述抗腫瘤藥物按照摩爾比為1: 1〇7?1: 1〇5數(shù)量級、優(yōu) 選1:106數(shù)量級混合于溶液中，在溫度20?30°C、優(yōu)選22?28°C、更優(yōu)選24?26°C，轉(zhuǎn) 速30?120rpm、優(yōu)選60?90rpm條件下，振蕩孵育20?50h、優(yōu)選24?48h，然后在溫度 20?30°C、優(yōu)選22?28°C、更優(yōu)選24?26°C條件下，轉(zhuǎn)速5000?lOOOOrpm、優(yōu)選7000? 8000rpm離心5?20min、優(yōu)選10?15min，棄上清，得到所述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 將M13噬菌體基因組DNA與所述人工合成的寡核苷酸序列按摩爾比為1:2?1:50、 優(yōu)選1:5?1:30、更優(yōu)選1:10?1:25、特別優(yōu)選1:20混合于溶液中，從溫度90?100°C、 優(yōu)選92?98 °C、更優(yōu)選95 °C開始，逐漸降溫退火至溫度15?25 °C、優(yōu)選18?22 °C、更優(yōu) 選20°C，降溫退火即孵育時間為8?28h、優(yōu)選10?26h、更優(yōu)選12?24h，得到核酸納米 結(jié)構(gòu)； (2) 將步驟（1)得到的核酸納米結(jié)構(gòu)與阿霉素按照摩爾比為1:107?1:105數(shù)量級、優(yōu) 選1:106數(shù)量級混合于溶液中，在溫度20?30°C、優(yōu)選22?28°C、更優(yōu)選24?26°C，轉(zhuǎn)速 30?120rpm、優(yōu)選60?90rpm條件下，振蕩鮮育20?50h、優(yōu)選24?48h ; (3) 將步驟（2)得到的溶液在溫度20?30°C、優(yōu)選22?28°C、更優(yōu)選24?26°C條件 下，轉(zhuǎn)速5000?lOOOOrpm、優(yōu)選7000?8000rpm離心5?20min、優(yōu)選10?15min，棄上 清，得到所述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)。
8. -種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括如權(quán)利要求5所述的載藥核酸 納米結(jié)構(gòu)，任選地，還包括藥學(xué)上可接受的載體；優(yōu)選地，所述藥物組合物的活性成分為所 述載藥核酸納米結(jié)構(gòu)或其在藥學(xué)上可接受的鹽、酯或溶劑合物，用于治療和/或預(yù)防腫瘤， 或者抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
9. 如權(quán)利要求1至3中任一項所述的核酸納米結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物的載體的應(yīng)用，優(yōu) 選地，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細(xì)胞癌、前列腺 癌和非何金氏淋巴瘤中的至少一種。
10. 如權(quán)利要求1至3中任一項所述的核酸納米結(jié)構(gòu)或如權(quán)利要求5所述的載藥核 酸納米結(jié)構(gòu)在制備用于治療和/或預(yù)防腫瘤或者抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選 地，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細(xì)胞癌、前列腺癌 和非何金氏淋巴瘤中的至少一種。
【文檔編號】A61P35/00GK104368004SQ201310351835
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月13日
【發(fā)明者】丁寶全, 蔣喬, 王金業(yè), 杜洋, 張倩 申請人:國家納米科學(xué)中心, 中國科學(xué)院自動化研究所