專利名稱：增強核酸疫苗免疫的組合物及其生產(chǎn)方法和使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及激活、提高、調節(jié)機體免疫反應的組合物及其生產(chǎn)方法和使用方法，是一種增強核酸疫苗免疫的組合物及其生產(chǎn)方法和使用方法。
背景技術：
有多種方法可以預防各種病原體感染，提高機體免疫力是最主要的手段，一般是以接種疫苗而達到的。接種疫苗是預防各種病原體感染的有效措施。常見的病原體有病毒、微生物、真核細胞、寄生蟲和環(huán)境因子等有機體和分子。目前已有多種方法用來生產(chǎn)抗傳染性病原體的疫苗，如滅活疫苗，減毒活疫苗、重組疫苗，亞單位疫苗和核酸疫苗等。它們的基本作用原理是相同地，即借助與病原體結合的靶蛋白激發(fā)免疫反應，達到免疫個體不被傳染性病原體感染的目的。當個體與傳染性病原體接觸時，其免疫系統(tǒng)能夠識別病原體蛋白而產(chǎn)生有效的保護反應抵抗傳染。目前所用的許多疫苗就是由從病原體中分離出來的非傳染性和低傳染性的蛋白或核酸物質所組成。核酸疫苗的優(yōu)點在于可以激活體液免疫反應和細胞免疫反應，而更有效地激發(fā)保護性和清除性的免疫反應，達到防治病原體感染，抗腫瘤，治療自主免疫疾病和清除毒素引起的中毒癥狀等抵抗外來病源體的感染和內在病變，同時核酸疫苗制備方便，成本低廉，安全性好從而備受推崇。但是核酸疫苗的缺點是在體內激活機體產(chǎn)生完全免疫反應的效率較低，單獨使用還不能達到保護能力或保護性不穩(wěn)定。袖以激活、提高、調節(jié)核酸疫苗免疫反應的佐劑正是解決此問題的關鍵。
佐劑的類型多種多樣，按種類分為溶性鋁鹽類佐劑(Glenny，J.Path.Bacteriol，34，267，1926)、油水乳劑佐劑(如弗氏佐劑)、微生物及其代謝產(chǎn)物佐劑(R.Germanier，ed.，Bacterial Vaccines，Academic Press Inc.New York，1984)、人工合成佐劑(Coughlin et al.，P.The Journal of Infectious Diseases，1711049-1052，1995)、免疫刺激組合物(ISCOM)佐劑(Coughlin et al.，P.TheJournal of Infectious Diseases，1711049-1052，1995)、細胞因子類佐劑(Trinchieri G.Immunology 13251-276，1995)、核酸及其類似物佐劑(美國專利6,372,227；Manmohan Singh & Derek O′Hagan.Nature Biotechnology17，1075-1081，1999；Virgil EJC Schijns.Current Opinion in Immunology，12456-463，2000)；按作用方式分為三種第一，在接種部位形成抗原貯存庫，使抗原緩慢釋放，較長時間使抗原與免疫細胞接觸并激發(fā)對抗原的應答；第二，輔助抗原暴露并將能刺激特異性免疫應答的抗原表位提呈給免疫細胞；第三，誘導能介導免疫應答的細胞因子釋放。
但是上述佐劑各存在一些問題，如，上述佐劑大部分是針對非核酸疫苗而開發(fā)而成，不與核酸疫苗有效配伍；另外它們主要是針對提高抗體水平而設立的，從而抑制細胞免疫的效果；又由于它們主要是通過肌肉、皮下注射而達到提高抗體水平而設立的，局限性地無法有效用于粘膜免疫反應，從而使其應用在核酸疫苗實用上受到限制。


發(fā)明內容
針對上述存在的問題，我們有針對性的分析和篩選了可用于與核酸疫苗有效配伍并能增強其免疫效果的化合物，并得到含有該化合物和核酸疫苗的增強核酸疫苗免疫的組合物，而且提供了該增強核酸疫苗免疫的組合物的生產(chǎn)方法和使用方法
技術領域：
本發(fā)明的技術方案是通過以下措施來達到的
一種增強核酸疫苗免疫的組合物，其含有核酸疫苗和增強免疫的化合物，而該增強免疫的化合物為左旋咪唑或左旋咪唑的衍生物或乙醇或甘油或油酸或吐溫80。
上述核酸疫苗是人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)而成的核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)。
上述人工合成為聚合酶鏈式反應(PCR)方法
上述生物體為大腸桿菌或芽孢桿菌或酵母菌或真核細胞。
上述增強核酸疫苗免疫的組合物通過以下方法得到通過序列分析和真核細胞中瞬時表達抗原蛋白測定，將高表達水平的DNA質粒作為核酸疫苗，經(jīng)大腸桿菌培養(yǎng)擴增后，提取重組DNA質粒，純化后以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至5.0％的左旋咪唑生理鹽水中或者純化后以500至2000微克/毫升ml溶于1％至10％的乙醇生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于5％至15％的甘油生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.2％至5.0％的吐溫80生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至1.5％的油酸生理鹽水中，得到所需要的增強核酸疫苗免疫的組合物。
一種增強核酸疫苗免疫的組合物的生產(chǎn)方法，按以下步驟進行通過序列分析和真核細胞中瞬時表達抗原蛋白測定，將高表達水平的DNA質粒作為核酸疫苗，經(jīng)大腸桿菌培養(yǎng)擴增后，提取重組DNA質粒，純化后以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至5.0％的左旋咪唑生理鹽水中或者純化后以500至2000微克/毫升ml溶于1％至10％的乙醇生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于5％至15％的甘油生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.2％至5.0％的吐溫80生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至1.5％的油酸生理鹽水中，得到所需要的增強核酸疫苗免疫的組合物。
在上述生產(chǎn)方法中，上述核酸疫苗是人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)而成的RNA或DNA。
在上述生產(chǎn)方法中，上述生物體為大腸桿菌或或芽孢桿菌或酵母菌或真核細胞。
上述人工合成為聚合酶鏈式反應(PCR)方法。
一種上述的增強核酸疫苗免疫的組合物的使用方法，該使用方法是通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法使上述增強核酸疫苗免疫的組合物進入機體。
一種上述的增強核酸疫苗免疫的組合物的使用方法，該使用方法是上述增強核酸疫苗免疫的組合物是被其它物質包裹或混合后進入機體的。
本發(fā)明是利用含左旋咪唑或乙醇或甘油或油酸或吐溫80和核酸疫苗結合組成組合物接種激活機體完全免疫反應，達到防治病原體感染、抗腫瘤、治療自主免疫疾病和清除蛋白性毒素引起的中毒癥狀等。按照本發(fā)明含左旋咪唑或乙醇或甘油或油酸或吐溫80和核酸疫苗結合組成組合物進入細胞，激活細胞內一系列信號而產(chǎn)生完全免疫反應。
左旋咪唑一直用于畜禽的驅蟲藥，由于目前有非特異性免疫調節(jié)劑作用，從而用于抗乙肝病毒等疾病輔助治療以免疫和抗病毒療效(9-11)。乙醇是廣泛用于消毒、沉淀核酸、蛋白質等的化學試劑和抑制免疫反應的物質(12)。甘油是廣泛用于潤滑、緩沖、保濕、化妝品等用途。油酸廣泛用于合成洗滌劑、油墨、涂料、和表面活性劑等用途，吐溫80廣泛用于乳化、增溶、分散、作助溶劑和防銹劑。但是關于左旋咪唑和乙醇促進和提高疫苗的特異性免疫活性未有報道，特別是對核酸疫苗特異性免疫活性的研究我們是首次發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的另一個重要方面是提供左旋咪唑或乙醇或甘油或油酸或吐溫80與核酸疫苗增強細胞免疫水平，同時可以激發(fā)足夠的抗體水平。由于在左旋咪唑或乙醇或甘油或油酸或吐溫80作用下，核酸疫苗可以激活更為強烈的完全免疫反應。
本發(fā)明是通過含左旋咪唑或乙醇或甘油或油酸或吐溫80與核酸疫苗結合構成組成物直接導入機體如肌肉、皮內、皮下、靜脈、粘膜組織來激活有效的系統(tǒng)免疫和粘膜免疫反應抵抗外來病原體侵入。
本發(fā)明利用導入機體此組合物激活機體完全免疫反應，預防病原體傳染?？乖晕镔|可以是病原體相關的蛋白，內源性和外源性蛋白，這里所述的發(fā)明指此組合物來達到抵御攜帶抗原性物質病原體的感染，而得到保護的目的。
本發(fā)明通過此組合物誘發(fā)機體的免疫發(fā)反應，識別快速增殖細胞的特異性抗原性物質，產(chǎn)生專一性的細胞毒性免疫反應，清除攜帶有抗原性物質的細胞，達到對抗細胞失調類疾病，如腫瘤、癌癥的目的。
本發(fā)明通過此組合物誘發(fā)機體的免疫反應，識別參與自主免疫反應細胞上的特異性靶蛋白，產(chǎn)生專一性的細胞毒性免疫反應，清除攜帶有抗原性物質的細胞，達到治療自主性免疫疾病的目的。
本發(fā)明通過此組合物誘發(fā)機體的免疫反應，中和具有抗原決定簇的有害蛋白，達到清除毒素作用的目的。
通過本組合物激發(fā)機體產(chǎn)生完全免疫反應，包括體液免疫反應和細胞免疫反應，其中細胞毒性T細胞反應起重要的作用。研究已經(jīng)證實了通過此免疫方法細胞所產(chǎn)生的靶抗原在體內的被清除。當抗原性物質降解成小肽，被MHC-1分子結合，遞呈到細胞表面，這種MHC-I抗原組合物能夠有效地刺激CD8T細胞，產(chǎn)生細胞毒性T細胞反應(即殺傷T細胞反應)，該反應是機體抵御病原體和清除有害細胞的關鍵。此免疫方法比單獨使用蛋白質抗原或蛋白質抗原加佐劑接種更能有效地產(chǎn)生特異性抗體，能有效地激發(fā)特異性細胞毒性T細胞反應。
因此，本組合物比滅活的或失活的病毒疫苗、蛋白疫苗、肽類亞單位疫苗和核酸疫苗等接種方法，更為安全有效的保護機體抵御病原體感染、抗腫瘤和治療自主免疫疾病。
本組合物能夠有效的激發(fā)完全免疫反應，又避免使用感染性的制劑，載體和不安全的遺傳物質。其它常規(guī)免疫接種技術(除了核酸疫苗以外)，如果不使用感染性制劑就不會激活細胞毒性T細胞反應，因此滅活或失活疫苗，亞單位疫苗接種均不產(chǎn)生完全的免疫反應。本組合物能有效地克服常規(guī)免疫接種技術的這些不足。
本發(fā)明針對性的致病病原體有病毒、原核細胞、真核細胞。真核細胞病原體包括單細胞致病病原體和多細胞寄生蟲類。
本發(fā)明為保護機體抵抗病毒性病原體感染提供了一種有效的方法。病毒性病原體包括呼吸道病毒(流感和輪狀病毒)、瘡疹病毒(德國麻疹、水痘、牛痘、天花、帶狀瘡疹等)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒(沅病毒)、免疫系統(tǒng)病毒(艾滋病毒)、生殖系統(tǒng)病毒(尖銳濕疣)、畜牧病毒(口蹄疫病毒、豬瘟)、和一切可能的致病性病毒。
本發(fā)明的技術效果利用本發(fā)明提供的組合物及生產(chǎn)和使用方法不僅使核酸疫苗能夠有效的提高激發(fā)完全免疫反應能力保護機體抵抗病原體侵染，而且制備簡單無需復雜設備和操作簡單，并且易于實施，其免疫效果超過未使用本發(fā)明組合物。



圖1口蹄疫病毒cDNA VP1的合成及PCR擴增
口蹄疫病毒RNA樣品在Poly A引物及RNA反轉錄酶的化下VP1合成cDNA和并在Vp1 5’和3’引物存在下進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳后進行觀察拍照從圖中可看出600bp大小VP1條帶。
圖2VP1真核表達質粒構建
為鑒定所構建的真核表達質粒pcDNA-VP1是否正確，將重組質粒經(jīng)限制性內切酶EcoR I和Hind III雙酶切后，得到約為5.4kb和600bp的兩條條帶，分別是pcDNA3和VP1。說明重組質粒為已連接有VP1 cDNA片段的真核表達質粒。
圖3真核表達質粒序列分析
為確定VP1 cDNA序列，將VP1用ABI PRISM 377測序儀進行測序分析。經(jīng)正反向測序，鑒定后證明其序列正確。
圖4RT-PCR鑒定真核表達質粒
為鑒定所構建的真核表達質粒是否能在真核細胞中進行表達，pcDNA-VP1經(jīng)脂質體lipofactamine方法處理后轉染Hela細胞。其表達的mRNA含量由VP1序列的專一性引物存在下進行RT-PCR方法擴增，將產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得出600bp大小VP1條帶(條帶3)；而未轉染的Hela細胞(條帶1)和對照質粒轉染的Hela細胞(條帶3)均未擴增出VP1條帶。
表1比較真核表達水平
在小白鼠肌肉注射本發(fā)明提到的化合物和100微克真核表達質pCMVβ的組合物后，7天后測定其表達水平如表1
表1
從表中可以看出，利用酒精、左旋咪唑、甘油、吐溫80、油酸為佐劑，與無佐劑相比基因的表達水平明顯提高；除左旋咪唑外，其余與0.25％布比卡因佐劑相比，表達水平明顯提高。
表2小白鼠抗VP1抗體的檢測
在小白鼠肌肉注射本發(fā)明提到的化合物和100微克核酸疫苗的組合物后，在第二周再重復注射同等劑量一次，兩周取血清測定其免疫反應，結果如表2。
表2
從表中可以看出，利用酒精、左旋咪唑、甘油、吐溫80、油酸為佐劑，與無佐劑相比抗體濃度明顯提高，酒精、吐溫80和左旋咪唑為佐劑與0.25％布比卡因佐劑相比，抗體濃度明顯提高。
表3豬抗VP1抗體的檢測
在豬肌肉注射本發(fā)明提到的化合物和200微克核酸疫苗的組合物后，在第二周再重復注射同等劑量一次，兩周、四周、六周、八周和十周取血清測定其抗體滴度，結果如表3。
表3
從表中可以看出，利用5％酒精、1％左旋咪唑為佐劑，與無佐劑相比，抗體滴度明顯提高。
表4抗口蹄疫O型病毒實驗
在豚鼠肌肉注射本發(fā)明提到的化合物和100微克核酸疫苗的組合物后，在第二周再重復注射同等劑量一次，第四周利用20個發(fā)病量口蹄疫O型病毒攻擊豚鼠并測定其發(fā)病率，結果如表4。
表4

具體實施例方式
借助以下實施例對本發(fā)明作進一步描述
下面這些實施例是示范性的，而不是限制性的，可根據(jù)上述本發(fā)明的技術方案和實際情況，來確定具體的實施方式。
實施例1核酸疫苗制備
病毒RNA的提取和純化
異硫氰酸胍一步法提取RNA參照RNA提取試劑盒操作程序，提取步驟如下；取病變組織破碎分離細胞，加入0.5ml異硫氰酸胍溶液，0.5ml的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)溶液，4℃ 12000rpm離心5分鐘，將上清移至一新的1.5毫升塑料離心管中，加等量的異丙醇，-20℃放置30分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄去上清，沉淀用70％乙醇清洗，沉淀干燥后溶于30ulDEPC處理H2O中，變性瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
引物設計
根據(jù)目的基因核酸序列，合成5’和3’引物。在5’和3’引物的引導下通過PCR方法從病毒的核酸中擴增出目的基因并克隆至真核表達質粒中(如pcDNA3)。
病毒cDNA的合成及PCR擴增
反轉錄
取適量的病毒總RNA經(jīng)煮沸變性后加入適當?shù)囊锛胺崔D錄酶合成第一鏈cDNA。其反應條件為2μg FDMV RNA，50mmol/L Tris-Cl(pH8.3)，75mmol/LKCL，10mmol/L DTT，3mmol/L MgCl2，500ummol/L dNTPs，100μg隨機六聚體引物，500單位MMLV-RTase，總體積為20μl，37℃保溫1h。
PCR擴增
取5μl第一鏈cDNA產(chǎn)物經(jīng)過30個PCR循環(huán)，其反應條件為第一鏈cDNA產(chǎn)物5μl，5’和3’引物各10pmole，500mM KCl，100mM Tris-HCl(pH8.4)，1.5mM MgCl2，100ug/ml BSA，1mM 4dNTPs，2.5U Taq polymerase，總體積為50μl。
每一循環(huán)包括94℃變性30秒，54℃復性30秒，72℃處伸1min，共30個循環(huán)。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物(圖例1)并以低熔點膠回收擴增片段。
PCR產(chǎn)物真核表達質粒構建及序列分析
將PCR產(chǎn)物用特定的限制性內切酶酶切回收PCR片斷，同時用特定的限制性內切酶酶切pcDNA3質粒作為載體。將回收的PCR片斷連接到pcDNA3質粒上，構建成真核表達質粒，經(jīng)限制性酶切圖譜分析正確無誤(圖例2)，并經(jīng)核酸序列分析測定出其核酸序列(圖例3)。
克隆片斷真核表達質粒鑒定
將構建成的真核表達質粒利用脂質體法轉染Hela細胞并結合RT-PCR法測定其表達。具體如下。
1.5.1 細胞培養(yǎng)
取6孔培養(yǎng)板或用35mm直徑培養(yǎng)皿，向每孔中接種2ml含1-2×105個細胞的培養(yǎng)液，37℃ CO2溫箱培養(yǎng)至40％-60％；
1.5.2 轉染液制備
在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)A液用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA，終量100μl；B液用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μl lipofactamine，終量100μl；輕輕混合A，B二液，室溫中置血清培養(yǎng)基稀釋10分鐘或者說15分鐘或10至15分鐘；
1.5.3 轉染準備用2ml不含血清培養(yǎng)液漂洗細胞兩次；再加入1ml不含血清培養(yǎng)液；
1.5.4 轉染把A/B組合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻、37℃溫箱置6小時或15小時或24小時或6至24小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
1.5.5 收集與RT-PCR
轉染后的細胞分別在培養(yǎng)24、48和72小時后收集細胞，并用前面提到的步驟1.3提取RNA后，進行RT-PCR檢測其表達結果(圖示4)。
1.6 核酸疫苗制備
1.6.1 通過序列分析和真核細胞中瞬時表達抗原蛋白測定，將高表
達水平的DNA質粒作為核酸疫苗，經(jīng)大腸桿菌培養(yǎng)擴增后，
提取重組DNA質粒，純化后以500微克/毫升ml或1000微
克/毫升ml或1500微克/毫升ml或2000微克/毫升ml溶
于0.1％或1.0％或2.0％或3.0％或5％的左旋咪唑生理鹽水中，
得到所需要的增強核酸疫苗免疫的組合物，用于免疫小鼠。可
貯存于4℃待用。
1.6.2 純化的重組DNA質粒，以500微克/毫升ml或1000微克/
毫升ml或1500微克/毫升ml或2000微克/毫升ml溶于1％
或2％或5％或8％或10％的乙醇生理鹽水中，得到所需要的增強
核酸疫苗免疫的組合物，用于免疫小鼠?？少A存于4℃待用。
1.6.3 純化的重組DNA質粒，以500微克/毫升ml或1000微克/
毫升ml或1500微克/毫升ml或2000微克/毫升ml溶于5％
或7％或10％或12％或15％的甘油生理鹽水中，得到所需要的增
強核酸疫苗免疫的組合物，用于免疫小鼠?？少A存于4℃待用。
1.6.4 純化的重組DNA質粒，以500微克/毫升ml或1000微克/
毫升ml或1500微克/毫升ml或2000微克/毫升ml溶于
0.2％或0.5％或0.8％或1.0％或1.5％或2.0％或3.0％或5.0％的吐
溫80生理鹽水中，得到所需要的增強核酸疫苗免疫的組合物，
用于免疫小鼠?？少A存于4℃待用。
1.6.5 純化的重組DNA質粒，以500微克/毫升ml或1000微克/
毫升ml或1500微克/毫升ml或2000微克/毫升ml溶于
0.1％或0.2％或0.3％或0.4％或0.5％或0.6％或0.8％或1.0％或
1.5％的油酸生理鹽水中，得到所需要的增強核酸疫苗免疫的
組合物，用于免疫小鼠?？少A存于4℃待用。
實施例2 免疫動物
在動物或人體肌肉、皮下、皮內、或靜脈注射10μl或100μl或1000μl或10至1000μl含實施例1.6中濃度的左旋咪唑或乙醇和核酸疫苗結合組成組合物后兩周取血測定其免疫反應，有必要時在第二周再重復注射同等劑量一次。每次注射后都在兩周后采血，結果見表2和3。
實施例3 粘膜免疫動物
10μl或100μl或1000μl或10至1000μl含實施例1.6中濃度的左旋咪唑或乙醇和核酸疫苗結合組成組合物滴入動物或人體鼻腔、口腔、眼內或生殖道、排泄道等部位。每隔兩周進行一次。每次實施后兩周采血和粘液分泌物分析其免疫反應。
實施例4 抗體的ELISA檢測
將96孔酶標板用適量抗原包被并可用已知抗體濃度設為標準濃度曲線，4℃過夜；棄去包被液PBST洗板三次；加入不低于1∶100稀釋度的免疫動物血清或粘液分泌物，37℃孵育2小時；PBST洗板三次后，每孔加入適量辣根過氧化物酶標記的羊抗動物二抗(IgG1、IgG2a或IgA)100μl 37℃孵育1小時后棄去；PBST洗三次，加入底物液100μl，室溫顯色反應30分鐘，2M硫酸中止反應，用酶標儀測定相應波長的OD值。根據(jù)標準濃度曲線求出未知抗體濃度(表2，3)。
實施例5 細胞介素水平測定
利用競爭定量PCR進行檢測細胞介素mRNA的水平，其關鍵在于引入一個內標模板pQRS，它含有IL-2；IL-4；IL-5；IL-10；IL-12；TNF-α；TGF-β；IFN-γ；INOS；HRPT十個基因的部分序列，因此以pQRS可以檢測鼠的相應細胞因子的含量。
取一只免疫后的小鼠斷頸處死后取出脾臟，提取總RNA后，由RT-PCR擴增鼠脾臟總cDNA，其條件為42℃反轉錄30-60分鐘，99℃變性5分鐘，5℃放置5分鐘。PCR為94℃，5分鐘；94℃，40秒，55℃，20秒，72℃，40秒，擴增40個循環(huán)；72℃，10分鐘。在1.5％瓊脂糖電泳后觀察結果。結果表明IL-2、IL-12和IFN-γ有所提高。
實施例6 病毒中和實驗
取出組織培養(yǎng)感染劑量100病毒顆粒的50％與不同稀釋度的抗血清混合后，加入易感細胞中，三天后觀察其死亡數(shù)量結果，其中病毒顆粒與對照血清混合后細胞死亡；而病毒顆粒與不同稀釋度免疫血清混合后呈現(xiàn)出在低稀釋度時細胞死亡小，在高稀釋度時細胞死亡大，確定其免疫血清有中和病毒的效果。
實施例7 抗口蹄疫O型病毒實驗
經(jīng)RT-PCR擴增的口蹄疫O型病毒VP1產(chǎn)物克隆至pcDNA3上，分離純化后為VP1核酸疫苗，使用實施例1.6中濃度范圍與本發(fā)明提及的化合物充分混合后的組合物。
1.注射免疫
將實驗鼠分成多組第一組為對照組注射化學物與對照核酸疫苗混合物，其余組為實驗組注射化學物與VP1核酸疫苗混合物。兩周后重復一次。
2.粘膜免疫
滴入動物鼻腔、口腔、眼內等部位兩周取血、尿及陰道分泌物，測定其免疫反應，有必要時在第二周重復滴入同等劑量一次。每次滴入后都在兩周后采血、尿及陰道分泌物。
3.檢測
用以上提到的ELISA方法檢測血中抗口蹄疫O型病毒抗體水平，其中血清測定專一性IgG水平高出對照；測定尿及陰道分泌物專一性IgA水平高出對照。測定細胞介素水平，測定口蹄疫O型病毒專一性的T細胞增生。
4.攻毒
免疫兩周后，將20個發(fā)病量的口蹄疫病毒分別注入二組動物中，待一周后檢查動物發(fā)病情況，以衡量該疫苗抗口蹄疫O型病毒的效果(表4)。
實施例8 口蹄疫O型VP1核酸疫苗用于豬的免疫實驗
注射免疫
將實驗豬分成四組第一組為對照組；注射VP1核酸疫苗；第三組注射左旋咪唑VP1疫苗組合物；第四組注射乙醇VP1疫苗組合物。兩周后重復一次。從注射第二周開始取血清，每兩周一次，以上提到的ELISA方法檢測血中抗口蹄疫O型病毒VP1抗體水平(表3)。
權利要求
1、一種增強核酸疫苗免疫的組合物，其特征在于該組合物含有核酸疫苗和增強免疫的化合物，而該增強免疫的化合物為左旋咪唑或左旋咪唑的衍生物或乙醇或甘油或油酸或吐溫80。
2、如權利要求1所述的增強核酸疫苗免疫的組合物，其特征在于上述核酸疫苗是人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)而成的核糖核酸或脫氧核糖核酸。
3、如權利要求2所述的增強核酸疫苗免疫的組合物，其特征在于上述生物體為大腸桿菌或芽孢桿菌或酵母菌或真核細胞。
4、如權利要求2所述的增強核酸疫苗免疫的組合物，其特征在于上述人工合成為聚合酶鏈式反應方法。
5、如權利要求1或2或3或4所述的增強核酸疫苗免疫的組合物，其特征在于該組合物通過以下方法得到通過分子克隆、序列分析和真核細胞中瞬時表達抗原蛋白測定，將高表達水平的DNA質粒作為核酸疫苗，經(jīng)大腸桿菌或芽孢桿菌或酵母菌或真核細胞培養(yǎng)擴增后，提取重組DNA質粒，純化后以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至5.0％的左旋咪唑生理鹽水中或者純化后以500至2000微克/毫升ml溶于1％至10％的乙醇生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于5％至15％的甘油生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.2％至5.0％的吐溫80生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至1.5％的油酸生理鹽水中，得到所需要的增強核酸疫苗免疫的組合物。
6、一種增強核酸疫苗免疫的組合物的生產(chǎn)方法，其特征在于該生產(chǎn)方法是通過分子克隆、序列分析和真核細胞中瞬時表達抗原蛋白測定，將高表達水平的DNA質粒作為核酸疫苗，經(jīng)大腸桿菌培養(yǎng)擴增后，提取重組DNA質粒，純化后以500-2000微克/毫升ml溶于0.1％至5.0％的左旋咪唑生理鹽水中或者純化后以500至2000微克/毫升ml溶于1％至10％的乙醇生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于5％至15％的甘油生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.2％至5.0％的吐溫80生理鹽水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至1.5％的油酸生理鹽水中，得到所需要的增強核酸疫苗免疫的組合物。
7、如權利要求6所述的增強核酸疫苗免疫的組合物的生產(chǎn)方法，其特征在于上述核酸疫苗是人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)而成的核糖核酸或脫氧核糖核酸。
8、如權利要求7所述的增強核酸疫苗免疫的組合物的生產(chǎn)方法，其特征在于上述生物體為大腸桿菌或芽孢桿菌或酵母菌或真核細胞；或者，上述人工合成為聚合酶鏈式反應方法。
9、一種如權利要求1或2或3或4所述的增強核酸疫苗免疫的組合物的使用方法，其特征在于該使用方法是通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法使上述增強核酸疫苗免疫的組合物進入機體；或者是上述增強核酸疫苗免疫的組合物是被其它物質包裹或混合后進入機體的。
10、一種如權利要求5所述的增強核酸疫苗免疫的組合物的使用方法，其特征在于該使用方法是通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法使上述增強核酸疫苗免疫的組合物進入機體；或者是上述增強核酸疫苗免疫的組合物是被其它物質包裹或混合后進入機體的。
全文摘要
一種增強核酸疫苗免疫的組合物及其生產(chǎn)方法和使用方法，其組合物含有核酸疫苗和增強免疫的化合物，而該增強免疫的化合物為左旋咪唑或左旋咪唑的衍生物或乙醇或甘油或雌二醇或油酸或吐溫80；其使用方法是通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法使上述增強核酸疫苗免疫的組合物進入機體或者上述增強核酸疫苗免疫的組合物是被其它物質包裹或混合后進入機體的。本發(fā)明的技術效果利用本發(fā)明提供的組合物及生產(chǎn)和使用方法不僅使核酸疫苗能夠有效的提高激發(fā)完全免疫反應能力保護機體抵抗病原體侵染，而且制備簡單無需復雜設備和操作簡單，并且易于實施，其免疫效果超過未使用本發(fā)明組合物。
文檔編號A61K39/39GK1391954SQ0212369
公開日2003年1月22日 申請日期2002年7月9日 優(yōu)先權日2002年7月9日
發(fā)明者王賓, 張富春, 馬正海 申請人:新疆大學生命科學與技術學院, 王賓, 張富春