專利名稱：小核酸的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干擾RNA(例如微小RNA(miRNA)和小干擾RNA(siRNA))和其它短核酸分子的組合物及其檢測(cè)和表征地方法。更加特別地，本發(fā)明涉及干擾RNA表達(dá)的檢測(cè)和定量分析的改進(jìn)的方法。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了miRNA和siRNA的變異體和類型的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
微小RNA(miRNA)是一種新類型的非編碼RNA，無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物基因組中它們被編碼為短的反向重復(fù)序列(Ambros，(2001)細(xì)胞(Cell)107，823-826；Moss(2002)當(dāng)代生物學(xué)(Curr Biol)12，R138-R140)。miRNA是靶mRNA翻譯和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)子，盡管多數(shù)靶mRNA有待鑒定。miRNA通過結(jié)合于3′端非翻譯區(qū)域(UTRs)中反義互補(bǔ)位點(diǎn)序列特異性地控制靶mRNA的翻譯(Ambros，如前；Moss，如前；Lagos-Quintana等人，(2001)科學(xué)(Science)294，853-858；Lau等人，(2001)科學(xué)(Science)294，858-862；Lee等人，(2001)科學(xué)(Science)294，862-864)。
一些miRNA，例如let-7RNA、miR-1、miR-34、miR-60和miR-87，在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間是高度保守的，暗示它們可以識(shí)別推測(cè)保守功能的多重位點(diǎn)和/或多重靶(Lagos-Quintana等人，如前；Lau等人，如前；Lee等人，如前；Pasquinelli等人，(2000)自然(Nature)40886)。小暫時(shí)RNA(stRNA)lin-4和let-7代表了通過華麗新小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的基因分析鑒定出來的miRNA的一個(gè)亞型(subclass)，它們是受發(fā)育調(diào)節(jié)的并且它們自己控制發(fā)育程序，例如神經(jīng)再接(neuronal rewiring)的時(shí)間選擇、Daucer幼蟲的形成、陰戶形成以及皮下細(xì)胞的終末分化。
miRNA一般是從60或70個(gè)核苷酸折返(foldback)RNA前體結(jié)構(gòu)剪切來的，它們有時(shí)候在miRNA前體的表達(dá)開始時(shí)(Grishok等人，(2001)細(xì)胞(Cell)106，23-34；Hutvagner等人(2001)科學(xué)(Science)93，834-838；Ketting等人，(2001)基因發(fā)育(Genes Dev)15，2654-2659)或非常豐富的miRNA的表達(dá)過程中(Lagos-Quintana等人，如前；Lau等人，如前；Lee等人，如前)被檢測(cè)到。通常，只有發(fā)夾前體分子的一條鏈被剪切并且蓄積，推測(cè)大概是因?yàn)樗幌嚓P(guān)蛋白質(zhì)保護(hù)而免受RNA降解。這些推測(cè)的蛋白質(zhì)可以介導(dǎo)翻譯的抑制。miRNA前體處理反應(yīng)需要Dicer RNAsein和Argonaute家族成員(Grishok等人，如前；Hutvagner等人，如前；Ketting等人，如前)。
除了它們對(duì)基因表達(dá)的影響外，這些通常在21-22個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的小RNA，可以在治療和藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域內(nèi)找到用途，例如作為藥物靶或作為藥劑。因而，在一些情形下，了解細(xì)胞中大約多少個(gè)每種miRNA存在是重要的。在一些情況下，更進(jìn)一步地比較不同組織類型中或例如化學(xué)或物理干預(yù)的刺激劑應(yīng)用之前和之后miRNA的水平是重要的。因?yàn)橛嘘P(guān)的siRNA和miRNA在細(xì)胞中可以以很低的量存在，期望既敏感又特異的檢測(cè)方法。此外，對(duì)于某些應(yīng)用，鑒定適合于高通量篩選的方法例如均相測(cè)定法、復(fù)合測(cè)定法或適合于高度平行自動(dòng)化操作和有限制的溫度變化的那些方法是有利的。
盡管miRNA在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中有很重要的作用，一直缺乏miRNA表達(dá)的檢測(cè)和定量分析的有效技術(shù)。至今，用于miRNA定量分析的主要方法以凝膠電泳為基礎(chǔ)。所述miRNA通過Northern印跡或通過放射性抗RNase雙體(duplexes)的存在進(jìn)行檢測(cè)。Northern印跡和芯片雜交法具有相對(duì)低的分析敏感性(Krichevsky等人2003)，所以需要微克質(zhì)量的RNA用于檢測(cè)；此外，小RNA轉(zhuǎn)移到過濾器能夠引發(fā)定量分析重現(xiàn)性的問題，并且一般不可修正用于高通量。此外，基于RNase抗性的檢測(cè)方法需要高放射性的探針。更進(jìn)一步地，只是基于探針雜交的方法不會(huì)提供序列密切相關(guān)的同型物之間的足夠的區(qū)別。替代的方法包括克隆所述miRNA，然后對(duì)所述插入體測(cè)序。雖然這個(gè)方法適合于分辨密切相關(guān)的miRNA種類之間單個(gè)堿基的差別，但是它耗時(shí)且耗力。
象miRNA一樣，小干擾RNA(siRNA)是經(jīng)由稱為RNA干擾(RNAi)(Cullen，B.R.，自然免疫學(xué)(Nature Immunology)，3597-599(2002))的反應(yīng)參與細(xì)胞防御的小RNA分子，例如抗病毒RNA。一類siRNA通過Dicer酶和RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)蛋白質(zhì)復(fù)合物的作用而產(chǎn)生，作為響應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)雙鏈RNA存在的所述RNAi的一部分(Khvorova，A.等人，細(xì)胞(cell)115209-216(2003))。另一類siRNA是合成的，包含通常有特征性的二核苷酸伸出端的21-23個(gè)核苷酸的短雙體，經(jīng)由轉(zhuǎn)染或從引入載體的表達(dá)直接引入細(xì)胞(Elbashir，S.M.等人，歐洲分子生物學(xué)會(huì)雜志(EMBO J.)206877-6888(2001))(Paul，C.P.等人，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)20505-508(2002)，美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/01481519A1，為了所有的目的此處整體引用作為參考)。在一些情況下，siRNA似乎一直是明確的序列，使得它們?cè)诠δ芎徒M成上與miRNA相似(Elbashir，S.M.等人，如前)。所需要的是檢測(cè)和定量分析miRNA和siRNA水平有效的并且精確的方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及小核酸(例如干擾RNA和其它短核酸分子)的組合物及其檢測(cè)和表征的方法。更加特別地，本發(fā)明涉及干擾RNA表達(dá)的檢測(cè)和定量分析的改進(jìn)的方法。
例如，本發(fā)明提供了一種方法，包括為了產(chǎn)生一個(gè)檢測(cè)結(jié)構(gòu)，將至少一種核酸(例如含有不互補(bǔ)于干擾RNA的序列的那個(gè)核酸)雜交于干擾RNA靶，以及檢測(cè)所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，所述干擾RNA靶是miRNA。在其它的實(shí)施方案中，所述干擾RNA靶是siRNA。在一些實(shí)施方案中，所述siRNAs是雙鏈。
在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)包含侵入性切割結(jié)構(gòu)(invasivecleavage structure)。例如，在一些實(shí)施方案中，所述核酸包含為了形成聯(lián)合miRNA的侵入性切割結(jié)構(gòu)而配置(configured)的第一和第二寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸包含為了形成聯(lián)合所述miRNA的侵入性切割結(jié)構(gòu)而配置的第一寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述3′部分為了雜交于所述靶序列而配置，并且其中所述5′部分為了不雜交于所述靶序列而配置。在一些采用第二寡核苷酸的實(shí)施方案中，所述第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述5′部分為了雜交于所述靶序列而配置，并且其中所述3′部分為了不雜交于所述靶序列而配置。在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)步驟包括INVADER試驗(yàn)的使用。
在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)包含雜交于所述小RNA的環(huán)狀寡核苷酸以產(chǎn)生環(huán)形檢測(cè)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)步驟包含滾環(huán)復(fù)制試驗(yàn)。
在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)步驟包括檢測(cè)試驗(yàn)的使用，包括但不限于測(cè)序試驗(yàn)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)、雜交試驗(yàn)、采用互補(bǔ)于突變的探針的雜交試驗(yàn)、微陣列試驗(yàn)、珠子陣列試驗(yàn)、引物延伸試驗(yàn)、酶錯(cuò)配切割試驗(yàn)、分支雜交試驗(yàn)、NASBA試驗(yàn)、分子信標(biāo)試驗(yàn)、循環(huán)探針試驗(yàn)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)、侵入性切割結(jié)構(gòu)試驗(yàn)、ARMS試驗(yàn)以及夾心雜交試驗(yàn)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述檢測(cè)步驟在細(xì)胞裂解物中進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包含檢測(cè)第二核酸靶。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二核酸靶是RNA。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二核酸靶是U6 RNA或GADPH mRNA。
在一些實(shí)施方案中，用于形成檢測(cè)結(jié)構(gòu)的核酸包含具有充分互補(bǔ)于小RNA的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的模板，以便于允許所述RNA雜交于所述模板并且在延伸反應(yīng)中被延伸。在一些實(shí)施方案中，所述延伸反應(yīng)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中一個(gè)或多個(gè)RNA被用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物。在一些這樣的實(shí)施方案中，為了提供聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物，單一類型的RNA結(jié)合于模板上的兩個(gè)位置。在其它的實(shí)施方案中，兩個(gè)或兩個(gè)以上的RNA被用作引物。在這樣的實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)表示樣品中所述的兩個(gè)或多個(gè)RNA的存在(即miRNA復(fù)合試驗(yàn)(miRNA multiplex assay))。相似的方法可被用于連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，這里所述miRNA被用作連接的寡核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包含多種miRNA的檢測(cè)。在一些這樣的實(shí)施方案中，多種miRNA包含相同miRNA的多態(tài)性。在其它的實(shí)施方案中，多種miRNA包含不同的miRNA(例如Let-7、miR-1、miR-1d、miR-135、miR-15、miR-16、miR-124a或miR125b)。
本發(fā)明也提供了用于實(shí)施上面方法中任何一個(gè)的試劑盒。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含為了當(dāng)雜交于RNA靶序列時(shí)形成檢測(cè)結(jié)構(gòu)而配置的核酸的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒為了檢測(cè)miRNA而配置。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒為了檢測(cè)Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR1b、miR-124a或miR125b的miRNA而配置。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒為了共檢測(cè)第二RNA靶和miRNA靶而配置。


圖1顯示單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)兩個(gè)不同等位基因(例如一個(gè)核苷酸的不同)的INVADER寡核苷酸、探針寡核苷酸和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)盒的示意圖。
圖2顯示用于本發(fā)明一些實(shí)施方案中所用的示例性檢測(cè)結(jié)構(gòu)。
圖3顯示用于本發(fā)明一些實(shí)施方案中所用的第二示例性檢測(cè)結(jié)構(gòu)。
圖4顯示用于本發(fā)明一些實(shí)施方案中所用的第三示例性檢測(cè)結(jié)構(gòu)。
圖5顯示用于本發(fā)明的示例性寡核苷酸。所述靶miRNA的堿基為加下劃線的小寫。探針或INVADER寡核苷酸中的DNA殘基是正常字體的。小寫字體指出了2′-氧-甲基的殘基。
圖6顯示let-7的溫度最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖7顯示let-7的溫度最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖8顯示let-7的檢測(cè)限(LOD)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖9顯示使用let-7 miRNA的交叉反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖10顯示miR-1 LOD實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖11顯示使用let-7 miRNA的CLEAVASE酶IX和XII比較的結(jié)果。
圖12顯示來自各種微生物的U6 RNA序列的部分序列比對(duì)。
圖13顯示mir-135的溫度最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖14顯示mir-135 LOD實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖15含有細(xì)胞裂解物中l(wèi)et-7的檢測(cè)得到的平均計(jì)數(shù)的圖形表示。
圖16顯示經(jīng)過或者未經(jīng)過RNAse A處理的細(xì)胞裂解物中miRNA和mRNA的結(jié)果。
圖17顯示比較包括了全長(zhǎng)的對(duì)于截短的捕集寡核苷酸的作用之侵入性切割試驗(yàn)的結(jié)果。
圖18顯示使用圖16中描述的試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖19顯示了使用10聚體探針和12聚體INVADER寡核苷酸設(shè)計(jì)的溫度最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖20顯示比較了兩個(gè)替代性寡核苷酸設(shè)計(jì)的LOD實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖21顯示比較了將探針和INVADER寡核苷酸中一些或所有2′-氧-甲基殘基取代為2′-脫氧殘基的作用的結(jié)果。
圖22顯示檢測(cè)miR-124a的侵入性切割試驗(yàn)的結(jié)果。
圖23顯示檢測(cè)分離自20個(gè)不同組織類型的總RNA中五種不同miRNA種類的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖24顯示測(cè)試改變的探針和寡核苷酸長(zhǎng)度對(duì)miRNA檢測(cè)的作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖25顯示為了siRNA檢測(cè)示例性侵入性切割寡核苷酸設(shè)計(jì)。小寫殘基表示2′-O-甲基。
定義
為了方便對(duì)本發(fā)明的理解，許多術(shù)語和短語定義如下
如此處使用地，術(shù)語“miRNA”指的是微小RNA。如此處使用的，術(shù)語“miRNA靶序列”指的是待檢測(cè)的miRNA(例如，在其它核酸的存在下)。在一些實(shí)施方案中，miRNA靶序列是miRNA的變異體。
如此處使用地，術(shù)語“RNA檢測(cè)結(jié)構(gòu)”指的是通過核酸(例如，寡核苷酸)雜交于RNA靶，例如miRNA或siRNA，而形成的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，所述核酸是單核酸(例如，有一個(gè)小區(qū)域(或一些區(qū)域)同源于所述miRNA的較大的核酸)。在其它的實(shí)施方案中，所述核酸包含兩種核酸(例如，雜交于所述miRNA以形成發(fā)夾(例如，單或雙發(fā)夾)結(jié)構(gòu)的核酸)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，miRNA檢測(cè)結(jié)構(gòu)是能夠使用已知的核酸檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)的，包括但不限于此處公開的那些結(jié)構(gòu)。
在一些實(shí)施方案中，RNA檢測(cè)結(jié)構(gòu)在雜交步驟之后被更進(jìn)一步地修飾。例如，在一些實(shí)施方案中，雜交于所述RNA的所述核酸提供了用于通過核酸聚合酶延伸所述RNA的模板。所述RNA雜交于所述核酸并且然后使用所述聚合酶進(jìn)行延伸。在其它的實(shí)施方案中，所述核酸起額外的核酸與所述RNA雜交和連接的模板作用。
術(shù)語“siRNA”指的是短干擾RNA。在一些實(shí)施方案中，siRNA包含一個(gè)雙體或雙鏈區(qū)域，這里所述雙鏈區(qū)域的每一個(gè)鏈大約18至25個(gè)核苷酸長(zhǎng)；所述雙鏈區(qū)域能短至16個(gè)并長(zhǎng)至29個(gè)堿基對(duì)，這里所述長(zhǎng)度由所述反義鏈決定。通常siRNA在每一個(gè)鏈的3′末端含有大約兩個(gè)至四個(gè)非配對(duì)的核苷酸。siRNA似乎在非脊椎動(dòng)物和在脊椎動(dòng)物中起引發(fā)RNA干擾以及在植物中在轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程中起引發(fā)序列特異性RNA降解的關(guān)鍵中間物的作用。至少siRNA的雙體或雙鏈區(qū)域的一條鏈基本上同源于或基本上互補(bǔ)于靶RNA分子?；パa(bǔ)于靶RNA分子的鏈?zhǔn)恰胺戳x”鏈；同源于靶RNA分子的鏈?zhǔn)恰坝辛x”鏈并且也互補(bǔ)于所述siRNA反義鏈。所述雙鏈區(qū)的一條鏈不需要是相對(duì)鏈的精確長(zhǎng)度，因而，一條鏈可以具有比相對(duì)鏈至少少1個(gè)核苷酸，形成相對(duì)鏈中的“泡”或相對(duì)鏈至少一個(gè)未配對(duì)的堿基。所述雙鏈區(qū)域的一個(gè)鏈不需要精確地互補(bǔ)于所述相對(duì)鏈；因而，所述鏈(優(yōu)選地所述有義鏈)可具有至少一個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)。
siRNA也含有額外的序列；這樣的序列的非限制性實(shí)例包括連接序列或環(huán)，它們將所述雙體區(qū)域的兩個(gè)鏈連接起來。siRNA的這個(gè)形式可以指的是“si樣RNA”、“短發(fā)夾siRNA”，(這里所述的短指的是所述siRNA的雙體區(qū)域)或“發(fā)夾siRNA”。siRNA中存在的額外序列的另外的非限制性實(shí)例包括莖和其它折疊結(jié)構(gòu)。所述額外序列可以有或可以沒有已知的功能；這樣的功能之非限制性實(shí)例包括siRNA分子增加的穩(wěn)定性，或者提供細(xì)胞目的(destination)信號(hào)。
如此處使用地，術(shù)語“研究對(duì)象”和“患者”指的是任何生物體，包括植物、微生物和動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物例如狗、貓、家畜和人)。
如此處使用地，術(shù)語“INVADER試驗(yàn)試劑”或“侵入性切割試驗(yàn)試劑”指的是檢測(cè)靶序列的一個(gè)或多個(gè)試劑，所述試劑包含在靶序列存在下能夠形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑更進(jìn)一步地包含檢測(cè)侵入性切割結(jié)構(gòu)(例如切割試劑)存在的試劑。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含第一和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含互補(bǔ)于靶核酸第一區(qū)域的5′部分，所述5′部分互補(bǔ)于位于第一部分下游并且鄰近第一部分的靶核酸的第二區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，第二寡核苷酸的所述3′部分包含不互補(bǔ)于靶核酸的3′末端核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二寡核苷酸的3′部分由不互補(bǔ)于靶核酸的單核苷酸組成。在一些實(shí)施方案中，第一和第二寡核苷酸互相共價(jià)偶聯(lián)(例如通過連接子)。
在一些實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑更進(jìn)一步地包含固相支持物。例如，在一些實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)試劑的一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸(例如第一和/或第二寡核苷酸，橋接的或非橋接的)附著于所述固相支持物。在一些實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑更進(jìn)一步地包含緩沖溶液。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖溶液包含二價(jià)陽離子的來源(例如Mn2+和/或Mg2+離子)。共同構(gòu)成INVADER試驗(yàn)試劑的單獨(dú)成分(例如寡核苷酸、酶、緩沖液、靶核酸)被稱為“INVADER試驗(yàn)試劑組分”。
在一些實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑更進(jìn)一步地包含第三寡核苷酸，其互補(bǔ)于第一靶核酸第一部分上游的靶核酸第三部分。然而在其它的實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑更進(jìn)一步地包含靶核酸。在一些實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑更進(jìn)一步地包含第二靶核酸。然而在其它的實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑更進(jìn)一步地包含第三寡核苷酸，其包含互補(bǔ)于第二靶核酸第一區(qū)域的5′部分。在一些具體實(shí)施方案中，第三寡核苷酸的3′部分共價(jià)聯(lián)接于第二靶核酸。在其它具體實(shí)施方案中，第二靶核酸更進(jìn)一步地包含5′部分，其中第二靶核酸的所述5′部分是第三寡核苷酸。在其它的實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑更進(jìn)一步地包含ARRESTOR分子(例如ARRESTOR寡核苷酸)。
如Eis等人，自然生物工程(Nature Biotechnology)，19673-676(2001)中描述地，完全堿基配對(duì)于每個(gè)探針的靶特異性區(qū)域并且部分配對(duì)于其5′flap區(qū)域的2′氧-甲基化的ARRESTOR寡核苷酸的包括，隔離了未切割的探針并且阻止了次級(jí)反應(yīng)中X-結(jié)構(gòu)的形成(此處整體引用作為參考)。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑更進(jìn)一步地包含檢測(cè)核酸切割產(chǎn)物的試劑。在一些實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑中的一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸包含標(biāo)記物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一寡核苷酸包含標(biāo)記物。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第三寡核苷酸包含標(biāo)記物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑包含用產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)作用的基團(tuán)標(biāo)記的第一和/或第三寡核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)所述INVADER試驗(yàn)試劑以分發(fā)前(predispensed)的形式(即，用在沒有重新測(cè)定或重新分發(fā)的程序中一個(gè)步驟的測(cè)定前的(premeasured))形式提供。在一些實(shí)施方案中，選擇的INVADER試驗(yàn)試劑組分是“混合的”和“分發(fā)前的”在一起的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分發(fā)前的試驗(yàn)試劑組分是分發(fā)前的，并且提供在一個(gè)反應(yīng)容器里(包括但不限于反應(yīng)試管或例如微量滴定平板中的孔)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，分發(fā)前的INVADER試驗(yàn)試劑組分在反應(yīng)容器中是經(jīng)干燥的(例如，脫水的或冷凍干燥的)。
在一些實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)試劑可提供為試劑盒。如此處使用的，術(shù)語“試劑盒”指的是遞送物質(zhì)的任何遞送系統(tǒng)。在反應(yīng)試驗(yàn)的上下文中，這樣的遞送系統(tǒng)包括允許反應(yīng)試劑(例如，適當(dāng)容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持物質(zhì)(例如，緩沖液，執(zhí)行試驗(yàn)的書面說明書等等)從一個(gè)地點(diǎn)到另一個(gè)地點(diǎn)的儲(chǔ)存、運(yùn)輸或遞送的系統(tǒng)。例如，所述試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)含有相關(guān)反應(yīng)試劑和/或支持物質(zhì)的包封物(例如，盒子)。如此處使用的，術(shù)語“分開的(fragmented)試劑盒”指的是包含兩個(gè)或兩個(gè)以上分開的容器的遞送系統(tǒng)，其中每一個(gè)容器含有全部試劑盒組分的一個(gè)亞部分。所述容器被一起或分別遞送到預(yù)期的接受器。例如，第一容器可含有用于試驗(yàn)的酶，而第二容器含有寡核苷酸。術(shù)語“分開的試劑盒”意在包括但不限于含有在聯(lián)邦食物、藥物和化妝品法案第520章節(jié)調(diào)控下的分析物特異性試劑(ASR’s)的試劑盒。當(dāng)然，任何包含兩個(gè)或兩個(gè)以上分開的容器的遞送系統(tǒng)都包括在術(shù)語“分開的試劑盒”之中，其中每個(gè)所述容器含有全部試劑盒組分的一個(gè)亞部分。相反，“聯(lián)合的試劑盒”指的是在單個(gè)容器中含有一個(gè)反應(yīng)試驗(yàn)的所有組分的遞送系統(tǒng)(例如，容納了每一個(gè)期望的組分的單個(gè)盒)。術(shù)語“試劑盒”包括分開的和聯(lián)合的試劑盒。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含一個(gè)或多個(gè)實(shí)施本發(fā)明需要的組分的INVADER試驗(yàn)試劑盒。例如，本發(fā)明提供了用于儲(chǔ)存或遞送實(shí)行INVADER試驗(yàn)所需酶和/或反應(yīng)組分的試劑盒。所述試劑盒可以包含試驗(yàn)所需或期望的任何和全部組分，包括但不限于，所述試劑本身、緩沖液、對(duì)照試劑(例如，組織樣品、陽性和陰性對(duì)照靶寡核苷酸等等)、固態(tài)支持物、標(biāo)記物、書面和/或圖示說明書和產(chǎn)品信息、抑制劑、標(biāo)記的和/或檢測(cè)試劑、包裝環(huán)境控制物(例如，冰、干燥劑等等)等等。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒提供了一亞套必需的組分，其中預(yù)期使用者將提供剩余的組分。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含兩個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)立的容器，其中每個(gè)容器收藏了待遞送的一亞套所述組分。例如，第一容器(例如，盒子)可以含有酶(例如，合適的儲(chǔ)存緩沖液和容器中結(jié)構(gòu)特異性切割酶)，而第二個(gè)盒子可以含有寡核苷酸(例如，INVADER寡核苷酸、探針寡核苷酸、對(duì)照靶寡核苷酸等等)。
如此處使用的術(shù)語“標(biāo)記物”指的是能被用來提供可檢測(cè)(優(yōu)選定量的)的作用并且能附著于核酸或蛋白質(zhì)的任何原子或分子。所述標(biāo)記物包括但不限于染料；放射標(biāo)記物(例如32P)；結(jié)合基團(tuán)(例如生物素)；半抗原例如digoxgenin；發(fā)光的、發(fā)磷光的或發(fā)熒光的基團(tuán)；質(zhì)量標(biāo)簽以及熒光染料，單獨(dú)或與能通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)抑制或移動(dòng)發(fā)射譜的基團(tuán)聯(lián)合。所述標(biāo)記物可以提供通過熒光、放射活性、比色法、重量測(cè)定、X射線衍射或吸收、磁力、酶活性、受質(zhì)量影響的質(zhì)量或行為的特征(例如，MALDI時(shí)間飛行質(zhì)譜；熒光偏振)等等可檢測(cè)的信號(hào)。標(biāo)記物可以是帶電荷的基團(tuán)(正或負(fù)電荷)或可以是電中性的。所述標(biāo)記物可包括核酸或蛋白質(zhì)序列或由其組成，只要包含所述標(biāo)記物的序列是可檢測(cè)的。
如此處使用地，涉及信號(hào)的術(shù)語“截然不同的”指的是能互相區(qū)分的信號(hào)，例如通過質(zhì)譜特性例如熒光發(fā)射波長(zhǎng)、顏色、吸光度、質(zhì)量、大小、熒光偏振特性、電荷等等，或者通過與另一個(gè)基團(tuán)相互作用的能力，例如與化學(xué)試劑、酶、抗體等等。
如此處使用地，術(shù)語“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)”用于指因堿基配對(duì)法則而相關(guān)的多核苷酸(即，例如寡核苷酸或靶核酸的核苷酸序列)。例如，對(duì)于序列″5′-A-G-T-3′″互補(bǔ)于序列″3′-T-C-A-5′″?；パa(bǔ)可以是“部分”的，其中只有一些核酸的堿基根據(jù)堿基配對(duì)法則是配對(duì)的?；蛘?，核酸之間可以有“完全的”或“全部的”互補(bǔ)。核酸鏈之間互補(bǔ)的程度對(duì)核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度有顯著的作用。這個(gè)在擴(kuò)增反應(yīng)以及依賴于核酸之間結(jié)合的檢測(cè)方法中特別重要。任一個(gè)術(shù)語也可用于涉及單獨(dú)的核苷酸，尤其是在多核苷酸的上下文中。例如，與余下的所述寡核苷酸和所述核酸鏈之間的所述互補(bǔ)相對(duì)照或相比較，寡核苷酸中特別的核苷酸因其互補(bǔ)于或缺乏互補(bǔ)于另一個(gè)核酸鏈中的核苷酸而被注意。
術(shù)語“同源性”和“同源的”指的是相同的程度?？梢杂胁糠滞葱曰蛲耆葱浴２糠滞吹男蛄惺且粋€(gè)序列與另外一個(gè)序列少于100％的相同。
如此處使用地，術(shù)語“雜交”用于指互補(bǔ)的核酸的配對(duì)。雜交和雜交的強(qiáng)度(即，所述核酸之間聯(lián)合的強(qiáng)度)受例如所述核酸之間互補(bǔ)的程度、有關(guān)條件的嚴(yán)格性和形成之雜合體的Tm等因素的影響。“雜交”方法包括一個(gè)核酸與另一個(gè)互補(bǔ)核酸(即具有互補(bǔ)核苷酸序列)的核酸的退火。含有互補(bǔ)序列的核酸的兩個(gè)多聚體互相尋找并且通過堿基配對(duì)相互作用退火的能力是廣泛驗(yàn)證的現(xiàn)象。Marmur和Lane，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46453(1960)和Doty等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46461(1960)對(duì)“雜交”過程的最初觀察之后，該方法被精煉成現(xiàn)代生物學(xué)的基本工具。
如此處使用的核酸序列的互補(bǔ)物指的是一種寡核苷酸，當(dāng)與核酸序列比對(duì)使一個(gè)序列的5′末端與另一個(gè)序列的3′末端配對(duì)時(shí)，所述寡核苷酸處于“反平行的結(jié)合”。天然核酸中平常找不到的某些堿基可以包括在本發(fā)明的核酸之中，包括例如次黃嘌呤和7-去氮鳥嘌呤(deazaguanine)?；パa(bǔ)不需要是完美的(perfect)；穩(wěn)定的雙體可以含有誤配的堿基對(duì)或未匹配的堿基。核酸技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)考慮包括如下的許多變量就能夠確定雙體穩(wěn)定性，例如寡核苷酸的長(zhǎng)度、堿基組成和寡核苷酸的序列、離子強(qiáng)度和誤配堿基對(duì)的發(fā)生率。
如此處使用地，術(shù)語“Tm”用于指“熔化溫度”。所述熔化溫度是一群雙鏈核酸半數(shù)解離為單鏈的溫度。一些計(jì)算核酸Tm的方程在本領(lǐng)域是眾所周知的。如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)指出地，當(dāng)核酸在1M NaCl水溶液中時(shí)(見例如，Anderson和Young，核酸雜交中的定量過濾雜交(Quantitative Filter Hybridization，in Nucleic Acid Hybridization)(1985))，Tm值的簡(jiǎn)單估計(jì)可以通過方程Tm＝81.5+0.41(％G+C)進(jìn)行計(jì)算。其它的參考文獻(xiàn)(例如Allawi和SantaLucia，生物化學(xué)(Biochemistry)3610581-94(1997))包括更加復(fù)雜的計(jì)算，對(duì)于Tm的計(jì)算它考慮了結(jié)構(gòu)和環(huán)境以及序列特征。
術(shù)語“基因”指的是包含有非編碼功能的RNA(例如，核糖體或轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)、多肽或前體的產(chǎn)生必需的控制和編碼序列的DNA序列。所述RNA或多肽能由全長(zhǎng)編碼序列或者由所述編碼序列的任何部分進(jìn)行編碼，只要期望的活性或功能被保存。
術(shù)語“野生型”指的是從天然發(fā)生的來源分離時(shí)具有的基因或基因產(chǎn)物的特征之基因或基因產(chǎn)物。野生型基因是最頻繁地在一個(gè)群體中觀察到，并且因而被主觀地指定為基因的“正常的”或“野生型”形式。相反，術(shù)語“修飾的”、“突變的”或“多態(tài)性的”指的是當(dāng)與野生型基因或基因產(chǎn)物比較時(shí)，顯示了序列和/或功能特性的修飾(即改變的特性)的基因或基因產(chǎn)物。值得注意的是天然發(fā)生的突變體可以是分離的；這些突變體通過它們與野生型基因或基因產(chǎn)物比較時(shí)具有改變的特征之事實(shí)而被鑒定。
如此處使用的術(shù)語“重組DNA載體”指的是含有期望的異源序列的DNA序列。例如，盡管所述術(shù)語不局限于表達(dá)的序列或編碼表達(dá)產(chǎn)物的序列的使用，在一些實(shí)施方案中，所述異源序列是一種編碼序列和宿主生物體中編碼序列的復(fù)制(或特別的宿主生物體中被有效地連接的編碼序列)的表達(dá)必需之適當(dāng)?shù)腄NA序列。原核細(xì)胞中表達(dá)必需的DNA序列包括啟動(dòng)子、任選地操縱子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及可能的其它序列。真核細(xì)胞已知利用啟動(dòng)子、多腺苷化信號(hào)和增強(qiáng)子。
如此處使用的術(shù)語“寡核苷酸”被定義為包含兩個(gè)或兩個(gè)以上脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，優(yōu)選地至少5個(gè)核苷酸，更加優(yōu)選地至少大約10-15個(gè)核苷酸，更加優(yōu)選地至少大約15至30個(gè)核苷酸。確切的大小將依賴于很多因素，這些因素反過來依賴于所述寡核苷酸的最終的功能或使用。所述寡核苷酸可以以任何方式產(chǎn)生，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、逆轉(zhuǎn)錄、PCR或它們的聯(lián)合。
因?yàn)閱魏塑账嵋砸粋€(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5′磷酸基在一個(gè)方向經(jīng)由一個(gè)磷酸二酯連接附著于其相鄰3′氧這樣的方式進(jìn)行反應(yīng)，以制造寡核苷酸，如果寡核苷酸的5′磷酸基不聯(lián)接于單核苷酸戊糖環(huán)的3′氧，這個(gè)末端就被稱為“5′末端”，如果其3′氧不聯(lián)接于隨后的單核苷酸戊糖環(huán)的5′磷酸基，就被稱為“3′末端”。如此處使用地，即便在一個(gè)更大的寡核苷酸內(nèi)部，核酸序列也可以說具有5′和3′末端。如果沿著核酸鏈以5′至3′方向移動(dòng)，第一區(qū)域的3′末端在第二區(qū)域的5′末端之前，所述核酸鏈的第一區(qū)域就被說成是另一個(gè)區(qū)域的上游。
當(dāng)兩個(gè)不同的非重疊的寡核苷酸與相同線性互補(bǔ)的核酸序列的不同區(qū)域退火，并且一個(gè)寡核苷酸的3′末端指向另一個(gè)的5′末端時(shí)，前者可以被稱為“上游”寡核苷酸，后者被稱為“下游”寡核苷酸。相似地，當(dāng)兩個(gè)重疊的寡核苷酸雜交于相同的線性互補(bǔ)核酸序列，在安置第一個(gè)寡核苷酸使得它的5′末端是第二個(gè)寡核苷酸的5′末端上游，第一個(gè)寡核苷酸的3′末端是第二個(gè)寡核苷酸3′末端的上游時(shí)，第一個(gè)寡核苷酸可被稱為“上游”寡核苷酸，第二個(gè)核苷酸可被稱為“下游”寡核苷酸。
術(shù)語“引物”指的是當(dāng)置于可使引物延伸起始的條件下時(shí)，能夠起合成起始點(diǎn)的作用之寡核苷酸。寡核苷酸“引物”當(dāng)在純化的限制性消化中時(shí)可以自然地產(chǎn)生，或者可以合成地生產(chǎn)。
選擇引物以“基本上”互補(bǔ)于所述模板特異性序列的鏈。為了發(fā)生引物的延長(zhǎng)，引物必須充分互補(bǔ)以雜交于模板鏈。引物序列不需要反映所述模板的確切序列。例如，非互補(bǔ)的核苷酸片段可以附著于所述引物的5′末端，引物序列的剩余部分基本上互補(bǔ)于所述鏈。非互補(bǔ)堿基或更長(zhǎng)的序列能散布在所述引物之內(nèi)只要引物序列具有與要雜交的模板序列充分的互補(bǔ)并且因此形成模板引物復(fù)合物以合成延伸引物。
如此處使用的術(shù)語“切割結(jié)構(gòu)”，指的是通過至少一個(gè)探針寡核苷酸和靶核酸的相互作用形成的結(jié)構(gòu)，形成包含雙體的結(jié)構(gòu)，所得結(jié)構(gòu)通過包括但不限于酶的切割方式可被切割。與是通過例如磷酸二酯酶的試劑非特異性切割的底物之核酸分子相比，它不考慮二級(jí)結(jié)構(gòu)而切割核酸分子(即，不需要雙體結(jié)構(gòu)的形成)，所述切割結(jié)構(gòu)是通過所述切割方式特異性切割的底物。
如此處使用的術(shù)語“切割方式”或“切割試劑”指的是能夠切割所述切割結(jié)構(gòu)的任何方法，包括但不限于酶?！敖Y(jié)構(gòu)特異性核酸酶”或“結(jié)構(gòu)特異性酶”是識(shí)別核酸分子中特異性二級(jí)結(jié)構(gòu)并且切割這些結(jié)構(gòu)的酶。本發(fā)明的切割方式響應(yīng)切割結(jié)構(gòu)的形成而切割核酸分子；所述切割方法于所述切割結(jié)構(gòu)內(nèi)任何特別位置切割所述切割結(jié)構(gòu)不是必要的。
所述切割方式可以包括多種來源提供的核酸酶活性，包括CLEAVASE酶(第三波科技，Madison，WI)、FEN-1核酸內(nèi)切酶(包括RAD2和XPG蛋白質(zhì))、Taq DNA聚合酶和大腸桿菌DNA聚合酶I。所述切割方式可以包括具有5′核酸酶活性的酶(例如Taq DNA聚合酶(DNAP)、大腸桿菌DNA聚合酶I)。所述切割方法也可以包括具有5′核酸酶活性但缺乏合成活性的修飾的DNA聚合酶。適合使用在本發(fā)明方法和試劑盒中使用的切割方式的實(shí)施例在美國專利號(hào)5,614,402、5,795,763、5,843,669、PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 98/23774、WO02/070755A2和WO0190337A2中有提供，它們的每一個(gè)此處整體引用作為參考。
當(dāng)涉及例如5′核酸酶的酶而被使用時(shí)，術(shù)語“熱穩(wěn)定的”指所述酶在升高的溫度下是功能性的或有活性的，即，在大約55℃或更高溫度下(例如，包括但不限于60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃)。
如此處使用的術(shù)語“切割產(chǎn)物”，指的切割方法與切割結(jié)構(gòu)的反應(yīng)(即，用切割方法對(duì)切割結(jié)構(gòu)的處理)產(chǎn)生的產(chǎn)物。
術(shù)語“非靶切割產(chǎn)物”指的是不來源于所述靶核酸的切割反應(yīng)的產(chǎn)物。如上面討論地，在本發(fā)明的一些方法中，所述切割結(jié)構(gòu)的切割一般發(fā)生在探針寡核苷酸內(nèi)。通過這個(gè)靶核酸依賴性切割產(chǎn)生的探針寡核苷酸的片段是“非靶切割產(chǎn)物”。
術(shù)語“探針寡核苷酸”在INVADER試驗(yàn)反應(yīng)的上下文中指的是與靶核酸相互作用而在有或無INVADER寡核苷酸的存在下形成切割結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。當(dāng)與靶核酸退火時(shí)，所述探針寡核苷酸與靶形成切割結(jié)構(gòu)，切割發(fā)生在所述探針寡核苷酸之內(nèi)。
術(shù)語“INVADER寡核苷酸”指的是在探針和靶核酸之間的雜交區(qū)域附近的位置上雜交于靶核酸的寡核苷酸，其中所述INVADER寡核苷酸包含與所述探針和靶之間的雜交區(qū)域重疊的部分(例如，化學(xué)基團(tuán)或核苷酸——無論互補(bǔ)于或不互補(bǔ)于那個(gè)靶)。在一些實(shí)施方案中，所述INVADER寡核苷酸在其3′末端含有基本上與位于探針寡核苷酸5′末端的序列相同的序列。
術(shù)語“ARRESTOR分子”指的是為了阻止一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)組分參加隨后的作用或反應(yīng)而加入到或包括在侵入性切割反應(yīng)的試劑。這個(gè)可以通過隔絕或失活一些反應(yīng)組分(例如，通過與核酸組分結(jié)合或堿基配對(duì)，或者通過與蛋白質(zhì)組分結(jié)合)來進(jìn)行。術(shù)語“ARRESTOR寡核苷酸”(也稱為捕集寡核苷酸)指的是為了阻止或捕獲任何反應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)方面(例如，第一反應(yīng)和/或任何隨后的反應(yīng)或作用；這不是旨在將所述ARRESTOR寡核苷酸限制于任何特別的反應(yīng)或反應(yīng)步驟)而包括在侵入性切割反應(yīng)內(nèi)的寡核苷酸。這個(gè)可以通過隔絕一些反應(yīng)組分(例如，與另一個(gè)核酸堿基配對(duì)或者與蛋白組分結(jié)合)來進(jìn)行。然而，這不是旨在將所述術(shù)語如此局限于剛剛使得反應(yīng)組分被隔離的情況。
如此處使用的術(shù)語“盒子(cassette)”指的是在INVADER試驗(yàn)中為響應(yīng)探針寡核苷酸切割而產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)所配置的寡核苷酸或寡核苷酸的聯(lián)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述盒子雜交于自所述探針寡核苷酸的切割得到的非靶切割產(chǎn)物，以形成第二侵入性切割結(jié)構(gòu)，由此使所述盒子然后能夠被切割。
本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方案中的次級(jí)切割反應(yīng)包括FRET盒子的使用。這樣的分子提供了次級(jí)靶(次級(jí)反應(yīng)靶(或SRT))和FRET標(biāo)記的可切割序列，允許連續(xù)侵入性切割反應(yīng)的均相檢測(cè)(即，所述反應(yīng)之后沒有產(chǎn)物的分離或其它操作)。其它優(yōu)選的實(shí)施方案使用了次級(jí)反應(yīng)系統(tǒng)，其中所述FRET探針和合成靶被提供為分開的寡核苷酸。來自初級(jí)反應(yīng)的被切割的5′冗余鏈(flap)在次級(jí)反應(yīng)中起入侵寡核苷酸的作用，其中它們結(jié)合于適當(dāng)?shù)拇渭?jí)反應(yīng)靶(SRT)。
在一些實(shí)施方案中，所述盒子是包含發(fā)夾部分(即，一個(gè)區(qū)域，其中盒子寡核苷酸的一個(gè)部分在反應(yīng)條件下雜交于相同寡核苷酸的第二個(gè)部分，以形成雙體)的單個(gè)寡核苷酸。在其它的實(shí)施方案中，盒子包含至少兩個(gè)包含有在反應(yīng)條件下能形成雙體的互補(bǔ)部分的寡核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述盒子包含標(biāo)記物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述盒子包含產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)作用的標(biāo)記的基團(tuán)。
當(dāng)涉及核酸底物而被使用時(shí)，術(shù)語“基本上單鏈的”意味著與以通過鏈內(nèi)堿基配對(duì)相互作用保持在一起的雙鏈核酸形式存在的雙鏈底物相對(duì)比，所述底物分子主要以單鏈核酸存在。
如此處使用地，短語“未被擴(kuò)增的寡核苷酸檢測(cè)試驗(yàn)”指的是這樣構(gòu)建的檢測(cè)試驗(yàn)，其中為了檢測(cè)有或無并未被擴(kuò)增的(例如，通過PCR)特別的靶序列(例如，miRNA、SNP、重復(fù)序列等等)的存在，而無需產(chǎn)生所述靶序列的復(fù)制體?！胺菙U(kuò)增的寡核苷酸檢測(cè)試驗(yàn)”可以，例如，擴(kuò)增用于指示靶序列之中有或無特別靶序列或多肽性存在的信號(hào)，只要所述靶序列未被復(fù)制。
如此處使用地，短語“非擴(kuò)增性的寡核苷酸檢測(cè)試驗(yàn)”指的是這樣構(gòu)建的檢測(cè)試驗(yàn)，其中為了檢測(cè)有或無靶序列(例如miRNA、SNP、重復(fù)序列等等)存在，而無需產(chǎn)生所述靶序列的復(fù)制體?！胺菙U(kuò)增性的寡核苷酸檢測(cè)試驗(yàn)”可以，例如，擴(kuò)增用于指示靶序列中有或無特別靶序列或多肽性存在的信號(hào)，只要靶序列未復(fù)制。
如此處使用的術(shù)語“序列變異”指的是兩個(gè)核酸之間核酸序列的差異。例如，野生型結(jié)構(gòu)基因和這個(gè)野生型結(jié)構(gòu)基因的突變形式可以由于一個(gè)堿基的替代和/或缺失，或一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入的存在，而在序列上不同。所述結(jié)構(gòu)基因的這兩個(gè)形式據(jù)說在序列上互不相同。所述結(jié)構(gòu)基因的第二個(gè)突變形式可以存在。這個(gè)第二突變形式據(jù)說在序列上與野生型基因和所述基因第一個(gè)突變形式都不同。
如此處使用的術(shù)語“釋放”指的是核酸片段通過例如5′核酸酶的作用從例如寡核苷酸的更大的核酸片段的釋放，以至于釋放的片段不再共價(jià)附著于剩余的寡核苷酸上。
如此處使用的術(shù)語“Km”指的是酶的Michaelis-Menten常數(shù)，被定義為特定的酶在酶催化的反應(yīng)中產(chǎn)生其最大速率一半的特定底物的濃度。
如此處使用的“核苷酸類似物”指的是修飾的或非天然發(fā)生的核苷酸，包括但不限于具有改變的堆積相互作用的類似物例如7-脫氮嘌呤(即，7-脫氮-dATP和7-脫氮-dGTP)；有替代的氫鍵合構(gòu)型的堿基類似物(例如Iso-C和Iso-G以及S.Benner的美國專利號(hào)6,001,983中描述的并且此處引用作為參考的其它非標(biāo)準(zhǔn)的堿基對(duì))；非氫鍵合類似物(例如，非極性、芳香性核苷類似物，例如B.A.Schweitzer和E.T.Kool，有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem.)，1994，59，7238-7242，B.A.Schweitzer和E.T.Kool，美國化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)，1995,117，1863-1872描述的2，4-二氟甲苯；它們的每一個(gè)此處引用作為參考)；“通用”堿基例如5-基吲哚和3-硝基吡咯；以及通用嘌呤和嘧啶(例如分別是“K”和“P”核苷酸；P.Kong，等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1989，17，10373-10383，P.Kong等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1992，20，5149-5152)。核苷酸類似物包括在糖基團(tuán)上具有修飾的核苷酸，例如二脫氧核苷酸和2′-氧-甲基核苷酸。核苷酸類似物包括脫氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修飾形式。
術(shù)語“多態(tài)性基因座”是群體中存在的在一個(gè)群體成員之間顯示了變異的基因座(例如，最普通的等位基因具有少于0.95的頻率)。相對(duì)比，“單態(tài)性基因座”是所述群體成員之間很少或沒有變異被觀察到的遺傳基因座(一般認(rèn)為是所述人群的基因池中最普通的等位基因超過0.95的頻率的基因座)。
如此處使用的術(shù)語“微生物”是指一個(gè)生物體太小以至于肉眼觀察不到，包括但不限于細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌和纖毛蟲。
術(shù)語“微生物基因序列”指的是來源于微生物的基因序列。
術(shù)語“細(xì)菌”指的是包括真細(xì)菌和古細(xì)菌類的任何細(xì)菌種類。
術(shù)語“病毒”指的是不能自主復(fù)制的(即，復(fù)制需要宿主細(xì)胞機(jī)制的使用)專性的、超顯微鏡的、細(xì)胞內(nèi)寄生物。
本說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語“樣品”以其最廣泛的意義而被使用。一方面它意在包括樣本或培養(yǎng)物(例如，微生物培養(yǎng)物)。另一方面，它意在包括生物學(xué)的和環(huán)境的樣品。樣品可以包括合成來源的樣本。
生物樣品可以是動(dòng)物，包括人類、流體、固體(例如，糞便)或者組織，以及液體和固體食物以及飼料產(chǎn)品和成分例如奶制品、植物、肉和肉的副產(chǎn)品以及垃圾。生物樣品可以從所有各科的家畜，以及野獸或野生動(dòng)物獲得，包括但不限于例如有蹄類動(dòng)物、熊、魚、兔類、鼠等等的動(dòng)物。
環(huán)境樣品包括環(huán)境物質(zhì)，例如表面物質(zhì)、土壤、水和工業(yè)樣品，以及得自食物和奶制品加工工具、設(shè)備、儀器、器具、一次性和非一次性項(xiàng)目。這些實(shí)例不被解釋為限制可應(yīng)用于本發(fā)明的樣品類型。
術(shù)語“靶核酸的來源”指的是任何含有核酸(RNA(例如，miRNA)或DNA)的樣品。靶核酸特別優(yōu)選的來源是生物樣品，包括但不限于血液、唾液、腦脊液、腹膜液、奶、淋巴、痰和精液。
如果一個(gè)寡核苷酸以比另一個(gè)寡核苷酸(或靶核酸序列)更高的摩爾濃度存在，就說那個(gè)寡核苷酸相對(duì)于另一個(gè)寡核苷酸(或靶核酸序列)而“過量”存在。當(dāng)例如探針寡核苷酸的寡核苷酸在切割反應(yīng)中相對(duì)于互補(bǔ)的靶核酸序列的濃度過量存在時(shí)，所述反應(yīng)可被用于指出所述靶核酸存在的量。一般地，當(dāng)過量存在時(shí)，所述探針寡核苷酸將以至少100倍摩爾過量存在；當(dāng)所述靶核酸序列以大約10fmole或更少的量存在時(shí)，一般地至少1pmol的每個(gè)探針寡核苷酸會(huì)被使用。
“懷疑含有”第一和第二靶核酸的樣品可以含有這兩個(gè)靶核酸分子的任何一個(gè)，或者兩個(gè)都含有或都不含有。
術(shù)語“反應(yīng)物”此處以其最廣泛的意義而被使用。所述反應(yīng)物能包含，例如，酶反應(yīng)物、化學(xué)反應(yīng)物或光(例如，紫外光，特別是短波長(zhǎng)紫外光已知破壞寡核苷酸鏈)。任何能與寡核苷酸反應(yīng)縮短(例如，切割)或延長(zhǎng)所述寡核苷酸的試劑都包括在術(shù)語“反應(yīng)物”之中。
如此處使用地，術(shù)語“純化的”或“要純化”指的是污染物從樣品中的去除。例如，在一些實(shí)施方案中，重組CLEAVASE核酸酶表達(dá)于細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)，并且所述核酸酶通過宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的去除進(jìn)行純化；這些重組核酸酶的百分比因此在樣品中是增加的。
如此處使用的術(shù)語“部分”當(dāng)涉及蛋白質(zhì)時(shí)(例如“給定蛋白質(zhì)的部分”中)指的是那個(gè)蛋白質(zhì)的片段。所述片段大小范圍可以從4個(gè)氨基酸殘基到完整的氨基酸序列減去一個(gè)氨基酸(例如，4，5，6，...，n-1)。
如此處使用的術(shù)語“核酸序列”指的是寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及它們的片段或部分，以及基因組或合成來源的DNA或RNA，它們可以是單或雙鏈的，并且代表有義或反義鏈。相似地，如此處使用的“氨基酸序列”指的是肽或蛋白質(zhì)序列。
如此處使用地，術(shù)語“純化的”或“基本上純化的”指的是核酸(或氨基酸)序列的分子，所述分子從它們的天然環(huán)境被移出、被分離或被分開，并且是至少60％游離、優(yōu)選地75％游離以及最優(yōu)選地90％游離于與它們天然相關(guān)的其它組分?！胺蛛x的多核苷酸”或“分離的寡核苷酸”所以是基本上純化的多核苷酸。
如此處使用的術(shù)語“核酸的連續(xù)鏈”意味著具有連續(xù)的、共價(jià)連接的骨架結(jié)構(gòu)而沒有缺口或其它中斷之核酸的鏈。每個(gè)核苷酸堿基部分的傾向，無論堿基配對(duì)的、單鏈的或誤配的，都不是連續(xù)鏈的定義的要素。所述連續(xù)鏈的骨架不局限于天然發(fā)生的未修飾的核酸中找到的核糖-磷酸酯或脫氧核糖-磷酸酯組分。本發(fā)明的核酸可以包含所述骨架結(jié)構(gòu)的修飾，包括但不限于硫代磷酸酯殘基、膦酸酯殘基、2′取代的核糖殘基(例如，2′-氧-甲基核糖)以及含有可選的糖(例如，阿拉伯糖)的殘基。
如此處使用的術(shù)語“連續(xù)的雙體”指的是雙鏈核酸的一個(gè)區(qū)域，其中在所述雙體內(nèi)堿基對(duì)的行進(jìn)過程中沒有中斷(即，沿著所述雙體的所述堿基對(duì)沒有被扭曲以在連續(xù)雙體區(qū)域的約束內(nèi)容納一個(gè)間隙、凸出或誤配)。如此處使用的所述術(shù)語僅僅指的是所述雙體內(nèi)所述堿基對(duì)的排列，而沒有所述核酸鏈骨架部分連續(xù)性的暗示。有未打斷的堿基配對(duì)但是在一條或兩條鏈中有缺口的雙體核酸在連續(xù)雙體的定義之內(nèi)。
術(shù)語“雙體”指的是核酸的狀態(tài)，其中一條鏈上核苷酸的堿基部分通過氫鍵合結(jié)合于排列于第二鏈上的它們的互補(bǔ)堿基。處于雙體形式的條件反映了核酸的所述堿基的狀態(tài)。依靠堿基配對(duì)，所述核酸鏈一般也假設(shè)了雙螺旋的三級(jí)結(jié)構(gòu)，具有大和小溝。所述螺旋形式的假設(shè)在變成雙體的行為中暗示。
術(shù)語“模板”指的是核酸的一條鏈，在所述鏈上互補(bǔ)的復(fù)制體通過模板依賴性的核酸聚合酶的活性由核苷三磷酸進(jìn)行構(gòu)造。雙體之內(nèi)所述模板鏈，根據(jù)慣例，被描寫并且描述為“底”鏈。相似地，所述非模板鏈經(jīng)常被描寫和描述為“頂”鏈。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及微小RNA(miRNA)或其它短核酸分子，例如，siRNA，的組合物及其檢測(cè)和特征分析的方法。本發(fā)明提供了檢測(cè)、特征分析和定量分析miRNA表達(dá)的改進(jìn)的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括將核酸加入到miRNA以幫助檢測(cè)的檢測(cè)miRNA表達(dá)的方法。所得“miRNA檢測(cè)結(jié)構(gòu)”然后使用任何合適的方法進(jìn)行檢測(cè)，包括但不限于此處公開的那些方法。雖然下面的描述集中在miRNA的檢測(cè)和定量分析，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明也找到了用其它短核酸分子(例如，長(zhǎng)度少于例如50、40、30或20個(gè)核苷酸的DNA和RNA)的用途。
1.miRNA檢測(cè)結(jié)構(gòu)的形成
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生miRNA檢測(cè)結(jié)構(gòu)以幫助miRNA檢測(cè)的方法。miRNA是很小的(大約21個(gè)核苷酸)，因而使用標(biāo)準(zhǔn)化的雜交方法進(jìn)行檢測(cè)是困難的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包含將核酸分子加入到miRNA(例如，經(jīng)由雜交、延伸或連接)以產(chǎn)生檢測(cè)結(jié)構(gòu)。這樣的檢測(cè)結(jié)構(gòu)然后能使用任何合適的方法進(jìn)行檢測(cè)。
在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，為了miRNA的檢測(cè)產(chǎn)生了圖2中描述的檢測(cè)結(jié)構(gòu)。在這個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)寡核苷酸與所述miRNA退火以形成一個(gè)雙環(huán)或“啞鈴”樣結(jié)構(gòu)。所述啞鈴結(jié)構(gòu)通過延伸有寡核苷酸雙鏈區(qū)域的所述miRNA末端而產(chǎn)生了一個(gè)更大區(qū)域的雙鏈核酸。在一些實(shí)施方案中，所述miRNA的每個(gè)末端被延伸了2至5個(gè)之間的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸的末端包含不雜交于所述miRNA的額外的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，這些額外的序列形成了侵入性切割結(jié)構(gòu)(例如，INVADER試驗(yàn)侵入性切割結(jié)構(gòu))。在一些實(shí)施方案中，侵入性切割結(jié)構(gòu)通過INVADER試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)(見例如，下面的描述)。
在其它的實(shí)施方案中，為了miRNA的檢測(cè)產(chǎn)生了圖3中描述的檢測(cè)結(jié)構(gòu)。在這個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與所述miRNA退火以產(chǎn)生弓形結(jié)構(gòu)。所述miRNA將寡核苷酸的末端集合在一起，帶來比沒有所述miRNA存在更大的效率。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸的末端包含了延伸到超出miRNA且不雜交于所述mRNA的額外的序列。在一些實(shí)施方案中，這些額外的序列形成了侵入性切割結(jié)構(gòu)(例如，INVADER試驗(yàn)侵入性切割結(jié)構(gòu))。在一些實(shí)施方案中，侵入性切割結(jié)構(gòu)通過所述INVADER試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)(見例如，下面的描述)。在其它的實(shí)施方案中，在INVADER試驗(yàn)侵入性切割結(jié)構(gòu)的切割之后，得到的末端被連接以形成環(huán)形結(jié)構(gòu)。在其它的實(shí)施方案中，寡核苷酸雜交于miRNA，使得所述寡核苷酸的末端被帶到近處(例如，雜交于所述miRNA鄰近的核苷酸)并且然后被連接。
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，產(chǎn)生了圖16和17中描述的檢測(cè)結(jié)構(gòu)。在這個(gè)實(shí)施方案中，探針或INVADER寡核苷酸被延伸以產(chǎn)生單個(gè)發(fā)夾環(huán)或“半啞鈴”結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸的末端包含不雜交于所述miRNA的額外的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，這些額外序列形成侵入性切割結(jié)構(gòu)(例如，INVADER試驗(yàn)侵入性切割結(jié)構(gòu))。在一些實(shí)施方案中，侵入性切割結(jié)構(gòu)通過所述INVADER試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)(見例如，下面的描述)。
在其它的實(shí)施方案中，這些額外的序列互補(bǔ)于加入到反應(yīng)混合物以穩(wěn)定切割結(jié)構(gòu)的額外的寡核苷酸，例如INVADER試驗(yàn)侵入性切割結(jié)構(gòu)(圖4)。
在一些實(shí)施方案中，如上述產(chǎn)生的環(huán)形結(jié)構(gòu)使用滾環(huán)復(fù)制試驗(yàn)(見例如，滾環(huán)復(fù)制的下面的描述)進(jìn)行檢測(cè)。
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，檢測(cè)結(jié)構(gòu)從與miRNA有一個(gè)或多個(gè)短區(qū)域同源性的長(zhǎng)寡核苷酸(例如，大于50、100、1000或更多個(gè)核苷酸)產(chǎn)生。一個(gè)或多個(gè)miRNA雜交于所述寡核苷酸以產(chǎn)生所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，這些檢測(cè)結(jié)構(gòu)通過miRNA的延伸(例如，經(jīng)由連接或聚合反應(yīng)例如RT-PCR)進(jìn)行檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，這些檢測(cè)結(jié)構(gòu)通過與偶聯(lián)于(例如微球、或其它表面或結(jié)構(gòu)的)固相支持物的寡核苷酸之雜交進(jìn)一步地進(jìn)行檢測(cè)。
在一些實(shí)施方案中，用于形成檢測(cè)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物。例如，在一些實(shí)施方案中，2′-氧-甲基核苷酸被利用。本發(fā)明不局限于特別的機(jī)制。當(dāng)然，對(duì)所述機(jī)制的理解在實(shí)行本發(fā)明不是必需的。然而，可以預(yù)期2′-氧-甲基堿基的存在增加了所述雜交的檢測(cè)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并且?guī)椭诉M(jìn)一步的檢測(cè)方法。
2.干擾RNA的檢測(cè)
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)miRNA的方法。本發(fā)明不局限于特定的檢測(cè)試驗(yàn)。任何合適的方法可以被利用，包括但不限于此處公開那些方法。
在本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，miRNA檢測(cè)方法是定量的。本發(fā)明不局限于特別的機(jī)制。當(dāng)然，對(duì)所述機(jī)制的理解在實(shí)行本發(fā)明不是必需的。然而，可以期望體內(nèi)特別的miRNA的水平與來自它們同類基因的基因表達(dá)水平是相關(guān)的。本發(fā)明因而提供了與特定基因(例如，參與疾病狀態(tài)或代謝的基因)的基因表達(dá)相互關(guān)聯(lián)的miRNA的方法。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用來測(cè)定特定miRNA的異常(例如，高或低)水平的存在，或測(cè)定一種干預(yù)(例如，藥物)對(duì)miRNA表達(dá)的作用。在其它的實(shí)施方案中，對(duì)異源性miRNA(例如，來自表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體、轉(zhuǎn)染等等)進(jìn)行檢測(cè)以表征miRNA表達(dá)系統(tǒng)的效率。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)特定miRNA(例如，miRNA諸如mir-1或mir-135)的方法。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用來區(qū)別特定miRNA中的變異體(例如，多態(tài)性或突變)。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了裂解細(xì)胞以檢測(cè)miRNA存在的方法。
A.INVADER試驗(yàn)
在一些實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)被用于miRNA的檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)包含形成依賴于靶核酸存在的核酸切割結(jié)構(gòu)，以及切割所述核酸切割結(jié)構(gòu)以釋放獨(dú)特的切割產(chǎn)物。例如，5′核酸酶的活性被用于切割所述靶依賴性切割結(jié)構(gòu)，所得切割產(chǎn)物或所述切割結(jié)構(gòu)的切割是樣品中特異性靶核酸序列存在的指示。當(dāng)核酸的一個(gè)或兩個(gè)(或兩個(gè)以上)鏈，或者寡核苷酸，都雜交于靶核酸鏈以使它們形成重疊的侵入性切割結(jié)構(gòu)時(shí)，如下面描述地，侵入性切割能夠發(fā)生。通過切割試劑(例如，5′核酶)和上游寡核苷酸的相互作用，可制造所述切割試劑，以獨(dú)特的片段被產(chǎn)生的方式在內(nèi)部位點(diǎn)處切割下游寡核苷酸。這樣的實(shí)施方案被稱為INVADER試驗(yàn)(第三波科技)并且在美國專利號(hào)5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543、6,348,314和6,458,535，WO 97/27214、WO98/42873，Lyamichev等人，自然生物技術(shù)(Nat.Biotech.)，17292(1999)、Hall等人，PNAS，USA，978272(2000)中有描述，為了所有的目的它們的每一個(gè)此處引用作為參考)。
所述INVADER試驗(yàn)通過結(jié)構(gòu)特異性酶對(duì)特異性結(jié)構(gòu)的酶切割，檢測(cè)探針與靶的雜交(見，INVADER試驗(yàn)，第三波科技；見例如，美國專利號(hào)5,846,717、6,090,543、6,001,567、5,985,557、5,994,069、6,090,543、6,348,314、6,458,535,美國專利申請(qǐng)?zhí)?0030186238(序列號(hào)10/084839)、20030104378A1(序列號(hào)09/864636)，Lyamichev等人，自然生物科技(Nat.Biotech.)，17292(1999)、Hall等人，PNAS，USA，978272(2000)，WO97/27214以及WO98/42873，為了所有的目的它們的每一個(gè)此處引用作為參考)。
所述INVADER試驗(yàn)通過使用結(jié)構(gòu)特異性酶(例如FEN核酸內(nèi)切酶)切割由重疊寡核苷酸探針的雜交形成的復(fù)合物，檢測(cè)特異性的DNA和RNA序列(見，例如圖1)。升高的溫度和一個(gè)所述探針的過量能使待切割的針對(duì)每一靶的多重探針存在而無溫度循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，這些切割的探針然后指導(dǎo)第二標(biāo)記探針的切割。所述次級(jí)探針寡核苷酸能用被內(nèi)部染料淬滅的熒光素進(jìn)行5′末端標(biāo)記。一經(jīng)切割，所述去淬滅的熒光素標(biāo)記的產(chǎn)物可以使用標(biāo)準(zhǔn)熒光平板閱讀儀進(jìn)行檢測(cè)。
所述INVADER試驗(yàn)檢測(cè)了未擴(kuò)增的以及擴(kuò)增的RNA和DNA中的特異性序列、突變和SNP，包括基因組DNA。在圖1中圖表顯示的實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)使用兩個(gè)都產(chǎn)生并且然后擴(kuò)增所述靶特異性信號(hào)的級(jí)聯(lián)步驟(初級(jí)和次級(jí)反應(yīng))。為了方便，下面的討論中所述等位基因被描述為野生型(WT)和突變型(MT)，即使這個(gè)術(shù)語并不適用于所有的基因變異。在所述初級(jí)反應(yīng)中(圖1，A表)，所述野生型初級(jí)探針和所述INVADER寡核苷酸一前一后雜交于所述靶核酸以形成重疊結(jié)構(gòu)。未配對(duì)的“flap”被包括在所述WT初級(jí)探針的5′末端。結(jié)構(gòu)特異性酶(例如CLEAVASE酶，第三波科技)識(shí)別所述重疊，切割掉所述未配對(duì)的flap，將它釋放為靶特異性產(chǎn)物。在所述次級(jí)反應(yīng)中，這個(gè)切割的產(chǎn)物起WT熒光共振能量轉(zhuǎn)移(WT-FRET)探針上INVADER寡核苷酸的作用，以再次產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特異性酶識(shí)別的所述結(jié)構(gòu)(A表)。當(dāng)單個(gè)FRET探針上的所述兩個(gè)染料通過切割被分開時(shí)(通過圖1中的箭頭指出)，產(chǎn)生在背景熒光之上的可檢測(cè)的熒光信號(hào)。因此，這個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的切割導(dǎo)致熒光的增加，指示W(wǎng)T等位基因(或者突變等位基因，如果所述試驗(yàn)為了突變型等位基因產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)而配置)的存在。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)每個(gè)等位基因或基因座的檢測(cè)，提供具有不同標(biāo)記物的FRET探針(例如，通過發(fā)射或激發(fā)波長(zhǎng)的不同可分辨的，或者通過時(shí)間分辨熒光檢測(cè)可分辨的)，以使單個(gè)反應(yīng)中可檢測(cè)不同的等位基因或基因座。在這樣的實(shí)施方案中，所述初級(jí)探針組合(set)和所述不同的FRET探針在單個(gè)試驗(yàn)中可以聯(lián)合起來，允許來自相同樣品中每個(gè)等位基因或基因座的所述信號(hào)的比較。
如果初級(jí)探針寡核苷酸和靶核苷酸序列在切割位點(diǎn)不是完美匹配(例如，就象MT初級(jí)探針和WT靶，圖1，B表)，所述的重疊的結(jié)構(gòu)并沒有形成并且切割被抑制。與非重疊的結(jié)構(gòu)相比，使用的所述結(jié)構(gòu)特異性酶(例如，CLEAVASEVin酶，第三波科技)更加有效率地切割所述的重疊的結(jié)構(gòu)(例如至少340倍)，允許所述等位基因的極好的區(qū)分。
所述探針無需溫度循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)(turn over)以產(chǎn)生每個(gè)靶的許多信號(hào)(即，線性信號(hào)擴(kuò)增)。相似地，每個(gè)靶特異性產(chǎn)物可允許許多FRET探針的切割。
初級(jí)INVADER試驗(yàn)反應(yīng)被指向待檢測(cè)的靶DNA(或RNA)。所述靶DNA是第一侵入性切割中限制性組分，因?yàn)樗鯥NVADER和初級(jí)探針以摩爾過量提供。在第二侵入性切割中，限制性的是釋放的flap。當(dāng)這兩個(gè)切割反應(yīng)相繼進(jìn)行時(shí)，來自混合反應(yīng)(compositereaction)的熒光信號(hào)依據(jù)靶DNA的量線性蓄積。
在某些實(shí)施方案中，所述INVADER試驗(yàn)或其它核苷酸檢測(cè)試驗(yàn)用可得的位點(diǎn)設(shè)計(jì)寡核苷酸和/或橋接寡核苷酸進(jìn)行。這樣的方法、程序和組合物在美國專利6,194,149、6,358,691、6355,437，美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/882,945和PCT申請(qǐng)WO9850403和WO0198537中有描述，所有的專利特異地完整引用作為參考。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果靶序列存在于樣品中，所述樣品暴露于寡核苷酸和試劑，包括將所述樣品在所述靶序列和所述寡核苷酸之間形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的條件下暴露于寡核苷酸和試劑，其中所述侵入性切割結(jié)構(gòu)被所述切割試劑切割而形成切割產(chǎn)物。
在一些實(shí)施方案中，所述靶序列包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第二區(qū)域在第一區(qū)域的下游并且與其鄰近，所述寡核苷酸包含第一和第二寡核苷酸，其中至少所述第一寡核苷酸的一部分完全互補(bǔ)于靶序列的第一部分，其中所述第二寡核苷酸包含3′部分和5′部分，其中5′部分完全互補(bǔ)于所述靶核酸的第二部分。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果靶序列存在于樣品中，所述樣品暴露于寡核苷酸和試劑，包括將所述樣品在靶序列和寡核苷酸之間形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的條件下暴露于寡核苷酸和試劑，其中所述侵入性切割結(jié)構(gòu)被所述切割試劑切割而形成切割產(chǎn)物。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果所述靶序列存在于所述樣品中，所述樣品暴露于寡核苷酸和試劑，包括將所述樣品在所述靶序列和所述寡核苷酸之間形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的條件下暴露于寡核苷酸和試劑，其中所述侵入性切割結(jié)構(gòu)被切割試劑切割而形成切割產(chǎn)物。
在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶序列包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第二區(qū)域在所述第一區(qū)域的下游并且與其鄰近，并且所述寡核苷酸包含第一和第二寡核苷酸，其中至少所述第一寡核苷酸的一部分完全互補(bǔ)于所述靶序列的所述第一部分，其中所述第二寡核苷酸包含3′部分和5′部分，其中所述5′部分完全互補(bǔ)于所述靶核酸的所述第二部分。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用INVADER檢測(cè)試劑(例如，初級(jí)探針、INVADER探針和FRET盒)分析合并的樣品(例如合并的血液樣品或合并的細(xì)胞裂解物)的試劑盒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含怎樣進(jìn)行所述INVADER試驗(yàn)的說明書，以及在一些實(shí)施方案中，怎樣將所述INVADER檢測(cè)試驗(yàn)應(yīng)用于來自許多個(gè)體的合并的樣品或來自單個(gè)研究對(duì)象的很多細(xì)胞(例如，來自活檢樣品)的“合并的”樣品的說明書。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了這樣的試驗(yàn)，其中在用寡核苷酸探針的多輪雜交以及不需要使用溫度循環(huán)(即，為了靶核酸鏈周期性的變性)或核酸合成(即，為了靶或探針核酸鏈的基于聚合化的替代)的探針的切割過程中，靶核酸被再使用或再循環(huán)。當(dāng)切割反應(yīng)在探針被持續(xù)放置于靶鏈之上的條件下(例如通過探針-探針替代，或通過探針/靶結(jié)合和分離之間的平衡，或者通過包含這些機(jī)制的聯(lián)合，(Reynaldo等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)97511-520(2000))進(jìn)行時(shí)，多重探針能雜交于相同的靶，允許多重切割以及多重切割產(chǎn)物的產(chǎn)生。
INVADER試驗(yàn)反應(yīng)
在INVADER DNA試驗(yàn)的優(yōu)選實(shí)施方案中，兩個(gè)寡核苷酸(分辨性的初級(jí)探針和INVADER寡核苷酸)一前一后地雜交于靶DNA以形成重疊結(jié)構(gòu)。所述初級(jí)探針的5′末端包括不雜交于靶DNA的5′flap(圖1)。結(jié)合的INVADER寡核苷酸的3′核苷酸重疊于所述初級(jí)探針，但是不需要雜交于靶DNA。CLEAVASE酶識(shí)別這個(gè)重疊結(jié)構(gòu)，將所述初級(jí)探針未配對(duì)的5′flap切割下來，將它釋放作為靶特異性產(chǎn)物。所述初級(jí)探針經(jīng)設(shè)計(jì)以具有與反應(yīng)溫度相近的融化溫度。因此，在等溫度試驗(yàn)條件下，過量提供的初級(jí)探針在靶DNA上循環(huán)。這允許針對(duì)每個(gè)靶DNA的多輪初級(jí)探針切割，以及釋放的5′flap數(shù)量的擴(kuò)增。
在次級(jí)反應(yīng)中，每一個(gè)釋放的5′flap能起熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)盒上INVADER寡核苷酸的作用以產(chǎn)生另外一個(gè)被CLEAVASE酶識(shí)別并切割的重疊結(jié)構(gòu)(圖1)。當(dāng)FRET盒被切割時(shí)，熒光團(tuán)(F)和淬滅劑(Q)被分開，產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。與最初的反應(yīng)相似，釋放的5′flap和FRET盒循環(huán)，導(dǎo)致擴(kuò)增的熒光信號(hào)。所述最初和次級(jí)反應(yīng)在相同的孔中同時(shí)進(jìn)行。
所述INVADER試驗(yàn)的雙體格式實(shí)現(xiàn)了在單個(gè)孔中兩種DNA序列的同時(shí)檢測(cè)。最經(jīng)常地，這包括特定多態(tài)性的兩個(gè)變異體的檢測(cè)(例如，miRNA中)。所述雙體格式使用兩種不同的分辨性初級(jí)探針，每種有獨(dú)特的5′flap，和兩種不同的FRET盒，每種有波譜截然不同的熒光團(tuán)。通過設(shè)計(jì)，釋放的5′flap將只結(jié)合于它們各自的FRET盒以產(chǎn)生靶特異性的信號(hào)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含實(shí)行本發(fā)明必需的一個(gè)或多個(gè)組分。例如，本發(fā)明提供了儲(chǔ)存或遞送本發(fā)明的酶和/或?qū)嵭星懈钤囼?yàn)(例如，所述INVADER試驗(yàn))必需的反應(yīng)組分。以舉例的方式，并不是意將本發(fā)明的試劑盒限制為任何特別的配置或組分的聯(lián)合，下面的章節(jié)描述了實(shí)行本發(fā)明的試劑盒的一個(gè)實(shí)施方案
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了下面的試劑
CLEAVASE酶 初級(jí)寡核苷酸
DNA反應(yīng)緩沖液I INVADER寡核苷酸
FRET盒1(例如，F(xiàn))
FRET盒2(例如，R)
突變型DNA對(duì)照
野生型DNA對(duì)照
“無靶”的空白對(duì)照
在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒為了RNA的直接檢測(cè)而被配置。這些試劑盒可以提供下面的試劑
CLEAVASE酶 初級(jí)探針
寡核苷酸
DNA反應(yīng)緩沖液I INVADER寡核苷酸
FRET探針1(例如，F(xiàn))
FRET探針2(例如，R)
次級(jí)反應(yīng)靶1
次級(jí)反應(yīng)靶2
ARRESTOR寡核苷酸1
ARRESTOR寡核苷酸2
突變型DNA對(duì)照
野生型DNA對(duì)照
“沒有靶”的空白對(duì)照
必須有額外的考慮，其與由單一反應(yīng)中寡核苷酸的特定組合產(chǎn)生的非期望作用有關(guān)。一種這樣的作用是背景信號(hào)的靶獨(dú)立性的產(chǎn)生。某些寡核苷酸與其它的寡核苷酸組合，在所述INVADER試驗(yàn)中在沒有待檢測(cè)的特別靶存在下可以產(chǎn)生信號(hào)。將這些寡核苷酸的組合分開到不同的池中能用于減輕該作用。相似地，某些寡核苷酸的組合能夠虛假地抑制來自期望靶的信號(hào)產(chǎn)生。再一次，這些組合分開到不同的池中能夠減輕這個(gè)作用。
設(shè)計(jì)探針組合(set)(例如，寡核苷酸和/或其序列)以適合于miRNA檢測(cè)試驗(yàn)中的使用，其利用反應(yīng)設(shè)計(jì)和此處提供的最優(yōu)化的指導(dǎo)方針(見例如，實(shí)驗(yàn)章節(jié))。例如，在一些實(shí)施方案中，降低所述反應(yīng)溫度(例如，到50-60℃)以進(jìn)行小區(qū)域的雜交。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了為了進(jìn)行本發(fā)明的方法由使用者供給的額外組分的列表(例如，試劑、供應(yīng)品和/或設(shè)備)。例如，并且不是意在將這樣額外的組分的列表限制于任何特別的組分，這樣的列表的一個(gè)實(shí)施方案包含了如下
·透明CHILLOUT-14液體蠟(MJ Research)或無RNase的光學(xué)級(jí)礦物油(Sigma，Cat.No.M-5904)
·96孔聚丙烯微量平板(MJ Research，Cat.No.MSP-9601)
·無菌的1.5ml或2.0ml微量離心管
·無菌的、無DNase/RNase的一次性氣溶膠隔離移液器吸頭
·多道移液器(0.5-10μl，2.5-20μl)
·溫度循環(huán)器或其他熱源(例如，實(shí)驗(yàn)室烘箱或加熱塊)
·各式各樣的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(試管架、微量移液器、多道移液器、微量離心機(jī)、振蕩混合器)
·熒光微量平板讀取器(優(yōu)選的平板讀取器是從上面讀數(shù)的并且配備了有下面特征的濾光器
激發(fā)發(fā)射
(波長(zhǎng)/帶寬) (波長(zhǎng)/帶寬)
485nm/20nm 530nm/25nm
560nm/20nm 620nm/40nm
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了為了方便本發(fā)明的方法執(zhí)行由使用者供給的額外組分的列表(例如，試劑、供應(yīng)品和/或設(shè)備)。例如，并且不是意在將這樣可選的組分列表限制于任何特別的組分，這樣的列表的一個(gè)實(shí)施方案包含了如下
·無菌8試管條或微量平板(可選的)
·一次性塑料水槽(可選的)
·平板封口帶(可選的)
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了為了方便本發(fā)明方法的進(jìn)行由使用者供給的必需組分的列表，為此多個(gè)可選物是可接受的(例如樣品制備試劑盒)。例如，并且不是意在將這樣的可選組分的列表限制于任何特別的組分，這樣的列表的一個(gè)實(shí)施方案包含如下
·QIAGENQI AMP血液試劑盒
·Gentra Systems PUREGENE試劑盒
·Gentra Systems GENERATION產(chǎn)品
在試劑盒的一些實(shí)施方案中，提供了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了INVADER試驗(yàn)反應(yīng)的匯編的實(shí)驗(yàn)方案(例如，制劑和制造反應(yīng)混合物的優(yōu)選程序)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物的匯編之實(shí)驗(yàn)方案包括電腦或繪圖的幫助，以降低本發(fā)明方法執(zhí)行中犯錯(cuò)的風(fēng)險(xiǎn)(例如，方便多重反應(yīng)需要的試劑之體積的計(jì)算的表格，以及輔助配置含有許多試驗(yàn)反應(yīng)的多孔試驗(yàn)平板的平板設(shè)計(jì)指導(dǎo))。
在一些實(shí)施方案中，提供了增補(bǔ)文件，例如補(bǔ)助程序的試驗(yàn)方案，例如為了額外試劑的制備，或?yàn)榱擞糜诒景l(fā)明方法中樣品制備的實(shí)驗(yàn)方案。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，增補(bǔ)文件包括為了方便非技術(shù)人員或無經(jīng)驗(yàn)的使用者對(duì)所述方法和試劑的成功使用而提供的指導(dǎo)方針和預(yù)防措施列表。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，增補(bǔ)文件包括解決問題指南，例如，描述了使用者遭遇的可能問題，以及提供了意在幫助使用者解決或避免這樣的問題而提出的解決方案或改正方法的指南。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品被稀釋到相應(yīng)于每個(gè)反應(yīng)加入10μl的濃度。100ng樣品的濃度應(yīng)當(dāng)是15ng/μl。
B.滾環(huán)復(fù)制
在其它的實(shí)施方案中，滾環(huán)復(fù)制方法(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)被用于miRNA檢測(cè)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)(見例如，美國專利6,344,329、6,143,495、6,316,229、6,210,884、6,183,960和6,235,502；它們的每一個(gè)在此引用作為參考)。在一些實(shí)施方案中，滾環(huán)復(fù)制被用來檢測(cè)從與miRNA退火的單個(gè)寡核苷酸末端的退火產(chǎn)生的環(huán)狀miRNA檢測(cè)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸的末端雜交于沒有重疊的miRNA。這個(gè)寡核苷酸在有或無miRNA存在下能夠被連接。然而，所述連接反應(yīng)在有所述miRNA存在下更有效率。在這樣的實(shí)施方案中，將隨著時(shí)間檢測(cè)的環(huán)狀分子水平與缺乏miRNA的對(duì)照反應(yīng)比較。
在其它的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸的末端雜交于有重疊末端的miRNA以產(chǎn)生侵入性切割結(jié)構(gòu)。這樣的結(jié)構(gòu)在連接之前被切割，因而提高所述環(huán)狀檢測(cè)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的特異性。
滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)包括環(huán)狀單鏈DNA分子的復(fù)制。在RCA中，滾環(huán)復(fù)制的引物雜交于環(huán)狀核酸分子，之后是使用鏈替代DNA聚合酶的核酸分子的滾環(huán)復(fù)制。所述擴(kuò)增發(fā)生在單個(gè)反應(yīng)循環(huán)的滾環(huán)復(fù)制之中。滾環(huán)復(fù)制得到含有核酸序列的串聯(lián)重復(fù)序列的大DNA分子。這個(gè)DNA分子被稱為串聯(lián)序列DNA(TS-DNA)。
在一些實(shí)施方案中，利用復(fù)制之前包括連接操作的連接介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增(LM-RCA)。在所述連接操作中，探針雜交于其同類靶核酸序列(如果存在的話)，之后是雜交探針末端的連接形成共價(jià)閉合的單鏈核酸。連接之后，滾環(huán)復(fù)制引物雜交于探針分子，之后是使用鏈替代DNA聚合酶的環(huán)狀分子的滾環(huán)復(fù)制。一般地，LM-RCA包含將開環(huán)探針與靶樣品混合，得到探針-靶樣品混合物，并且在促進(jìn)所述開環(huán)探針和靶序列之間雜交的條件下孵育所述探針-靶樣品混合物，將連接酶與所述探針-靶樣品混合物混合，得到連接混合物，并且在促進(jìn)所述開環(huán)探針連接的條件下孵育所述連接混合物以形成擴(kuò)增靶環(huán)(ATC)，將滾環(huán)復(fù)制引物(RCRP)與所述連接混合物混合，得到引物-ATC混合物，并且在促進(jìn)所述擴(kuò)增靶環(huán)和所述滾環(huán)復(fù)制引物之間雜交的條件下孵育所述引物-ATC混合物，將DNA聚合酶與所述引物-ATC混合物混合，得到聚合酶-ATC混合物，并且在促進(jìn)所述擴(kuò)增靶環(huán)復(fù)制的條件下孵育所述聚合酶-ATC混合物，這里所述擴(kuò)增靶環(huán)的復(fù)制導(dǎo)致串聯(lián)序列DNA(TS-DNA)的形成。
C.額外的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明不限于INVADER試驗(yàn)或滾環(huán)試驗(yàn)檢測(cè)。任何允許miRNA檢測(cè)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)的方法可以被利用。作為示例的，發(fā)現(xiàn)用于本發(fā)明方法的非限制的檢測(cè)試驗(yàn)在下面有描述。
1.雜交試驗(yàn)
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，檢測(cè)結(jié)構(gòu)使用雜交試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。在雜交試驗(yàn)中，有或無特定核酸序列的存在基于來自樣品的DNA雜交于互補(bǔ)DNA分子(例如，寡核苷酸探針)的能力進(jìn)行測(cè)定。使用各種雜交和檢測(cè)技術(shù)的各種雜交試驗(yàn)是可以利用的。試驗(yàn)挑選的描述在下面有提供。
a.雜交的直接檢測(cè)
在一些實(shí)施方案中，探針與目的序列的雜交(例如，SNP或突變)通過顯現(xiàn)結(jié)合探針(例如，Northern或Southern試驗(yàn)；見例如Ausabel等人(eds.)，分子生物學(xué)當(dāng)代實(shí)驗(yàn)方案(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons，NY[1991])直接進(jìn)行檢測(cè)。在這些試驗(yàn)中，基因組DNA(Southern)或RNA(Northern)從研究對(duì)象分離出來。所述DNA或RNA然后用一系列基因組中罕見地并不在待分析的任何標(biāo)志物附近切割的限制性酶進(jìn)行切割。所述DNA或RNA然后被分開(例如，在瓊脂糖凝膠上)并且被轉(zhuǎn)移到膜上。標(biāo)記的(例如，通過引入一個(gè)放射性核苷酸)探針或特異于待檢測(cè)的所述SPN或突變的探針被允許在低、中或高嚴(yán)格條件下與所述膜接觸。未結(jié)合的探針被去除并且結(jié)合的存在通過顯現(xiàn)所述標(biāo)記的探針進(jìn)行檢測(cè)。
b.使用“DNA芯片”試驗(yàn)的雜交的檢測(cè)
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，變異體序列使用DNA芯片雜交試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。在這個(gè)試驗(yàn)中，一系列寡核苷酸探針被附于固相支持物。所述寡核苷酸探針被設(shè)計(jì)成對(duì)于特定的靶序列是唯一的(例如，miRNA靶序列)。目的DNA樣品與所述DNA“芯片”接觸并且對(duì)雜交進(jìn)行檢測(cè)。
在一些實(shí)施方案中，所述DNA芯片試驗(yàn)是GeneChip(Affymetrix，Santa Clara，CA；見例如，美國專利號(hào)6,045,996、5,925,525和5,858,659；它們的每個(gè)此處引用作為參考)試驗(yàn)。所述GeneChip技術(shù)使用附于“芯片”的寡核苷酸探針的小型、高密度陣列。探針陣列通過Affymetrix的光指示化學(xué)合成法進(jìn)行生產(chǎn)，它聯(lián)合了固相化學(xué)合成和半導(dǎo)體工業(yè)采用的照相平版印刷制作技術(shù)。為了定義芯片暴露位點(diǎn)使用了一系列照相平版印刷底片，之后是特異性化學(xué)合成步驟，所述方法構(gòu)建了寡核苷酸的高密度陣列，有每一個(gè)探針在陣列中預(yù)先確定的位置。多重探針陣列在大的玻璃夾心晶片上同時(shí)進(jìn)行合成。所述夾心晶片然后被切成方塊，并且單獨(dú)的探針陣列被包裝在注模塑料盒中，所述盒子保護(hù)它們免受環(huán)境的影響并且用作雜交的腔室。
待分析的核酸被分離，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并且用熒光報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。所述標(biāo)記的DNA然后使用流體工作站(fluidics station)與所述陣列進(jìn)行孵育。所述陣列然后被插入掃描儀中，在此檢測(cè)雜交的模式。收集雜交數(shù)據(jù)，為已經(jīng)整合進(jìn)靶的熒光報(bào)告基團(tuán)的發(fā)射光，所述靶結(jié)合于所述探針陣列。既然所述陣列上每個(gè)探針的序列和位置是已知的，通過互補(bǔ)性，應(yīng)用于所述探針陣列的靶核酸的身份能夠被測(cè)定。
在其它的實(shí)施方案中，利用含有電子捕捉探針的DNA微芯片(Nanogen，San Diego，CA)(見例如，美國專利號(hào)6,017,696、6,068,818和6,051,380；它們的每個(gè)此處引用作為參考)。通過微電子的使用，Nanogen的技術(shù)實(shí)現(xiàn)了到達(dá)和來自半導(dǎo)體微芯片上指定的測(cè)試位點(diǎn)的帶電分子之活躍的運(yùn)動(dòng)和濃縮(concentration)。對(duì)于特定靶序列是唯一的DNA捕獲探針通過電子手段被放置于或“定位于”所述微芯片上的特異性位點(diǎn)。既然DNA具有很強(qiáng)的負(fù)電荷，它能通過電子手段被移到正電荷區(qū)域。
首先，所述微芯片上一個(gè)測(cè)試位點(diǎn)或一行測(cè)試位點(diǎn)用正電荷電子激活。其次，含有所述DNA探針的溶液被引入到所述微芯片上。負(fù)電荷探針很快地移動(dòng)到帶正電荷的位點(diǎn)，在此它們濃縮并且被化學(xué)結(jié)合于所述微芯片上的位點(diǎn)。然后清洗所述微芯片，加入截然不同的DNA探針的另一個(gè)溶液直到特異性結(jié)合DNA探針的陣列完成。
然后對(duì)測(cè)試樣品通過測(cè)定哪個(gè)所述DNA捕獲探針雜交于靶序列而分析靶序列的存在。電子電荷也被用于移動(dòng)和濃縮靶分子至所述微芯片上一個(gè)或多個(gè)測(cè)試位點(diǎn)。在每個(gè)測(cè)試位點(diǎn)上樣品DNA的電子濃度促進(jìn)了樣品DNA與互補(bǔ)捕獲探針的快速雜交(雜交可以在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生)。為了從每個(gè)位點(diǎn)去除任何未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的DNA，所述位點(diǎn)的極性或電荷被逆轉(zhuǎn)為帶負(fù)電荷的，因此強(qiáng)迫任何未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的DNA回到遠(yuǎn)離所述捕獲探針的溶液?；诩す獾臒晒鈷呙鑳x被用于檢測(cè)結(jié)合。
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，基于通過表面張力的不同，隔離平面(芯片)上的流體的陣列技術(shù)(ProtoGene，Palo Alto，CA)(見例如，美國專利號(hào)6,001,311、5,985,551和5,474,796；它們的每個(gè)此處引用作為參考)。Protogene的技術(shù)基于流體能夠被隔離在通過化學(xué)包被給予的表面張力不同的平面之上的事實(shí)。一旦這么被隔離，寡核苷酸探針通過試劑的噴墨打印在所述芯片上直接合成。帶有由表面張力定義的反應(yīng)位點(diǎn)的陣列在一套四個(gè)壓電噴嘴下被裝在X/Y移動(dòng)平臺(tái)上，每一個(gè)噴嘴代表四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DNA堿基的一個(gè)。所述移動(dòng)平臺(tái)沿著所述陣列的每行移動(dòng)并且適當(dāng)?shù)脑噭┍贿f送到每一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)。例如，Aamidite只被遞送到amidite A在那個(gè)合成步驟之中被偶聯(lián)的位點(diǎn)等等。普通試劑和清洗液通過覆滿(flooding)整個(gè)表面并且然后通過離心將其去除而被遞送。
對(duì)于目的靶序列(例如，miRNA靶序列)唯一的DNA探針使用Protogene的技術(shù)被附于所述芯片。所述芯片然后與PCR擴(kuò)增的目的基因接觸。雜交之后，未結(jié)合的DNA被去除并且雜交使用任何合適的方法進(jìn)行檢測(cè)(例如，通過整合的熒光基團(tuán)的熒光去淬滅)。
然而在其它的實(shí)施方案中，“珠子試驗(yàn)”被用于多態(tài)性的檢測(cè)(Illumina，San Diego，CA；見例如，PCT公開WO 99/67641和WO00/39587，它們的每個(gè)在此引用作為參考)。Illumina使用聯(lián)合了纖維光束和自己裝配成為陣列的珠子的珠子陣列技術(shù)。每個(gè)纖維光束依賴于所述光束的直徑而含有數(shù)千至數(shù)百萬的單個(gè)纖維。所述珠子用特異于特定SNA或突變的檢測(cè)的寡核苷酸包被。幾批珠子被聯(lián)合以形成特異于所述陣列的集合。為了進(jìn)行試驗(yàn)，所述珠子試驗(yàn)與制備好的研究對(duì)象的樣品(例如，核酸樣品)接觸。雜交使用任何合適的方法進(jìn)行檢測(cè)。
c.雜交的酶法檢測(cè)
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，雜交通過特異性結(jié)構(gòu)的酶切割進(jìn)行檢測(cè)。
在一些實(shí)施方案中，結(jié)合探針的雜交使用TaqMan試驗(yàn)(PEBiosystems，F(xiàn)oster City，CA；見例如，美國專利號(hào)5,962,233和5,538,848，它們的每個(gè)此處引用作為參考)進(jìn)行檢測(cè)。所述試驗(yàn)在PCR反應(yīng)的過程中進(jìn)行。所述TaqMan試驗(yàn)利用了AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性。特異于特定等位基因或突變的探針被包括在所述PCR反應(yīng)之中。所述探針由有5′報(bào)告基因染料(例如，熒光染料)和3′淬滅染料的寡核苷酸組成。在PCR過程中，如果所述探針結(jié)合于其靶，AMPLITAG GOLD聚合酶的5′-3′核酸水解活性切割了所述報(bào)告基因和所述淬滅染料之間的探針。報(bào)告基因染料從淬滅染料分開導(dǎo)致熒光的增加。所述信號(hào)隨著PCR的每個(gè)循環(huán)蓄積并且能用熒光儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，多態(tài)性使用SNP-IT引物延伸試驗(yàn)(Orchid Biosciences，Princeton，NJ；見例如，美國專利號(hào)5,952,174和5,919,626，它們的每個(gè)在此引用作為參考)進(jìn)行檢測(cè)。在這個(gè)試驗(yàn)中，SNP通過使用特異性合成的DNA引物和DNA聚合酶由可疑SNP位置的一個(gè)堿基選擇性延伸所述DNA鏈進(jìn)行鑒別。目的區(qū)域中的DNA被擴(kuò)增和變性。聚合酶反應(yīng)然后使用被稱為微流體的小型化系統(tǒng)進(jìn)行。檢測(cè)通過將標(biāo)記物加入到被懷疑在靶序列位置的核苷酸來完成。所述標(biāo)記物整合進(jìn)所述DNA能通過任何合適的方法進(jìn)行檢測(cè)(例如，如果所述核酸含有生物素標(biāo)記物，檢測(cè)可以經(jīng)由特異于生物素的熒光標(biāo)記抗體)。
2.其它檢測(cè)試驗(yàn)
在miRNA檢測(cè)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)中有用的額外的檢測(cè)試驗(yàn)，包括但不限于酶錯(cuò)配切割方法(例如，Vairagenics，美國專利號(hào)6,110,684、5,958,692、5,851,770，此處完整引用作為參考)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；分支雜交方法(例如，Chiron，美國專利號(hào)5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，此處完整引用作為參考)；NASBA(例如，美國專利號(hào)5,409,818，此處完整引用作為參考)；分子信標(biāo)技術(shù)(例如，美國專利號(hào)6,150,097，此處完整引用作為參考；電子傳感器(Motorola，美國專利號(hào)6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，此處完整引用作為參考)；循環(huán)探針技術(shù)(例如，美國專利號(hào)5,403,711、5,011,769和5,660,988，此處完整引用作為參考)；DadeBehring信號(hào)擴(kuò)增方法(例如，美國專利號(hào)6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，此處完整引用作為參考)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barnay，Proc.Natl.Acad.Sci USA 88，89-93(1991))；以及夾心雜交方法(例如，美國專利號(hào)5,288,609，此處完整引用作為參考)。
實(shí)驗(yàn)的
為了證明和進(jìn)一步闡明某些優(yōu)選的實(shí)施方案和本發(fā)明的各個(gè)方面，提供下面的實(shí)施例，并且不被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
材料和方法
·下面最終濃度(除非有注明的)用于所有的反應(yīng)
探針＝1μM
INVADER＝1μM
ARRESTOR＝2.67μM
CLEAVASE XII酶＝30ng
所有合成的miRNA寡核苷酸從Dharmacon購買并且在20％變性丙烯酰胺凝膠純化。合成的miRNA被用來測(cè)定溫度的最適(見下面)和LOD。
INVADER、探針和ARRESSTOR寡核苷酸由整合DNA技術(shù)(IDT)或第三波科技合成，在20％變性丙烯酰胺上進(jìn)行純化，除非另外有指出。
·下面的2.5×初級(jí)反應(yīng)緩沖液用于(除非另外有注明的)所有的反應(yīng)
25mM MOPS pH7.5
62.5mM KCl
0.125％Tween 20
0.125％Nonidet NP40
62.5mMMgSO4
5％PEG
·除非另外有指出，所有的反應(yīng)在第一個(gè)熱孵育之前被10μl礦物油覆蓋。
·除非另外有注明，合成的miRNA含有5′羥基。比較5′磷酸化與非磷酸化合成的miRNA靶檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)指出，INVADER試驗(yàn)檢測(cè)這兩個(gè)不同類型合成分子的能力沒有明顯的不同。
實(shí)施例2
let7和mir-1的溫度最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
let-7的寡核苷酸設(shè)計(jì)顯示在圖5中。mir-1的寡核苷酸設(shè)計(jì)顯示在圖5中。下面的初級(jí)混合物被制成并且在96孔板中在50C±10℃孵育30分鐘。另外，沒有靶的總體混合物(master mix)被制備(加入水取代RNA)。所有的反應(yīng)用礦物油覆蓋以阻止蒸發(fā)。
初級(jí)反應(yīng)完成后，加入5μl下面的次級(jí)反應(yīng)混合物，并且所述反應(yīng)然后在60℃反應(yīng)孵育10-15分鐘。
所述反應(yīng)完成后，所述平板在CYTOFLUOR4000熒光微量平板閱讀器內(nèi)使用485nm的激發(fā)波長(zhǎng)和530nm的發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行讀數(shù)。結(jié)果顯示在圖6和7中。當(dāng)所述INVADER寡核苷酸的3′末端是2′-氧-甲基化的時(shí)候，所述INVADER寡核苷酸的5′末端到所述miRNA的3′末端的堆砌被增強(qiáng)。另外，所述INVADER寡核苷酸5′末端的2′-氧-甲基化增加了反應(yīng)溫度。延伸INVADER寡核苷酸的2′-氧-甲基化堿基以至于它們與所述miRNA(SEQ ID NO8(1496-96-02)對(duì)let-7a的SEQ ID NO9(1496-96-OlR)設(shè)計(jì)中SEQ ID NO23(1496-96-03))的最初兩個(gè)堿基的堿基配對(duì)，增加了所述反應(yīng)的最適溫度但是不增強(qiáng)所述檢測(cè)。
實(shí)施例3
let-7和miR-1的LOD試驗(yàn)
測(cè)定每一個(gè)組合的探針和INVADER寡核苷酸的最優(yōu)反應(yīng)溫度和測(cè)定最好的工作設(shè)計(jì)(來自溫度最優(yōu)凈信號(hào))后，下面的實(shí)驗(yàn)被設(shè)置以使用合成的RNA測(cè)定所述設(shè)計(jì)的LOD。下面的反應(yīng)混合物被分裝到有每個(gè)孔含有如下的96孔板中(見下面平板設(shè)置)
2.5μl下面的miRNA濃度使用下面的設(shè)置以三復(fù)樣或四復(fù)樣加入
＜--------[miRNA]-----→
所述平板用礦物油覆蓋(10μl)并且在50℃孵育2小時(shí)。在初級(jí)反應(yīng)完成后，5μl下面的組分加入到每個(gè)孔并且所述平板在60℃孵育1.5小時(shí)。所述平板用上面描述的設(shè)置(見實(shí)施例2)進(jìn)行讀數(shù)。
接著let-7和mir-1的LOD在人類RNA樣品上進(jìn)行檢測(cè)。上面描述的實(shí)驗(yàn)方案被利用。50-100ng組織特異性總的人RNA樣品(Clonetech，Palo Alto，CA)被使用。結(jié)果顯示在圖8和10中。使用總RNA所述let-7a INVADER試驗(yàn)檢測(cè)了如以前觀察到的依賴于組織來源的let-7a表達(dá)水平相同的組織表達(dá)譜(profile)(Pasquinelli等人，40886[2000])。
實(shí)施例4
Let-7a、c、e和f的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)
該實(shí)施例描述了針對(duì)let-7一種亞型的探針和/或INVADER寡核苷酸對(duì)于另一個(gè)亞型的交叉反應(yīng)性的分析。采用實(shí)施例3中描述的合成的let-7a設(shè)置的實(shí)驗(yàn)方案。圖5顯示了寡核苷酸設(shè)計(jì)。采用下面的平板設(shè)置
結(jié)果顯示在圖9中。對(duì)于let-7a設(shè)計(jì)，當(dāng)所述miRNA長(zhǎng)度相同、在遠(yuǎn)離所述切割位點(diǎn)有一個(gè)堿基改變時(shí)，交叉反應(yīng)性最大。換句話來說，當(dāng)誤配更加遠(yuǎn)離所述切割位點(diǎn)(let-7c)時(shí)，INVADER寡核苷酸/miRNA雜交區(qū)域的誤配得到高的交叉反應(yīng)性。當(dāng)堿基變化在所述切割位點(diǎn)的對(duì)面(或與其接近)時(shí)，交叉反應(yīng)性最低。對(duì)于let-7a，最嚴(yán)重的交叉反應(yīng)性是和let-7c，其得到了25％的所述信號(hào)。該實(shí)施例證明了所述INVADER試驗(yàn)?zāi)軌騾^(qū)分非常相似的miRNA。
實(shí)施例5
CLEAVASE IX酶對(duì)CLEAVASE XII酶
該實(shí)施例描述了用于miRNA試驗(yàn)的CLEAVASE酶的最優(yōu)化。上面描述的溫度最優(yōu)化的試驗(yàn)方案被利用。使用20ng的CLEAVASE IX酶(第三波科技，Madison，WI)或30ng的CLEAVASE XII酶(第三波科技，Madison，WI)。下面的緩沖液用于CLEAVASE IX酶
2.5X初級(jí)反應(yīng)緩沖液25mM MOPS pH7.5，250mM KCl，0.125％Tween 20，0.125％ Nonidet NP40，31.25mM MgSO4，10％PEG。
7.5X次級(jí)反應(yīng)緩沖液87.5mM MgSO4。
下面的緩沖液被用于CLEAVASE XII酶
2.5X初級(jí)反應(yīng)緩沖液25mM MOPS pH7.5，62.5mM KCl，0.125％Tween 20，0.125％ Nonidet NP40，62.5mM MgSO4，5％ PEG。
7.5X次級(jí)反應(yīng)緩沖液水
LOD實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方案與CLEAVASE IX或XII酶一起使用。測(cè)定了兩個(gè)酶的LOD。結(jié)果顯示在圖11中。
當(dāng)與CLEAVASE IX酶或CLEAVASE XII酶一起分析時(shí)信號(hào)隨著let-7miRNA量的增加而線性增加。然而，R2值在CLEAVASE XII酶更大，指出了更大的線性關(guān)系。另外，所述LOD在CLEAVASE XII酶更低。2.5阿摩爾的檢測(cè)凈信號(hào)(net signal)在CLEAVASE IX酶是20個(gè)計(jì)數(shù)并且在CLEAVASE XII酶是66.75。
實(shí)施例6
miR-135、GAPDH和U6 RNA
A.檢測(cè)miR135的寡核苷酸的設(shè)計(jì)
該實(shí)施例描述了miRNA miR135試驗(yàn)設(shè)計(jì)和LOD的測(cè)定。miR-1的實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例2和3描述地進(jìn)行。所述寡核苷酸設(shè)計(jì)在圖5中有描述。為了mir-135miRNA的檢測(cè)每個(gè)所述設(shè)計(jì)(A-D)利用了不同的INVADER和探針寡核苷酸。比較所有所述設(shè)計(jì)進(jìn)行的溫度最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖13中。設(shè)計(jì)D產(chǎn)生最高的信號(hào)。使用試驗(yàn)設(shè)計(jì)D的LOD實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖14中。
圖14A呈現(xiàn)了在每個(gè)指出的靶濃度從四個(gè)重復(fù)試驗(yàn)產(chǎn)生的粗計(jì)數(shù)。每一個(gè)靶濃度得到的平均計(jì)數(shù)表示凈信號(hào)并且是零之上的倍數(shù)(FOZ)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中miR-135靶的檢測(cè)限是164 zmoles，相當(dāng)于98,743個(gè)分子。圖14B含有在每個(gè)濃度得到的平均計(jì)數(shù)的圖示，并且指出INVADER試驗(yàn)在測(cè)試的許多濃度范圍是線性的。
B.檢測(cè)GAPDH和U6 RNA的寡核苷酸的設(shè)計(jì)
在一些情形下，例如雙體試驗(yàn)中共同檢測(cè)一般在所有細(xì)胞中以恒定水平與一個(gè)或多個(gè)miRNA種類一起存在的RNA是期望的，所述RNA以組織特異性的方式表達(dá)。INVADER試驗(yàn)因此被設(shè)計(jì)成一般在所有細(xì)胞類型中可見的兩個(gè)截然不同的RNA人三磷酸甘油醛脫氫酶(hGAPDH)和U6的RNA。
在hGAPDH的情況下，下面的寡核苷酸被用于雙體miRNA檢測(cè)試驗(yàn)INVADER寡核苷酸(SEQ ID NO41)；探針(SEQ ID NO42)；ARRESTOR寡核苷酸(SEQ ID NO43)；SRT寡核苷酸(SEQ IDNO49)，F(xiàn)RET寡核苷酸(紅色染料)(SEQ IN NO48)。
在U6的情況下，從秀麗新小桿線蟲到小鼠到芥屬(arabidopsis)到人類8個(gè)不同種類的U6 RNA序列比對(duì)，以鑒定適合于“通用”INVADER試驗(yàn)設(shè)計(jì)的區(qū)域。所述比對(duì)顯示在圖12中；產(chǎn)生以檢測(cè)這個(gè)序列的寡核苷酸序列是SEQ ID NO93-95。
在細(xì)胞裂解物上使用SEQ ID NO45-47與這些寡核苷酸進(jìn)行的初始試驗(yàn)證明了來自U6反應(yīng)的信號(hào)在miRNA信號(hào)之前達(dá)到非常飽和，可能因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)大量的U6 RNA。因此，進(jìn)行滴定反應(yīng)，以確定稀釋探針和INVADER寡核苷酸的濃度是否會(huì)使得這個(gè)探針組合適合用于終濃度范圍從1μM到12.5nM的INVADER和探針的雙體miRNA檢測(cè)試驗(yàn)。12.5-50nM之間的所述INVADER和探針寡核苷酸的終濃度適于miR-1d和let-7a的雙體miRNA檢測(cè)。ARRESTOR、SRT和FRET探針濃度如在前面的實(shí)施例中描述的。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明了用“通用”U6RNA寡核苷酸(SEQ IN NO93-95)的U6RNA的檢測(cè)與用SEQ ID NO45-47的檢測(cè)相當(dāng)。
實(shí)施例7
細(xì)胞裂解物中l(wèi)et-7、GADPH和U6 RNA的檢測(cè)
A.細(xì)胞裂解物中l(wèi)et 7a的檢測(cè)
這個(gè)實(shí)施例描述了直接在總細(xì)胞RNA中以及來自人骨肉瘤細(xì)胞系MG63(第三波科技，Madison，WI；目錄號(hào)CRL-1427)的未誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中l(wèi)et-7 miRNA的檢測(cè)?？偧?xì)胞RNA，如以前描述地(Chomczynski等人，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)162156-156(1987))，使用TRIZOL(Gibco-BRL)進(jìn)行提取，并且細(xì)胞裂解物如Eis等人，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)，19673-6(2001)進(jìn)行制備；兩個(gè)發(fā)表文章在此引用作為參考。
反應(yīng)如下進(jìn)行設(shè)置。等分的5μl細(xì)胞裂解物、裂解緩沖液中為所示濃度的合成miRNA靶(Eis等人，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)，19673-6(2001))或5μl 20ng/μl tRNA(作為無靶對(duì)照)用移液器加入到微量滴定平板適當(dāng)?shù)目字?。初?jí)反應(yīng)總體混合物被制成用于96個(gè)反應(yīng)，含有下面的試劑。
5μl初級(jí)反應(yīng)總體混合物的分裝物加入到含有適當(dāng)靶或?qū)φ盏目字?。所述平板用礦物油(10μl)覆蓋并且在53℃孵育2小時(shí)。初級(jí)反應(yīng)完成后，5μl的下列組分加入到每個(gè)孔中，并且所述平板在60℃孵育1.5小時(shí)。所述平板使用上面描述的設(shè)置進(jìn)行讀數(shù)(見實(shí)施例2)。
所有靶以四復(fù)樣進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)總RNA和細(xì)胞裂解物進(jìn)行試驗(yàn)之不同細(xì)胞數(shù)所獲得的平均計(jì)數(shù)作圖于圖15中。從已知量的合成let-7amiRNA的INVADER試驗(yàn)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線被用于外推每個(gè)細(xì)胞的let-7a拷貝數(shù)。產(chǎn)生細(xì)胞裂解物之細(xì)胞的數(shù)量在細(xì)胞裂解之前的接種程序過程中如Eis等人，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)，19673-6(2001)中描述地進(jìn)行測(cè)定，此處引用作為參考。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在從156個(gè)細(xì)胞獲得的總RNA提取物中達(dá)到了細(xì)胞裂解物的檢測(cè)限。
B.沒有Mg++存在的裂解
可選的裂解程序開展如下。已經(jīng)指出當(dāng)使用上面的裂解程序時(shí)，長(zhǎng)mRNA，即來自GADPH，沒有檢測(cè)到預(yù)期的量。進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)以檢查Mg++對(duì)裂解物中RNA提取的作用。在有或無MgCl2存在下裂解的提取物與使用如上面描述地使用TRIZOL制備的總細(xì)胞RNA提取物進(jìn)行比較。
Hela細(xì)胞(7.5×106細(xì)胞)懸浮在100μl的帶有100mM KCl之10mM MOPS緩沖溶液中，pH7.5。10μl分裝物加入到單獨(dú)(separate)的試管內(nèi)并且用100μl如下制備的兩個(gè)不同裂解緩沖液裂解
所有的試管然后在80℃孵育15分鐘以裂解細(xì)胞，然后離心收集碎片。各種裂解物5μl的分裝物如下加入到INVADER反應(yīng)。
初級(jí)INVADER反應(yīng)如上面let-7a描述的；GADPH(SEQ ID NO41-43)和U6(SEQ ID NO45-47在50nM終濃度)的PI寡核苷酸混合物也被制成。
*初級(jí)INVADER反應(yīng)如上面let-7a描述的；GADPH(SEQ ID NO41-43)和U6(SEQ ID NO45-47在50nM終濃度)的PI寡核苷酸混合物也被制成。
初級(jí)反應(yīng)混合物在49℃孵育1小時(shí)。下面第二反應(yīng)混合物的分裝物然后被加入
次級(jí)反應(yīng)混合物包括在如實(shí)施例7A中所示濃度的SRT(對(duì)于let-7，SEQ ID NO22；對(duì)于GADPH和U6，SEQ ID NO49)靶，F(xiàn)RET寡核苷酸(對(duì)于let-7，SEQ ID NO21；對(duì)于GADPH和U6，SEQ ID NO48)，arrestors(對(duì)于let-7，SEQ IN NO7；對(duì)于GAPDH，SEQ ID NO43以及對(duì)于U6，SEQ ID NO47)。
次級(jí)反應(yīng)在60℃進(jìn)行1小時(shí)。反應(yīng)在如實(shí)施例2中描述的CYTOFLUOR微量平板讀取器進(jìn)行讀數(shù)。結(jié)果呈現(xiàn)在圖16中，表明GAPDH信號(hào)的存在依賴于裂解緩沖液中無Mg++的存在，而U6 RNA信號(hào)不管有無Mg++的存在都保持相對(duì)恒定。額外的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所有的RNA在與無Mg++存在的裂解中獲得那些RNA相當(dāng)水平的總細(xì)胞RNA中是可檢測(cè)到的。
實(shí)施例8
多種miRNA檢測(cè)備選的INVADER試驗(yàn)設(shè)計(jì)
A.let-7A檢測(cè)備選設(shè)計(jì)
這個(gè)實(shí)施例描述了let-7a miRNA檢測(cè)備選的寡核苷酸設(shè)計(jì)的創(chuàng)造和測(cè)試。在一系列的實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生了一套可選的設(shè)計(jì)，其中所述INVADER寡核苷酸和所述探針寡核苷酸的靶特異性區(qū)域均是11個(gè)核苷酸長(zhǎng)。產(chǎn)生了第二套設(shè)計(jì)，其中所述探針寡核苷酸的靶特異性區(qū)域是10個(gè)核苷酸長(zhǎng)，所述INVADER寡核苷酸是12個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
1.寡核苷酸設(shè)計(jì)
a.11聚體探針和INVADER寡核苷酸設(shè)計(jì)
圖5顯示了檢測(cè)let-7a miRNA備選的核苷酸設(shè)計(jì)，其中探針和INVADER寡核苷酸的靶特異性區(qū)域都是11個(gè)核苷酸長(zhǎng)。SEQ ID NO50-51提供了所述INVADER和探針都是線性的設(shè)計(jì)。SEQ ID NO6含有形成了莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針寡核苷酸；SEQ ID NO5，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的INVADER寡核苷酸)；SEQ ID NO5-6，兩個(gè)都有莖環(huán)的探針和INVADER寡核苷酸。
b.10聚體探針和12聚體INVADER寡核苷酸設(shè)計(jì)
圖5顯示了檢測(cè)let-7a miRNA的一套備選的寡核苷酸設(shè)計(jì)，其中所述探針的靶特異性區(qū)域包含10個(gè)核苷酸，INVADER寡核苷酸的那些靶特異性區(qū)域包含12個(gè)核苷酸。SEQ ID NO52-53提供了INVADER和探針寡核苷酸都是線性的設(shè)計(jì)。SEQ ID NO2含有形成了莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針寡核苷酸；SEQ ID NO1，形成了莖環(huán)結(jié)構(gòu)的INVADER寡核苷酸。
2.Let-7a miRNA之檢測(cè)備選寡核苷酸設(shè)計(jì)的溫度最優(yōu)化譜(profile)
溫度最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下?？偤突旌衔锉恢瞥捎糜?4個(gè)反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)含有下面的
*探針和INVADER寡核苷酸的多種組合如圖16-17所示用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)中。
次級(jí)反應(yīng)混合物如let-7的實(shí)施例3中描述的。適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，制成ARRESTOR序列以對(duì)應(yīng)(compliment)所述探針完整的環(huán)和靶特異性區(qū)域，且朝著所述探針5′末端延伸6個(gè)堿基。
在11聚體溫度最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的情況下，初級(jí)反應(yīng)在50±9℃進(jìn)行1小時(shí)，之后是如實(shí)施例2中描述的在60℃下15分鐘的次級(jí)反應(yīng)。對(duì)于所述10聚體探針，和12聚體INVADER寡核苷酸一起，初級(jí)反應(yīng)在50±9℃進(jìn)行15分鐘，之后是在60℃的15分鐘的次級(jí)反應(yīng)。
其中INVADER和探針寡核苷酸的靶特異性部分是11個(gè)核苷酸長(zhǎng)之設(shè)計(jì)的結(jié)果呈現(xiàn)在圖18中。圖18A顯示了每個(gè)設(shè)計(jì)的溫度最優(yōu)化譜。圖18B顯示了每個(gè)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化的最大限度的執(zhí)行，包括每個(gè)設(shè)計(jì)的最優(yōu)溫度。其中探針寡核苷酸的靶特異性部分是10個(gè)堿基，INVADER寡核苷酸是12個(gè)堿基之設(shè)計(jì)的結(jié)果呈現(xiàn)在圖19中。圖19A顯示了溫度最優(yōu)化譜，并且圖19B顯示了每個(gè)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化的最大限度的執(zhí)行。
這些結(jié)果的檢查提示，設(shè)計(jì)導(dǎo)致最大限度執(zhí)行的設(shè)計(jì)取決于反應(yīng)條件和形成的miRNA-寡核苷酸雜交體的相對(duì)穩(wěn)定性的不同而不同。例如，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸的靶特異性區(qū)域都是11個(gè)堿基長(zhǎng)時(shí)，所述探針靶特異性區(qū)域具有49℃的預(yù)期Tm，所述INVADER靶特異性區(qū)域有37℃的預(yù)期Tm。在這個(gè)情況下，INVADER寡核苷酸-miRNA相互作用的穩(wěn)定化給這個(gè)設(shè)計(jì)提供了改善的試驗(yàn)實(shí)施。然而，對(duì)于探針是10聚體并且INVADER寡核苷酸是12聚體的let-7a設(shè)計(jì)，所述兩個(gè)寡核苷酸的靶特異性區(qū)域具有大約相等的Tm。在這個(gè)情況下，兩個(gè)寡核苷酸均是環(huán)狀的設(shè)計(jì)運(yùn)行地最好。
3.使用兩個(gè)可選設(shè)計(jì)的let-7a的LOD
實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例3中描述地進(jìn)行設(shè)置以比較所述雙環(huán)設(shè)計(jì)和所述單環(huán)設(shè)計(jì)的LOD，其中INVADER寡核苷酸形成了莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
測(cè)定LOD的反應(yīng)以四復(fù)樣進(jìn)行。反應(yīng)混合物含有下面的試劑(終濃度)
5μl miRNA的分裝物以圖20中指出的終濃度加入到含有反應(yīng)混合物的孔中。初級(jí)反應(yīng)在實(shí)施例8B中測(cè)定的每個(gè)設(shè)計(jì)的最優(yōu)化溫度(成環(huán)的INVADER寡核苷酸設(shè)計(jì)為50℃，雙環(huán)設(shè)計(jì)為53℃)進(jìn)行1.5小時(shí)。次級(jí)反應(yīng)如在實(shí)施例2和3中描述地進(jìn)行設(shè)置并且在60℃進(jìn)行1小時(shí)。
圖20中的結(jié)果顯示了產(chǎn)生的凈信號(hào)，其為miRNA摩爾量的函數(shù)。所述圖表的線性范圍指出使用所述INVADER環(huán)狀設(shè)計(jì)比雙環(huán)設(shè)計(jì)從特定量的miRNA產(chǎn)生更多的信號(hào)。相似地，圖20中所述表的檢查表明在每個(gè)miRNA水平高于零的倍數(shù)數(shù)值比單環(huán)設(shè)計(jì)的更大。兩個(gè)設(shè)計(jì)在測(cè)試的最低濃度(等同于大約16,000分子的2.68×10-20摩爾或26.8仄摩爾(zeptomole))得到了足夠的FOZ。
4.全長(zhǎng)的對(duì)于截短的ARRESTOR寡核苷酸
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)例如如圖4和12中所示的全長(zhǎng)ARRESTOR分子對(duì)于截?cái)嗟腁RRESTOR分子的相對(duì)性能，其中所述全長(zhǎng)的ARRESTOR分子在環(huán)周圍的其5′末端延伸，貫穿探針miRNA特異性區(qū)域的全長(zhǎng)并且至5′flap區(qū)域，所述截短的ARRESTOR分子僅僅互補(bǔ)于探針的miRNA特異性區(qū)域和所述5′flap的一部分，但是不延伸到環(huán)狀區(qū)域或更遠(yuǎn)區(qū)域。反應(yīng)如下進(jìn)行設(shè)置以檢測(cè)合成的let-7amiRNA
6μl初級(jí)反應(yīng)混合物的分裝物加入到微量滴定平板適當(dāng)?shù)目字?，之后加入如下表中指出?μl合成let-7a miRNA的分裝物或4μl溶于蒸餾水的10ng/μl tRNA的分裝物。初級(jí)INVADER反應(yīng)在53℃孵育1.5小時(shí)。
次級(jí)反應(yīng)混合物的分裝物如下加入
次級(jí)反應(yīng)在60℃孵育1.5小時(shí)。微量滴定平板如實(shí)施例2描述地進(jìn)行讀數(shù)。結(jié)果顯示在圖17中。
這些結(jié)果表明，當(dāng)互補(bǔ)于所述探針miRNA特異性部分的全長(zhǎng)的或截?cái)嗟腁RRESTOR寡核苷酸用于次級(jí)INVADER反應(yīng)中時(shí)，信號(hào)的產(chǎn)生或檢測(cè)限沒有明顯地不同。
B.使用線性探針和INVADER寡核苷酸可選的設(shè)計(jì)
對(duì)可選的設(shè)計(jì)進(jìn)行測(cè)試，其中所述探針和INVADER寡核苷酸都含有通用序列，并且沒有寡核苷酸形成發(fā)夾。所述設(shè)計(jì)的示意圖呈現(xiàn)在圖4中。所述通用序列存在于INVADER寡核苷酸的5′末端和探針寡核苷酸的3′末端。加入短的互補(bǔ)的“捕獲”寡核苷酸，并且包含2′-氧-甲基殘基，允許它在miRNA(例如SEQ ID NO60)的存在下促進(jìn)同軸堆積。產(chǎn)生miR-15(SEQ ID NO58、59和60)和mir-135(SEQID NO63-65)的設(shè)計(jì)。最初的設(shè)計(jì)雖然在無miRNA靶的存在下導(dǎo)致了高的非特異性背景信號(hào)，但是指出了用這樣的通用捕獲寡核苷酸檢測(cè)miRNA是可行的。
實(shí)施例9
環(huán)中核苷酸殘基2′-氧-甲基化的作用
這個(gè)實(shí)施例描述了旨在評(píng)定用于檢測(cè)miRNA之整合于所述探針和INVADER寡核苷酸中的一些或全部2′-氧-甲基殘基被2′-脫氧殘基取代的作用的實(shí)驗(yàn)。在前述的實(shí)施例中呈現(xiàn)的所有設(shè)計(jì)都包括了如實(shí)施例2中描述的所述環(huán)區(qū)域中的2′-氧-甲基殘基。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)試為了檢測(cè)let-7a miRNA設(shè)計(jì)的INVADER和探針寡核苷酸中一些或全部2′-氧-甲基殘基被2′脫氧殘基取代的作用。
圖5顯示了改良的let-7a設(shè)計(jì)。SEQ ID NO5-6含有如實(shí)施例2中描述的2′-氧-甲基殘基。SEQ ID NO73-74中的設(shè)計(jì)在所有的位置都含有2′脫氧殘基；并且在SEQ ID NO75-76中的那些設(shè)計(jì)，在鄰近靶的所述莖干部分中含有2′-氧-甲基殘基。
進(jìn)行INVADER反應(yīng)以比較三個(gè)不同設(shè)計(jì)的信號(hào)產(chǎn)生和溫度的最優(yōu)化。反應(yīng)如實(shí)施例8中LOD試驗(yàn)中描述的，包括100pM合成的miRNA、1μM探針和10μM INVADER寡核苷酸。初級(jí)反應(yīng)在所示溫度進(jìn)行15分鐘；次級(jí)反應(yīng)在60℃進(jìn)行5分鐘。
INVADER試驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖21中，顯示其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)包含2′-氧-甲基殘基的設(shè)計(jì)產(chǎn)生最多的信號(hào)，之后是其中鄰近靶的堿基包含2′-氧-甲基殘基的設(shè)計(jì)。完全包含2′-脫氧殘基的寡核苷酸產(chǎn)生最低水平的信號(hào)。
另一套實(shí)驗(yàn)如下設(shè)計(jì)以測(cè)試額外的設(shè)計(jì)變異有更短發(fā)夾的探針和INVADER寡核苷酸，有更穩(wěn)定的環(huán)的或可選的有更短的環(huán)的探針和INVADER寡核苷酸，只有三個(gè)2′-氧-甲基殘基的探針和INVADER寡核苷酸。初級(jí)反應(yīng)如下設(shè)置以測(cè)試miR-15的檢測(cè)。
對(duì)下面的探針/INVADER寡核苷酸的聯(lián)合進(jìn)行測(cè)試。
初級(jí)反應(yīng)混合物如下制成
5μl初級(jí)反應(yīng)混合物的分裝物以下面的終量加入到5μl合成的miR-15RNA0、0.1阿摩爾(amole)、0.33阿摩爾、1.09阿摩爾。初級(jí)反應(yīng)在52.5℃孵育2小時(shí)。
次級(jí)反應(yīng)混合物如下制成
加入5μl的分裝物，反應(yīng)在600℃孵育45分鐘。
結(jié)果，以相對(duì)熒光單位(RFU)，呈現(xiàn)如下。
這些結(jié)果提示，其中探針寡核苷酸含有截短的發(fā)夾和包含2′-氧-甲基殘基的高度穩(wěn)定的四環(huán)探針寡核苷酸的設(shè)計(jì)與最初的INVADER寡核苷酸的設(shè)計(jì)(2′-氧-甲基殘基，TTTT環(huán)，長(zhǎng)發(fā)夾)相組合，可以產(chǎn)生稍微更高的FOZ值。否則，沒有一個(gè)可選的設(shè)計(jì)寡核苷酸套提供了任何在最初設(shè)計(jì)之上的提高。值得注目的是所有DNA寡核苷酸與最初嵌合探針寡核苷酸的組合給出大約等同于用嵌合探針和INVADER寡核苷酸獲得的那些FOZ值。在一些應(yīng)用中，所有DNAINVADER寡核苷酸的取代是期望的，以降低寡核苷酸合成成本，并且制備不會(huì)犧牲檢測(cè)限。
更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明了通過往反應(yīng)中加入更多的RNA(例如裂解物、純化的總RNA、合成的miRNA)用特別的寡核苷酸集合補(bǔ)償亞優(yōu)化(suboptimal)信號(hào)的產(chǎn)生是可能的。相似地，如實(shí)施例1中描述的各種寡核苷酸(即探針、INVADER、ARRESTOR或其多種組合)被凝膠純化的額外的實(shí)驗(yàn)指出，所有三種類型寡核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)凝膠純化給出了最大的信號(hào)。如果其它的寡核苷酸，即INVADER和ARRESTOR寡核苷酸在合成之后脫鹽，那么獲得大約等于用凝膠純化探針的最大水平的信號(hào)水平是可能的。
實(shí)施例10
來自多重組織類型的總RNA中miRNA表達(dá)的檢測(cè)
這個(gè)實(shí)施例描述了為了測(cè)試INVADER試驗(yàn)的適當(dāng)性進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)提取自不同組織類型的總RNA中不同的miRNA類型。為了評(píng)價(jià)組織特異性基因表達(dá)，每一個(gè)設(shè)計(jì)的溫度最優(yōu)化和LOD先被測(cè)定。
1.INVADER和探針寡核苷酸設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)INVADER試驗(yàn)寡核苷酸以檢測(cè)miR-15、miR-16和miR125bmiRNA種類。這些試驗(yàn)的設(shè)計(jì)呈現(xiàn)在圖5中。Let-7a和miR-135的設(shè)計(jì)分別在實(shí)施例2和6中有描述。
2.溫度最優(yōu)化和LOD的測(cè)定
為了每一個(gè)這些寡核苷酸組合，溫度最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例8中描述地而被實(shí)施。每一個(gè)初級(jí)反應(yīng)包括1nM靶miRNA，并且在50±9℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行15分鐘。次級(jí)反應(yīng)如實(shí)施例2中描述的，并且在60℃進(jìn)行1至1.5小時(shí)。最優(yōu)溫度如下
一旦獲得溫度最優(yōu)化，每個(gè)miRNA種類的LOD如實(shí)施例8中描述地進(jìn)行測(cè)定。所有LOD是30仄摩爾。
3.基因表達(dá)譜(profiling)
基因表達(dá)譜在提取自20個(gè)不同組織類型的總RNA上進(jìn)行?？俁NA從Clontech購買(Palo Alto，CA，目錄號(hào)K4008-1，Human TotalRNA Master Paneln)。對(duì)于let-7a，每個(gè)反應(yīng)中對(duì)50ng的總RNA進(jìn)行測(cè)試；對(duì)于其它的miRNA種類，對(duì)100ng的總RNA進(jìn)行測(cè)試。所有反應(yīng)如實(shí)施例8中所述進(jìn)行設(shè)置；初級(jí)反應(yīng)在最優(yōu)溫度進(jìn)行1.5小時(shí)；次級(jí)反應(yīng)是如上描述的。
每個(gè)miRNA種類的基因表達(dá)譜呈現(xiàn)在圖23中。這些結(jié)果指出INVADER試驗(yàn)?zāi)鼙挥糜跈z查不同組織類型中miRNA的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步提示let-7a和miR-125b表達(dá)于各種各樣的組織中；其它的miRNA種類似乎對(duì)于有限數(shù)量的組織類型更有特異性。
實(shí)施例11
不同的寡核苷酸長(zhǎng)度對(duì)miRNA的INVADER試驗(yàn)檢測(cè)的作用
這個(gè)實(shí)施例描述了探針和INVADER寡核苷酸長(zhǎng)度的改變對(duì)let-7a 22個(gè)核苷酸的miRNA檢測(cè)的影響。特別地是，這些實(shí)驗(yàn)比較了如下兩種miRNA的檢測(cè)所述探針和INVADER寡核苷酸的末端之間形成理想堆積相互作用的miRNA的檢測(cè)，和形成5′和3′重疊的miRNA的檢測(cè)以及在所述5′和3′末端得到單個(gè)核苷酸缺口的miRNA的檢測(cè)。
圖24顯示了分析三種類型設(shè)計(jì)的結(jié)果。SEQ ID NO5-6顯示了22個(gè)核苷酸靶與成環(huán)的探針和INVADER寡核苷酸的側(cè)面末端之間完美的堆積。在SEQ ID NO83-84中，探針和INVADER寡核苷酸都延伸了一個(gè)堿基，得到了5′和3′重疊。在SEQ ID NO85-86中，探針和INVADER寡核苷酸相對(duì)于SEQ ID NO5-6的設(shè)計(jì)都截短了一個(gè)堿基，得到了在兩個(gè)末端的一個(gè)核苷酸缺口。
設(shè)置INVADER試驗(yàn)以測(cè)試這些寡核苷酸組合對(duì)于合成let-7amiRNA檢測(cè)的執(zhí)行。反應(yīng)如實(shí)施例8中所述進(jìn)行，包括100pM合成的let-7a miRNA、1μM探針和10pM INVADER寡核苷酸。初級(jí)反應(yīng)在53℃進(jìn)行15分鐘；次級(jí)反應(yīng)如實(shí)施例2中描述地在60℃進(jìn)行5分鐘。結(jié)果呈現(xiàn)在圖24中。
這些數(shù)據(jù)指出在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在miRNA靶兩個(gè)末端的單個(gè)核苷酸重疊導(dǎo)致信號(hào)的產(chǎn)生降低大約30％，最優(yōu)溫度降低2℃。然而，所述靶兩個(gè)末端的一個(gè)核苷酸缺口都不降低信號(hào)的產(chǎn)生，但是它確實(shí)降低了最優(yōu)反應(yīng)溫度5℃。
實(shí)施例12
miRNA與前體RNA以及與編碼DNA的區(qū)別
為了測(cè)定INVADER miRNA試驗(yàn)是否能從miRNA靶的前體RNA以及從編碼所述miRNA的DNA區(qū)分miRNA靶本身而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
A.前體交叉反應(yīng)性測(cè)試
前體let-7 RNA(SEQ ID NO87)體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析以測(cè)定它是否含有模仿let-7a miRNA的任何片段。最短的污染片段估計(jì)是大約45個(gè)核苷酸。LOD反應(yīng)基本上如實(shí)施例3中描述地在如下表中指出的前體或合成的5′P let-7a miRNA濃度下進(jìn)行。PI混合物含有10pM探針SEQ ID NO6和100μM INVADER寡核苷酸SEQ ID NO5。初級(jí)反應(yīng)在53℃進(jìn)行1小時(shí)；基本上如實(shí)施例3中描述的次級(jí)反應(yīng)混合物(FRET探針SEQ ID NO21，SRT SEQ ID NO22和ARRESTOR SEQ ID NO7)的次級(jí)反應(yīng)在58℃進(jìn)行1小時(shí)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果指出這個(gè)miRNA試驗(yàn)對(duì)于前體RNA有大約4％的交叉反應(yīng)性。
B.RNA對(duì)DNA信號(hào)的區(qū)別
為了檢測(cè)細(xì)胞裂解物中的let-7a miRNA如實(shí)施例7中所述進(jìn)行反應(yīng)。在用INVADER試驗(yàn)的檢測(cè)之前，1μl 8μg/μl RNAse A(Qiagen公司)的分裝物加入到80μl細(xì)胞裂解物中并且在37℃孵育2.25個(gè)小時(shí)。RNAse A處理的樣品不能產(chǎn)生任何背景之上的信號(hào)，指出缺乏RNAse A的試驗(yàn)中產(chǎn)生的信號(hào)起因于miRNA靶，而不是編碼DNA的檢測(cè)(圖16)。進(jìn)行更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，其中RNAse A在初級(jí)反應(yīng)之前或次級(jí)反應(yīng)之前加入。當(dāng)RNAse A在初級(jí)反應(yīng)之前加入時(shí)，沒有信號(hào)產(chǎn)生，與以前的結(jié)果一致。當(dāng)RNAse A在初級(jí)反應(yīng)之后加入，沒有觀察到丟失的信號(hào)，進(jìn)一步指出檢測(cè)的信號(hào)是因?yàn)镽NA并且RNAse對(duì)例如CLEAVASE酶的其它反應(yīng)組分沒有不利的作用。
實(shí)施例13
雙重形式miRNA的檢測(cè)
產(chǎn)生為了miR-124a的寡核苷酸設(shè)計(jì)。這些寡核苷酸能用于檢測(cè)兩個(gè)天然發(fā)生的miRNA，一個(gè)長(zhǎng)21個(gè)核苷酸，另一個(gè)22個(gè)核苷酸。
溫度最優(yōu)化反應(yīng)基本上如實(shí)施例3中描述地被設(shè)置，使用1nM合成的miRNA靶、25分鐘的初級(jí)反應(yīng)和15分鐘的次級(jí)反應(yīng)。這些反應(yīng)中使用的寡核苷酸列于圖5中(SEQ ID NO90-92)。兩個(gè)不同長(zhǎng)度的miRNA靶的溫度譜(profile)顯示在圖22中并且指出相同的寡核苷酸設(shè)計(jì)能被用于檢測(cè)兩個(gè)靶。
實(shí)施例14
siRNA檢測(cè)的寡核苷酸設(shè)計(jì)
與前述的實(shí)施例中描述的那些相似的方法可以相似地被用于檢測(cè)siRNA。圖25闡述了β-肌動(dòng)蛋白siRNA檢測(cè)的兩個(gè)可選的INVADER試驗(yàn)設(shè)計(jì)。這個(gè)siRNA在Harborth，J.等人，細(xì)胞科學(xué)雜志(Journalof Cell Science)，1144557-4565(2001)中有描述。對(duì)于每個(gè)有義和反義鏈存在一個(gè)設(shè)計(jì)；檢測(cè)這個(gè)siRNA的示范性實(shí)例的寡核苷酸列于圖6中，SEQ ID NO101-106。
上面詳述中提到的所有出版物和專利此處引用作為參考。本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)的各種修飾和變異對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的，而不偏離本發(fā)明的領(lǐng)域和精神。盡管本發(fā)明連同特別的優(yōu)選實(shí)施例有描述，應(yīng)當(dāng)理解所要求的本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)被不適當(dāng)?shù)叵拗朴谶@樣特別的實(shí)施方案。當(dāng)然，對(duì)分子生物學(xué)、基因或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的為了進(jìn)行本發(fā)明所描述的模式的各種修飾意在落入下面的權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種方法，包括
a)將干擾RNA靶雜交于至少一種核酸，所述核酸含有不互補(bǔ)于所述干擾RNA靶以產(chǎn)生檢測(cè)結(jié)構(gòu)的序列；以及
b)檢測(cè)所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述干擾RNA靶是miRNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述干擾RNA靶是siRNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述siRNA是雙鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)包含侵入性切割結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)包含為了形成聯(lián)合所述miRNA的侵入性切割結(jié)構(gòu)而配置的第一和第二寡核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)包含為了形成聯(lián)合所述miRNA的侵入性切割結(jié)構(gòu)而配置的第一寡核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述3′部分為了雜交于所述靶序列而配置，其中所述5′部分為了不雜交于所述靶序列而配置。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述5′部分為了雜交于所述靶序列而配置，其中所述3′部分為了不雜交于所述靶序列而配置。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)包括侵入性切割試驗(yàn)的使用。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)包含雜交于所述miRNA的環(huán)形寡核苷酸以產(chǎn)生環(huán)形檢測(cè)結(jié)構(gòu)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述檢測(cè)包括滾環(huán)復(fù)制試驗(yàn)的使用。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)包括選自如下的檢測(cè)試驗(yàn)的使用測(cè)序試驗(yàn)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)、雜交試驗(yàn)、采用互補(bǔ)于突變的探針之雜交試驗(yàn)、微陣列試驗(yàn)、珠子陣列試驗(yàn)、引物延伸試驗(yàn)、酶錯(cuò)配切割試驗(yàn)、支鏈雜交試驗(yàn)、NASBA試驗(yàn)、分子信標(biāo)試驗(yàn)、循環(huán)探針試驗(yàn)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)、侵入性切割結(jié)構(gòu)試驗(yàn)、ARMS試驗(yàn)以及夾心雜交試驗(yàn)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)在細(xì)胞裂解物中進(jìn)行。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)多種不同的miRNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述多種miRNA包含第一miRNA和第二miRNA，所述第二miRNA為具有多態(tài)性的所述第一miRNA。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步地包括檢測(cè)第二核酸靶。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述第二核酸靶是RNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述第二核酸靶選自U6和GAPDH。
20.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述miRNA選自Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR125b、miR-1d和miR124a。
21.一種試劑盒，其包含為了當(dāng)雜交于干擾RNA靶序列時(shí)形成檢測(cè)結(jié)構(gòu)而配置的核酸，其中所述核酸包含不互補(bǔ)于所述干擾RNA靶序列的序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)包含侵入性切割結(jié)構(gòu)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的試劑盒，其中所述第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述3′部分為了雜交于所述靶序列而配置，其中所述5′部分為了不雜交于所述靶序列而配置。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的試劑盒，其中所述第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述5′部分為了雜交于所述靶序列而配置，其中所述3′部分為了不雜交于所述靶序列而配置。
25.根據(jù)權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)包含雜交于所述miRNA的環(huán)形寡核苷酸以產(chǎn)生環(huán)形檢測(cè)結(jié)構(gòu)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)是用于滾環(huán)復(fù)制試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)構(gòu)。
27.根據(jù)權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述干擾RNA靶是miRNA。
28.根據(jù)權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述干擾RNA靶是siRNA。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述miRNA選自Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR-lb、miR-124a和miR125b。
30.根據(jù)權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述試劑盒為了檢測(cè)miRNA靶和至少一個(gè)其它的RNA靶而配置。
31.根據(jù)權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述試劑盒為了檢測(cè)細(xì)胞裂解物中所述干擾RNA靶序列而配置。
全文摘要
本發(fā)明涉及干擾RNA(諸如微小RNA(miRNA)和小干擾RNA(siRNA))和其它短核酸分子的組合物及其檢測(cè)和表征的方法。更加特別地，本發(fā)明涉及干擾RNA表達(dá)的檢測(cè)和定量分析的改進(jìn)方法。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了miRNA和siRNA的變異體和類型的檢測(cè)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1753993SQ20038010977
公開日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月18日
發(fā)明者J·E·達(dá)爾伯格, H·T·阿拉維, V·萊米柴夫, B·P·奈里, M·奧爾森－穆諾茲, L·柴哈克, S·M·奧爾森 申請(qǐng)人:第三次浪潮技術(shù)公司