一種氧化響應(yīng)去正電荷的陽離子聚合物、制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于高分子和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種氧化響應(yīng)去正電荷的陽離子聚 合物、制備方法和作為基因輸送載體的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因治療即將核酸藥物輸送到靶細胞中從而達到治療目的，已被證明是一種有效 的具有低副作用的治療癌癥的方法。目前常用的輸送載體可以分為病毒載體和非病毒載 體。非病毒載體包括陽尚子的脂質(zhì)體、聚合物、樹枝狀大分子、多肽等，與病毒載體相比具有 良好的安全性，低免疫原性，生物相容性和易于大量生產(chǎn)等優(yōu)點。但是較之病毒載體，較低 的轉(zhuǎn)染效率一直是困擾其應(yīng)用的瓶頸，需要通過化學修飾來提高非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。
[0003] 在非病毒載體中，陽離子聚合物常用來中和DNA的負電并將其壓縮成納米顆粒從 而保護DNA不被降解，并幫助其進入細胞。然而通過正/負靜電相互作用形成的陽離子聚合 物/核酸藥物復(fù)合物納米顆粒是熱力學穩(wěn)定的，該納米復(fù)合物進入細胞后很難解離釋放出 核酸藥物，導(dǎo)致核酸藥物難以發(fā)揮藥效。因此，需要設(shè)計能夠響應(yīng)細胞內(nèi)微環(huán)境而能夠快速 釋放出核酸藥物的載體，提高核酸藥物的藥效。為此，本發(fā)明提供一種聚合物的制備方法， 該聚合物能夠在細胞外時帶正電荷以與DNA緊密絡(luò)合、而一旦進入細胞后能夠發(fā)生反應(yīng)使 正電荷消失或變得帶負電荷，從而快速與DNA快速解離，促進DNA的表達。
[0004] 由于腫瘤異常的生理特點，使得其釋放出大量的活性氧自由基（R0S)，包括過氧 化氫（H202)、超氧陰離子（0 2_)、氫氧根自由基（0H*)，這些活性氧自由基能夠?qū)⒈脚鹚?或酯氧化為酚基，進而觸發(fā)酚基芐醇脫落的反應(yīng)，應(yīng)用于藥物的釋放（Broad ers，K.E.; Grandhe, S. ；Frechet, J. M. , A biocompatible oxidation-triggered carrier polymer with potential in therapeutics. J Am Chem Soc 2011, 133(4), 756-8.)。硼酸可以和二 醇形成環(huán)形的硼酯，因此可以用來提高與腫瘤細胞或者基因輸送中的DNA和RNA的核苷酸 的相互作用（Piest，M. ；Engbersen, J. F. , Role of boronic acid moieties in poly(amido amine)s for gene delivery. J Control Release 2011, 155(2), 331-40.)，而且硼酸和硼 酯對人體沒有毒副作用。
[0005] 本發(fā)明中的聚合物就是含硼酸或硼酯取代芐基季銨鹽，利用細胞內(nèi)的R0S氧化苯 硼酸或酯、觸發(fā)其電荷的反轉(zhuǎn)。目前沒有這種去陽離子聚合物的報道，同樣也沒有對其制備 方法和應(yīng)用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種氧化響應(yīng)去正電荷的陽離子聚合物苯硼酸芐基季胺化的聚合 物帶有大量正電荷，能與帶負電的DNA等核酸藥物通過靜電自組裝形成穩(wěn)定的納米復(fù)合 物。進入細胞后，硼酸或硼酯被R0S氧化時發(fā)生去酚基芐醇反應(yīng)，季銨鹽會變?yōu)槿壈罚S 后可通過自催化酯鍵水解生成帶負電的聚合物，從而與帶負電的核酸藥物相互排斥而與快 速解離，釋放出核酸藥物進行有效轉(zhuǎn)染。
[0007] 本發(fā)明同時還公開了上述氧化響應(yīng)去正電荷的陽離子聚合物在作為基因輸送載 體及其在基因輸送中的應(yīng)用。本發(fā)明制備的是高效、低毒的非病毒基因輸送載體，其與DNA 形成的納米復(fù)合物具有高的轉(zhuǎn)染效率。
[0008] -種氧化響應(yīng)去正電荷的陽離子聚合物，其特征在于，包括如下片段：
[0009]
[0010] 上式中：
[0011] Ri、R2分別獨立的為C1-C6的烷基或芳香基；
[0012] R3、R4分別獨立的為H、C1-C6的烷基?；?br>[0013] m為1-4的正整數(shù)；
[0014] 陰離子為溴離子或氯離子。
[0015] 作為優(yōu)選，所述陽離子聚合物由聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或其他含一級、二級 氨基的聚合物與含有硼酸或硼酸酯基芐基-三烷基季胺基化合物反應(yīng)制備得到。
[0016] 作為進一步優(yōu)選，所述其他含一級、二級氨基的聚合物包括如聚乙烯亞胺、聚胺基 酰胺樹枝狀大分子。
[0017] 作為優(yōu)選，上述r3、r4Sh、乙?；蚣柞；瑢?yīng)的為硼酸或硼酸甲酯、硼酸乙酯， Ri、R2為甲基、乙基；m為1-3的正整數(shù)，進一步優(yōu)選為1或2,更進一步優(yōu)選為2。
[0018] 作為優(yōu)選，所述陽離子聚合物為下列化合物（1)~（4)中的至少一種：
[0019]
[0020] 上式中n為重復(fù)單元的個數(shù)5-500 ;進一步優(yōu)選為50-300 %、私分別獨立的為 C1-C6的烷基鏈或芳香基，進一步優(yōu)選為乙基；PAMAM為2-5代中的至少一種。
[0021] 作為優(yōu)選，其中化合物（1)和化合物（2)由下述兩種方法中任--種方法制備得 到：
[0022] 方法一：由N，N-二取代氨基乙基丙烯酸酯或N，N-二取代氨基乙基甲基丙烯酸酯 經(jīng)過聚合反應(yīng)制備得到N，N-二取代氨基乙基聚丙烯酸酯或N，N-二取代氨基乙基聚甲基丙 烯酸酯，然后再與硼酸基卞溴、硼酸酯基卞溴、硼酸基卞氯或硼酸酯基卞氯反應(yīng)得到；
[0023] 方法二：由N，N-二取代氨基乙基丙烯酸酯或N，N-二取代氨基乙基甲基丙烯酸酯 先與硼酸基卞溴、硼酸酯基卞溴、硼酸基卞氯或硼酸酯基卞氯反應(yīng)，生成對應(yīng)的丙烯酸酯單 體，然后進行聚合反應(yīng)得到；
[0024] 所述丙烯酸酯單體包括溴代或氯代（2-丙烯酰氧）乙基（p-硼酸芐基）二乙銨、 溴代或氯代（2-丙烯酰氧）乙基（p-硼酸酯芐基）二乙銨中的一種；
[0025] 作為優(yōu)選，所述的化合物（1)結(jié)構(gòu)如下：
[0026]
[0027] 所述的化合物（2)結(jié)構(gòu)如下：
[0028]
[0029] 以上述化合物（1)為例，其制備方法如下式所示：
[0030]
[0031] 作為優(yōu)選，其中化合物（3)和化合物（4)由下述方法制備得到：丙烯酸酯單體與 聚乙烯亞胺或PAMAM通過邁克爾加成反應(yīng)制備得到；所述丙烯酸酯單體包括由溴代或氯代 (2-丙烯酰氧）乙基（p-硼酸芐基）二乙銨、溴代或氯代（2-丙烯酰氧）乙基（p-硼酸酯芐 基）二乙銨中的一種。
[0032] 作為優(yōu)選，所述化合物（3)的結(jié)構(gòu)如下：
[0033]
[0034] 其制備方法如下式所示：
[0035]
D
[0036] 作為優(yōu)選，所述化合物（4)的結(jié)構(gòu)如下：
[0037]
[0038] 其制備方法如下式所示：
[0039]
[0040] 本發(fā)明的氧化響應(yīng)去正電荷的陽離子聚合物能夠被過氧化氫等氧化而去掉季銨 鹽正電荷作用下季銨鹽會變?yōu)槿壈?，隨后通過自催化酯鍵水解生成帶負電的羧酸基，以 上述化合物（1)為例，其電荷反轉(zhuǎn)的過程如下式所示：
[0041]
[0042] 本法還提供了一種上述氧化響應(yīng)去正電荷的陽離子聚合物在輸送DNA及核酸短 鏈中的應(yīng)用。
[0043] 本法還提供了一種上述氧化響應(yīng)去正電荷的陽離子聚合物在輸送紫杉醇中的應(yīng) 用。
[0044] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0045] (1)本發(fā)明制備的氧化響應(yīng)去正電荷反轉(zhuǎn)型基因輸送載體結(jié)構(gòu)簡單、易于合成；
[0046] (2)不同于一般的季胺化載體（如用碘甲烷季胺化的聚N，N-二取代氨基乙基丙 烯酸酯）將核酸藥物包裹太緊、形成的納米復(fù)合物過于穩(wěn)定、在細胞內(nèi)無法與DNA解離的缺 點，本發(fā)明制備的硼酸（酯）芐基季胺化陽離子聚合物在細胞內(nèi)R0S作用下季銨鹽會變?yōu)?三級胺，隨后通過自催化酯鍵水解生成帶負電的羧酸基，促使與DNA的核酸藥物解離而使 其有效轉(zhuǎn)染。
[0047] (3)本發(fā)明制備的硼酸（酯）芐基季胺化陽離子聚合物在細胞中均表現(xiàn)出較高的 轉(zhuǎn)染活性（與PEI 25KDa相比），同時具有較低的細胞毒性。
【附圖說明】
[0048] 圖1為本發(fā)明實施例2中聚合物⑴在氧化條件下HMP釋放曲線；
[0049] 圖2為本發(fā)明實施例3中聚合物⑴在氧化條件下Zeta電位的變化；
[0050] 圖3為本發(fā)明實施例4中聚合物⑴/DNA納米復(fù)合物的凝膠阻滯實驗電泳圖；
[0051] 圖4為本發(fā)明實施例4中聚合物⑴/DNA納米復(fù)合物的粒徑分布和Zeta電位圖；
[0052] 圖5為本發(fā)明實施例4中聚合物⑴/DNA納米復(fù)合物氮磷比為13條件下的透射 電