新型陽離子聚合物納米材料基因載體及制備方法和應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因治療領域，具體涉及一種可高效轉(zhuǎn)染干細胞的新型陽離子聚合物 納米材料基因載體及其構(gòu)建和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代醫(yī)學與分子生物學的快速發(fā)展，基因治療作為一種新型治療癌癥的手段 逐漸走向成熟?；蛑委熞话惆é€部分：具有功能性的基因（治療基因）、攜帶治療基 因的載體（基因遞送系統(tǒng)）和治療基因的作用位點（祀細胞）。
[0003] 目前，基因遞送系統(tǒng)主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類。常見的病毒載體主 要有：慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純瘡疹病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒。非病毒基因載體主要包 括：脂質(zhì)體、聚合物和脂質(zhì)體-聚合物Η大類。與病毒基因載體相比，非病毒載體具有明顯 的優(yōu)勢，基因負載量不受限制（從20bp到100化Ρ的核巧酸或者質(zhì)粒都可W有效地負載）， 生物安全性好，沒有潛在的傳染性，免疫原性低，合成方法簡單，可W大量制備、成本低廉。
[0004] 在聚合物基因載體中，W陽離子聚合物應用最為廣泛，因其結(jié)構(gòu)的正電荷能與帶 負電荷的基因靜電作用而形成穩(wěn)定復合物，表面正電荷可與細胞膜表面的負電荷發(fā)生靜電 吸附而促進細胞內(nèi)吞。
[0005] 陽離子聚合物不僅能攜帶基因，還能同時攜帶治療藥物（阿霉素，順笛，喜樹堿 等），因此，在癌癥治療中，其應用前景顯得尤為突出，它是未來非病毒載體多功能化發(fā)展的 方向。
[0006] pDNA和siRNA是非病毒基因載體系統(tǒng)中常用的兩種，其遞送載體的設計重點并不 完全一致。表現(xiàn)為；pDNA更需要遞送載體的致密包裹性能；siRNA則需要大容量的負荷性能 和較高的復合體穩(wěn)定性。而現(xiàn)在大部分已構(gòu)建的陽離子聚合物基因載體不能同時有效遞送 pDNA和siRNA。
[0007] 因此本領域尚需研發(fā)新型的陽離子聚合物基因載體，能夠有效遞送pDNA和 SiRNA,擴大應用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型的陽離子聚合物基因載體。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供一種共聚物，所述共聚物包括聚己二醇核芯W(wǎng)及與所述 聚己二醇核芯共價連接的（a)聚賴氨酸嵌段、化）聚賴氨酸嵌段和聚組氨酸嵌段；或（C)由 賴氨酸單體、組氨酸單體和任選的氨基酸單體聚合形成的無規(guī)或交替聚合物區(qū)段。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述共聚物的通式為式I:
[0011] C-(Z)x訊
[0012] 其中，C為聚己二醇核芯；
[0013] Z為A-B或W，其中A為聚賴氨酸嵌段；B為聚組氨酸嵌段；
[0014] 或者W為由賴氨酸單體、組氨酸單體和任選的氨基酸單體聚合形成的無規(guī)或交替 聚合物區(qū)段；
[001引X為的正整數(shù)。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述共聚物具有W下一個或多個特征：
[0017] (1)所述聚己二醇核芯的分子量為1000-5000g/mol。
[0018] (2)所述聚賴氨酸嵌段的重復單元數(shù)為40-150,較佳地為45-120。
[0019] (3)所述聚組氨酸嵌段的重復單元數(shù)為0-50,較佳地為10-30。
[0020] (4)所述共聚物的粒徑為50-100納米。
[0021] (5)所述共聚物的平均水合粒徑為190-210納米。對應的電位在5-20mV。
[0022] (6)所述共聚物形成膠束的CMC值為35-50mg/L。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述聚賴氨酸嵌段中，賴氨酸的含量> 80%，較佳地> 90%，更 佳地為100%。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述聚組氨酸嵌段中，組氨酸的含量> 80%，較佳地> 90%，更 佳地為100%。
[00巧]在另一優(yōu)選例中，共聚物的結(jié)構(gòu)如式la所示，
[0026]
[0027] 式中，η為40-150,m為0-50。在另一優(yōu)選例中，η為45-120 ;和/或m為10-30。
[0028] 應注意的是，上述結(jié)構(gòu)式僅是本發(fā)明的共聚物的結(jié)構(gòu)示意，用于說明共聚物中包 含有聚己二醇核芯、η個賴氨酸單體單元和m個組氨酸單體單元，其中賴氨酸單體單元和組 氨酸單體單元可W無規(guī)排列，交替排列、也可W為嵌段形式排列。
[0029] 本發(fā)明的第二方面，提供第一方面所述的共聚物的制備方法，所述方法包括W下 步驟：
[0030] (i)mPEG-COOH與脫胺反應生成mPEG-SS-NHz;
[0031] (iUmPEG-SS-NHz和Lys(Cbz)-NCAW及任選的His度zl)-NCA發(fā)生開環(huán)反應，再脫 去予氧撰基保護基得到所述共聚物；
[0032]
[003引其中，Lys仰z)-NCA和His(Bzl)-NCA的結(jié)構(gòu)如下所示：
[0034]
[00對各式中，Ri為
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（ii)在避光和惰性氣體保護下進行開環(huán)反應。所述惰 性氣體為氮氣、氮氣、或氮氣。在另一優(yōu)選例中，所述步驟（ii)在無水有機溶劑中進行開環(huán) 反應，所述有機溶劑選自選自；四氨巧喃、二氧六環(huán)、N，N-二甲基甲醜胺、N，N-二甲基己醜 胺、N-甲基化咯焼麗。在另一優(yōu)選例中，所述步驟扣）的開環(huán)反應溫度為15-30。較佳地 為20-25°C。在另一優(yōu)選例中，所述步驟（ii)的開環(huán)反應時間為2-4天。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，Lys(Cbz)-NCA由ε-予氧撰基-心賴氨酸與Η光氣反應制得。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，Ν。-予氧撰基-Nim-予基-k組氨酸于氯化亞諷反應生成 化S度zl)-NCA·肥1，用堿去除鹽酸后得到化S度zl)-NCA。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（ii)中，在皿r/HAc作用下脫除予氧撰基保護基。
[0040] 本發(fā)明的第Η方面，提供第一方面所述的共聚物的用途，用于制備基因遞送載體。 [00川在另一優(yōu)選例中，所述基因為pDNA或siRNA。
[0042] 本發(fā)明的第四方面，提供一種復合物，所述復合物包含：
[0043] 第一方面所述的共聚物；和
[0044] 核酸。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述復合物的水合粒徑為100-220nm。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述核酸為pDNA或siRNA。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述共聚物與所述核酸的質(zhì)量比為0. 01-10,較佳地為0. 05-8， 更佳地，為0. 1-6,甚至為0. 5-5。
[0048] 本發(fā)明的第五方面，提供第四方面所述的復合物的制備方法，包括W下步驟：
[0049] (a)將第一方面所述的共聚物溶于化C1溶液或磯酸緩沖鹽溶液中得到共聚物溶 液；
[0050] 化）將核酸（如pDNA或siRNA)與步驟（a)得到的共聚物溶液混合后得到所述復 合物。
[005。 在另一優(yōu)選例中，所述化C1溶液的濃度為100-200mM，較佳地為120-180mM。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，步驟（a)得到的共聚物溶液的濃度為0.5-5mg/ml，較佳地為 08-2mg/ml〇
[0053] 本發(fā)明的第六方面，提供第四方面所述的復合物的用途，用于制備預防和/或治 療腫瘤的藥物。
[0054] 在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤包括（但不限于）；肝癌、肺癌、口腔上皮癌、鼻咽癌、甲 狀腺癌、食道癌、淋己癌、胸腔癌、消化道癌、膜腺癌、腸癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、腎癌、膽 囊癌、膽管癌、中樞神經(jīng)癌、睪丸癌、膀脫癌、前列腺癌、皮膚癌、黑色素瘤、肉癌、腦癌、血癌、 宮頸癌、膠質(zhì)瘤、胃癌、或腹水瘤。
[00巧]本發(fā)明的第走方面，提供一種藥物組合物，包含：
[0056] 第四方面所述的復合物；W及
[0057] 藥學上可接受的載體。
[0058] 應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0059] 圖 1 為mPEG-SS-LySn-r-HiSm的 1HNMR譜圖，其中（A)為mPEG-SS-Lys55 的 譜圖；度）為mPEG-SS-Lys95的譜圖；（C)為mPEG-SS-Lys55-r-His2。的譜圖和值）為 mPEG-SS-Lysg日-r-His2。的譜圖。
[0060] 圖 2 為mPEG-SS-LyS95-r-HiS2。的透射電鏡圖。
[0061] 圖 3 為mPEG-SS-LySg日-r-Hisz。的水合粒徑圖。
[0062] 圖4為mPEG-SS-Lys55-r-His2。/巧的英光激發(fā)波譜。
[0063] 圖5為mPEG-SS-Lys95-r-His2。/巧的英光激發(fā)波譜。
[0064] 圖6為緩沖能力實驗結(jié)果圖。
[0065] 圖7為凝膠電泳表征不同質(zhì)量比的mPEG-SS-Lys"-r-HiSm和pDNA制成的復合 物的復合能力圖，其中（A)為mPEG-SS-Lysss/pDNA ;度）為mPEG-SS-Lysss/pDNA ;(C)為 mPEG-SS-Lys日日-r-Hiszn/pDNA和（D)為mPEG-SS-Lysg日-r-Hiszn/pDNA。
[0066] 圖8為凝膠電泳表征不同質(zhì)量比的mPEG-SS-Lys"-r-HiSm和pDNA制成的 復合物的抗面asel降解能力圖，其中（A)為mPEG-SS-Lysss-r-Hiszn/pDNA和做為 mPEG-SS-Lysg日-r-Hiszo/pDNA。
[0067] 圖9為不同質(zhì)量比的mPEG-SS-Lys"-r-HiSm和pDNA制成的復合物的平均水合粒徑 圖。
[0068] 圖10為表面電位圖。
[0069] 圖11為復合體暴露于lOmMG甜不同時長的水合粒徑。
[0070] 圖12為凝膠電泳表征不同質(zhì)量比的mPEG-SS-Lys"-r-His2。和siRNA制成的復合物 的復合能力圖，其中（A)為mPEG-SS-Lys日日-r-His2〇/siRNA和度）為mPEG-SS-Lysg日-r-His2〇/ siRNAo
[0071] 圖13為細胞毒性實驗結(jié)果圖。
[0072] 圖14為BCA法測定轉(zhuǎn)染效率結(jié)果圖。
[0073]圖15為FCM法測定轉(zhuǎn)染效率結(jié)果圖，其中，統(tǒng)計學表述為：卸< =0.05，**p< = 0. 01,林卸<=0. 001,?？凇?. 05。293T細胞組和HepG2細胞組，未標識的兩兩組之間為***p< =0. 001。MSCs組，未標識的兩兩組之間為、〉0. 05。
[0074] 圖16為血清轉(zhuǎn)染效率結(jié)果圖，其中星號含義為；**p< = 0. 01，**卸< =0. 001。
[00巧]圖17為FCM法檢測細胞吞瞻效率結(jié)果圖，其中，星號含義為：卸< =0.05 ;**p<= 0. 01，***p< = 0. 001。
[0076]圖 18 為 293T細胞（A)和胎pG2 細胞做中FITC-mPEG-SS-Lys95-r-HiSm的吞瞻效 率圖，其統(tǒng)計學分析結(jié)果為各組與對照組相比較而得。其中，星號含義為：卸< =0.〇5，**p< 二 0· 01，本林p〈二 0· 001。
[0077] 圖 19 為mPEG-SS-Lysss-r-Hisso/VEGF-siRNA和mPEG-SS-Lys95-r-His2〇/ VEGF-siRNA對化pG2細胞的生長抑制結(jié)果圖。其統(tǒng)計學分析結(jié)果為各濃度梯度下與對照組 相比較而得。其中，星號含義為；林卸< = 0.001。
[0078] 圖20為westernblotting實驗結(jié)果圖，其中，（A)為空包對照；度）為陽1/ NC-siRNA;(C)為mPEG-SS-Lys95-r-His2〇/VEGF-si