專利名稱：預(yù)防艾滋病的核酸疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的疫苗，尤其是，所述疫苗為含有編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白的經(jīng)過人工修飾的Gag、Pol和Env核苷酸序列的重組核酸。這些疫苗在體內(nèi)施用時用作病毒蛋白抗原生物合成的轉(zhuǎn)錄單位。
背景技術(shù)：
艾滋病被認為是世界上直接威脅人類健康的第一大傳染病，聯(lián)合國艾滋病聯(lián)合規(guī)劃署發(fā)表的《2004全球艾滋病疫情年度報告》指出，目前全球有3800萬名艾滋病病毒攜帶者，2003年共有290萬人死于艾滋病。2003年，亞洲地區(qū)共有110萬人被感染，50多萬人死于艾滋病，該地區(qū)目前共有740萬名艾滋病毒攜帶者。2003年底，中國有艾滋病病毒感染者約84萬，其中艾滋病患者約8萬例。報告感染數(shù)波及31個省、自治區(qū)、直轄市。雖然近幾年抗艾滋病藥物的“雞尾酒”療法在發(fā)達國家有效地控制了HIV的蔓延，但是昂貴的價格(在我國該藥物價格大約為3000-10000元人民幣/人/月)，耐藥病毒株的產(chǎn)生，長期用藥的副作用以及最終無法徹底清除患者體內(nèi)病毒等方面的不利因素顯示，只有艾滋病疫苗才能真正有效地預(yù)防和控制艾滋病。
國內(nèi)外有關(guān)方面研究現(xiàn)狀 用HIV-1疫苗防治AIDS被國際上認為是目前最行之有效的方法，已成為世界上許多科研機構(gòu)研究的熱點。目前，關(guān)于艾滋病疫苗的生產(chǎn)國際上尚屬空白。而HIV-1疫苗的研制工作在國外已有多家大型科研機構(gòu)、制藥公司正開展進行。
自八十年代發(fā)現(xiàn)艾滋病以來，人們就開始進行艾滋病疫苗的研究。一般來說，減毒活疫苗和滅活疫苗能產(chǎn)生較好免疫保護性反應(yīng)，但安全性較差，不適用于作為艾滋病疫苗。隨著人類對艾滋病認識的不斷提高，九十年代初人們意識到CTL(Cytotoxic T Lymphocytes細胞毒性T細胞，即細胞免疫應(yīng)答)的重要性，越來越多的證據(jù)顯示陽性CD8介導(dǎo)的CTL在控制艾滋病毒感染中起舉足輕重的作用。因此人們開始研究用重組病毒載體疫苗來誘導(dǎo)CTL，然后用胞膜蛋白亞單位疫苗增強免疫來誘導(dǎo)中和抗體，力圖從體液免疫和細胞免疫兩方面來誘導(dǎo)人體對艾滋病毒的保護反應(yīng)。但由于免疫強度有限，而用重組載體疫苗又難以進行多次增強免疫，所以在動物模型和人體試驗結(jié)果都顯示了較低的對HIV的免疫保護反應(yīng)。安全有效的誘導(dǎo)CTL的方法為DNA疫苗和以重組痘病毒為典型代表的重組病毒疫苗。九十年代后期，DNA疫苗被廣泛用于艾滋病疫苗的研究。它通過抗原在細胞內(nèi)表達，而產(chǎn)生細胞和體液免疫反應(yīng)。DNA疫苗像減毒活疫苗那樣即誘導(dǎo)體液免疫又誘導(dǎo)細胞免疫，但是又不似后者那樣具有很大的潛在危機。Wang及其同事報道，以HIV/Z6 gp160和Rev為抗原所構(gòu)建的DNA疫苗在小鼠和猴子體內(nèi)產(chǎn)生了良好的細胞免疫和體液免疫。這是由于DNA疫苗有抗原純，可多次重復(fù)免疫以及能誘導(dǎo)高效價記憶性CTL的特點。
目前人們采用多次DNA疫苗免疫后，再用高效表達靶抗原的病毒載體疫苗來增強免疫的方案，以期誘導(dǎo)更強的免疫反應(yīng)，達到使人體產(chǎn)生對HIV有效的免疫保護的效果。美國、法國、意大利、澳大利亞等多個研究小組已經(jīng)在肯尼亞、烏干達、美國、法國、意大利、澳大利亞等多個國家和地區(qū)開展了數(shù)項艾滋病疫苗的臨床研究。
國內(nèi)研究艾滋病疫苗的隊伍主要有中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院、衛(wèi)生部艾滋病預(yù)防與控制中心和病毒學(xué)研究所、清華大學(xué)、中國科學(xué)院微生物所及一些部隊院校等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種預(yù)防艾滋病的核酸疫苗。該核酸疫苗是含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列，所述轉(zhuǎn)錄單位編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白序列，該人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白序列是具有免疫原性的人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)抗原，其中轉(zhuǎn)錄單位指導(dǎo)該抗原的合成。本發(fā)明的一個重要方面，所含有的轉(zhuǎn)錄單位編碼的是人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重組型的結(jié)構(gòu)蛋白。進一步包括人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白Gag、編碼酶類蛋白Pol和外膜蛋白Env。在本發(fā)明的重要實施方案中，其中編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Pol和Env的核苷酸序列來源于經(jīng)過人工修飾的編碼野生型中國流行株人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重組型的結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列，其編碼Gag和Pol的核苷酸序列為SEQ ID NO2、編碼Env的核苷酸序列為SEQ ID NO3。本發(fā)明的另一個重要方面，本核酸序列是脫氧核糖核酸DNA。在另一個重要實施方案中，該含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列，包含兩個巨細胞病毒早期啟動子CMV，一個控制GagPol的表達，另一個控制Env蛋白的表達，含有由原核啟動子驅(qū)動的抗卡那霉素基因和用于擴增DNA質(zhì)粒所需的原核細胞高拷貝因子，它含有內(nèi)含子A和牛生長激素多聚腺苷酸加尾終止信號BGH polyA。本發(fā)明的重要實施方式中其核苷酸序列如SEQ ID NO1所述。
此外，本發(fā)明提供了免疫接種受試者抗艾滋病感染的組合物，其中包括含有人類免疫缺陷病毒-1抗原轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列和一種可藥用的載體。該轉(zhuǎn)錄單位在受試者體內(nèi)細胞中指導(dǎo)該細胞合成抗原。該組合物中可藥用的載體可為生理鹽水。此外抗原可以為人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Pol和Env。
藥用組合物，質(zhì)粒D-GPEi與生理鹽水的重量體積比為1.0～4.0mg/ml，優(yōu)選2mg/ml每次注射2ml，共注射3次。
本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果(1)改進DNA疫苗生產(chǎn)工藝，力圖擴大DNA疫苗產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本；(2)為確保安全性，我們在動物模型上進行了該DNA疫苗在多種器官和組織的分布，持續(xù)時間和整合試驗，結(jié)果顯示沒有任何可檢測到的整合的跡象；(3)疫苗靶抗原包括了幾乎所有的HIV-1結(jié)構(gòu)蛋白，如GagPol和Env，更好的誘導(dǎo)人體產(chǎn)生對HIV有效的免疫保護。


圖1、HIV-1基因組示意圖。其中Gag，Pol和Env是最主要的結(jié)構(gòu)基因。
圖2、D-GPEi核酸疫苗質(zhì)粒構(gòu)建過程示意圖。
圖3、HIV-1中國流行株的gagpol和env基因在哺乳動物細胞中的表達。人HEK293細胞被含D-GPEi疫苗轉(zhuǎn)染。蛋白表達用WESTERN BLOT分析。LANE1是空白對照(以未被D-GPEi疫苗轉(zhuǎn)染的HEK293細胞為空白對照)；LANE2是表達樣品；A圖采用HIV-1 P24蛋白單克隆抗體作為檢測抗體，由于該抗體只識別Gag、GagPol蛋白，因此，該免疫印跡實驗圖中只顯現(xiàn)出Gag、GagPol兩種蛋白。B圖采用HIV-1中國流行株陽性人血清作為檢測抗體，由于該抗血清中含有抗Gag和Env抗體，因此，該免疫印跡實驗圖中顯現(xiàn)出Gag、GagPol和Env三種蛋白。C圖采用抗gp120羊抗血清作為檢測抗體，由于該抗體只識別Env蛋白，因此，該免疫印跡實驗圖中只顯現(xiàn)出Env蛋白。
圖4、D-GPEi在哺乳動物細胞中的表達。
人HEK293細胞被D-GPEi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。蛋白表達用WESTERN BLOT分析。實驗所用抗體為廣西壯族自治區(qū)HIV-1陽性血清。LANE1空白對照；LANE2D-GPEi表達產(chǎn)物；LANE3標準病毒(廣西壯族自治區(qū)HIV-1高發(fā)區(qū)病毒樣品)。
具體實施例方式
實施例1抗原的選擇與修飾1、目的基因的選擇目前中國主要的HIV-1流行株為B/C重組型HIV-1。
選擇的HIV-1中國流行株gagpol基因序列如SEQ ID NO7選擇的HIV-1中國流行株env基因序列如SEQ ID NO8我們這里用于構(gòu)建艾滋病疫苗的HIV-1目的基因就是根據(jù)上述B/C重組亞型的基因序列為基礎(chǔ)，然后進行了全序列人工合成，該合成的基因所表達的氨基酸序列與HIV-1中國流行株gagpol和env基因表達的氨基酸序列一致，但基因表達效率則大大提高。
以上述gagpol和env基因作為目標抗原的基因，它們的表達產(chǎn)物組成了HIV-1最主要的結(jié)構(gòu)蛋白(如圖1)，因此它們是抗原基因的最佳選擇。
2、抗原的修飾2.1方法根據(jù)我們以前研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIV-1 gag，pol和env基因內(nèi)存在許多抑制因子。這些抑制因子是以A和T為主組成，造成HIV-1 mRNA不穩(wěn)定，不能從細胞核轉(zhuǎn)制到細胞漿，從而影響蛋白表達。去除抑制因子的辦法就是在不影響氨基酸編碼的前提下，將Codon第三位的A或T盡量改為C或G。
2.2過程GPCINS、ENVCINS分別代表合成的全新的gagpol和env基因GPCINS基因序列合成引物F1GACGTGGGCGACGCCTACTTCAGCGTGCCCCTGGATAAGGACTTCCGGAAGTACACCGCCTTCACCATCCCCAGCGTGAACAATGAGACCR1CTGCACTGGAAGATGGCGGGGCTGCCCTTCCAGCCCTGGGGCAGCACGTTGTACTGGTACCGGATGCCGGGGGTCTCATTGTTCACGCTGF2CCAGGACTTCTGGGAGGTGCAGCTGGGCATCCCCCACCCCGCCGGCCTGAAGAAAAAGAAAAGCGTGACCGTGCTGGACGTGGGCGACGCR2CAGATCGTCCATGTACTGGTAGATCACGATGTCGGGGTTCTGCTTCCGGAAGGGCTCCAGGATCTTGGTCATGCTGCACTGGAAGATGGCF3CATCTTCGCCATCCGGAAGAAAGACAGCTCCAAGTGGCGGAAGCTGGTGGACTTCCGGGAGCTGAACAAGCGGACCCAGGACTTCTGGGA
R3TTCAGGAGGTGCTCCCGCAGTTCCTCGATCTTGGTCCGGTGCTGGCCGATCTCCAGGTCGCTGCCCACGTACAGATCGTCCATGTACTGGF4GACCGCCATCTGCGACGAGATGGAAAAGGAGGGCAAGATCACCAAGATCGGCCCCGACAACCCCTACAACACCCCCATCTTCGCCATCCGR4GGTGCAGCTCGTAGCCCATCCACAGGAAGGGAGGCTCCTTCTGGTGTTTCTTGTCGGGTGTGGTGAAGCCCCACTTCAGGAGGTGCTCCCF5CCGTGAAGCTGAAGCCCGGCATGGACGGCCCCAAGGTGAAGCAGTGGCCCCTGACCGAGGAAAAGATCAAGGCCCTGACCGCCATCTGCGR5CAGCTTCTGGATGTCGTTCACGGTCCAGCTGTCCTTCTCGGGCAGCTGGATGGGCTGCACGGTCCACTTGTCGGGGTGCAGCTCGTAGCCF6CATCATTGGCCGGAACATGCTGACCCAGCTGGGCTGCACCCTGAACTTCCCCATCAGCCCCATCGAGACCGTGCCCGTGAAGCTGAAGCCR6CCGCAGGAGCTTGCACAGCTGCCGCACCTTGATGCCGGGGTAGATCTGGCTGGCCCAGTTCAGCTTGCCCACCAGCTTCTGGATGTCGTTF7TACGAGCAGATCCCCATTGAGATCTGCGGCAAGAAAGCCATCGGCACCGTGCTGGTGGGCCCCACCCCCGTGAACATCATTGGCCGGAACR7GGATCTCCCGGTTCTCGGCCAGTTCCAGCTCGGCTTCCTCGGTCAGGGGCACGATGTCGGTCAGGGCCTTGGCGCCCCGCAGGAGCTTGCF8GGAAGTGAACCTGCCCGGCAAGTGGAAGCCCAAGATGATCGGCGGGATCGGAGGCTTCATCAAGGTGCGGCAGTACGAGCAGATCCCCATR8TTGGCCCTGCTTCTGGATCTCGGCGATCAGCTCCTTGCTGGGGTCATAGTAGGCGCCGTGCACGGGCTCCTTCAGGATCTCCCGGTTCTCF9CTTGTCTCAATAAAAGTAGGGGGCCAGATAAAAGAGGCTCTCCTGGACACCGGCGCCGATGACACCGTGCTGGAGGAAGTGAACCTGCCCR9GGTCCGCATCTTGGCGTACTTGCCGGTCTTCAGGTTCTTGAAGGGCTCCTGGTAGATCTGGTAGGTCCACTGGTCTTGGCCCTGCTTCTGF10AGCTCCGAAGCAGGAACCGAAAGACAGGGAACCCTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTTGTCTCAATAAAAGTAGGGR10GCCCCAAATCACGATGCTCTCCATGGCGATCTTCTGCACGGCCTCGGTCAGCTGCTTCACGTCGTTGGTGTGGGCGGTCCGCATCTTGGCF11GGGAATTTTCTCCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGCAGAGAGCTTCAGGTTCGAGGAGACAACCCCAGCTCCGAAGCAGGAAR11GTGGCCTGCCAGTAGTCGGTCCACCAGGTCTCCCAGGTCTCCTTCTGGATGGGCAGCCGGAACTTGGGGATCTTGCCCCAAATCACGATGF12CAAATGAAAGACTGTACTGAAAGGCAGGCGAATTTTTTAGGGAAATTTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTCCAGAGCR12GGGGTCCTTCTCCAGCTGGTACCACAGCTTCACCAGGGGAGGGGTGTTCACGAACTCCCACTCGGGGATCCAGGTGGCCTGCCAGTAGTCF13GCCACATCGCCAAGAACTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAAGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAAGACTGTACTGAAAR13ACGTAGCCGGCCTTGCCGATCTTGGTCTCCCGGTTAGCGGCGCCGTCCACGTAGAAGGTCTCCACGCCGGCGATGGGGTCCTTCTCCAGCF14ACACCATCCTGATGCAGCGGAGCAACTTCAAGGGCAGCAAACGGATCGTGAAGTGCTTCAACTGTGGCAAGGAGGGCCACATCGCCAAGAR14TAGATGGCCTGCAGCTCGGTCTTCTGGTTGGTTGTGTCGGTCAGGCTCACGATTTTCTTCCGGCCTCTGTCGGTCACGTAGCCGGCCTTGF15ACCGCCTGCCAGGGCGTGGGAGGCCCCAGCCACAAGGCCCGGGTGCTGGCTGAGGCCATGAGCCAGACCTCCAACACCATCCTGATGCAGR15CTGAATGATGCCCAGGGCGTACTGGCTGTCGGTCACGATGTTCACCTCGCTGCCGCTGTCCTGCAGGGCGATGTAGATGGCCTGCAGCTCF16TCGTGCAGAATGCCAACCCCGACTGCAAGACCATCCTGCGGGCCCTGGGCAGCGGCGCCTCCCTGGAAGAGATGATGACCGCCTGCCAGGR16TACACCCGCTCTTTCTTGATCAGCTGCTCAATGATCTGGTTCACCAGCTCGCTCTCGCTCTTGTCGGGCTGGGCCTGAATGATGCCCAGGF17GGATAGATTCTTTAAGACCCTGCGGGCCGAGCAGGCCACCCAGGACGTGAAGAACTGGATGACCGACACCCTGCTCGTGCAGAATGCCAAR17ATGCCGTTGCTCACCAGCTTGTCCACCTGCTCGTTGCCCCCGATGCCCTTGTGGGCGGGCACCCAGCTCAGGTACACCCGCTCTTTCTTGF18GCGGATGTACAGCCCCACCTCCATCCTGGACATCAAGCAGGGCCCTAAGGAGCCCTTCCGGGACTACGTGGATAGATTCTTTAAGACCCTR18GCCCGCCAGTTGCTGTGGTACTTCTCGTGTTCCTCCTGGGCCTTGTCGATGCCGTCCAGGAACAGCACCTTCCGGATGCCGTTGCTCACCF19GATGACCAACAATCCTCCCATCCCAGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATTATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCR19CTTCAGCTGACACTGGTCGCAGCTGGCCACGATCTCCTTGGCCACGATGGGAGGCAGGTTGAAGTCGCTGGCCATGGCCCGCCAGTTGCTF20TGGCCAGATGCGGGAGCCCAGAGGCAGCGACATCGCCGGCACCACATCCAGCCTGCAGGAGCAGATCGGCTGGATGACCAACAATCCTCCR20CCCTCCAGGTGGGTGCAGTCCAGCTGCCAGATGCCGGGGCTGCAGTCCACCTGGCCGTGCATGGCCTCGCCCTTCAGCTGACACTGGTCGF21TGCTGAAGGACACCATCAACGAGGAAGCCGCTGAGTGGGACCGGCTGCACCCCGTGCACGCCGGCCCCGTGGCCCCTGGCCAGATGCGGG
R21TGGCCGGTCTCGGCGGGGATCACCTCGGCCTCGATGTAGCCGCTGGCCACGTGGACGGCCACCAGAATGATCTTGCCCTCCAGGTGGGTGF22AGCGAGGGCGCCACCCCCCAGGACCTGAACACCATGCTGAACACCGTGGGCGGGCACCAGGCTGCCATGCAGATGCTGAAGGACACCATCR22AGTTGCTGCCGTTGTCGGTGTGGATCACCTTCACGGGCCACCGGCCGGCCAGCTTCAGGATGAAGTAGGCGGTCTCCTGGCCGGTCTCGG23CGGACCCTGAACGCCTGGGTGAAGGTCGTGGAGGAAAAGGCCTTCAGCCCCGAGGTGATCCCTATGTTCACCGCCCTGAGCGAGGGCGCCR23GGGGTTGTAGGGGATGCCGAACTCTTGCTGGATGCCGGCCCACCAGCAGGCTGCCTTCACAGCGGCGCTGGTGAAGTTGCTGCCGTTGTCF24CGACGAGAAGGTGAGCCAGAACTACCCCATCGTGCAGAACCCCCAGGGCCAGATGGTGCACCAGCCTCTGAGCCCCCGGACCCTGAACGCR24TCGGCCTGGTCCCGCACCTGGCCGATCAGCTTTTTCAGCTCCTTGTTCATGCTCTCCACCACGCCCTGGCTCTGGGGGTTGTAGGGGATGF25ACCAAGGAGGCCCTGGACAAGATCGAGGAAGAGCAGAACAAGATCCAGCAAAAGACCCAGCAGGCCAAGAAAGCCGACGAGAAGGTGAGCR25CGCTGTAGCCTCCGATCCCGCCCTTCCGCTTGAAGTTGTGGATGAACACGGCCATCTGCACGGCGGTCTTCAGGTGCTCGGCCTGGTCCCF26ACCGAGGAACTGCGGAGCCTGTTCAACACCGTGGCCACCCTGTACTGCGTGCACGAGGAAATCGAGGTGCGGGACACCAAGGAGGCCCTGR26GGATCTTAATGATCTGCTTCTGCAGCTCCCGGGTCTGGATGTCGGTGGCGATAATGTCCACGATCCGCTCGCCGGCGCTGTAGCCTCCGAF27AACCCCGGCCTCCTGGAGACCAGCGAAGGCTGCAAGCAGATCATTAAGCAGCTGCAACCCGCCCTGCAGACCGGCACCGAGGAACTGCGGR27TTCCAGAGCAGCTTGGCGGGGCCCTTCCAGATGGGGTCCCGGCTGTCTCTATAGTACACCCGGAAGTTCTGGATCTTAATGATCTGCTTCF28TGAGACCCGGAGGCAAGAAACACTACATGCTGAAGCACCTGGTGTGGGCCAGCCGGGAGCTGGAAAGATTCGCCCTGAACCCCGGCCTCCR28TGATAATCTTGGCCTTCCGTCTGGGCACGACCTTGATGTCGCTGTTGTCCTGGATCACGACGGCGCCCTCGCCCTTCCAGAGCAGCTTGGF29 ATGGGCGCCCGGGCCAGCATCCTGCGGGGAGGCAAGCTGGACAAATGGGAGAAGATCCGGCTGAGACCCGGAGGCAR29 TCAGTCCTCATCCTGCCGGCCGGCCACGCAGTCGGCGCCGGCCATCTGCTTGCCGTAGTCCTTGATAATCTTGGCCTTCCENVCINS基因序列合成引物F1GCTCCAGCATCATTACCATCCCCTGTCGGATCAAGCAGATTATCAACATGTGGCAGGAAGTGGGACGGGCCATGTACGCTCCACCCATCG
R1CGTTGCTCTCTGTTCTTCCGCCGTCCCGCACCAGGAGCAGGCCGGTGATGTTGGACTTGCAGGTGATGTTGCCCTCGATGGGTGGAGCGTF2TGCCGGGGCGAGTTCTTTTACTGCAACACCAGCGGACTGTTCAACGGCACCTACAACGGCACCAAGGACAACAGCTCCAGCATCATTACCR2CCTTGTACTTGTACAGCTCGTTCCGCCAATTGTTCCGCATGTCGCCTCCGCCGGGTCTGAAGATTTCGGTGTCGTTGCTCTCTGTTCTTCF3GAGCACTTCCCCAACAAGACCATCAAGTTTGCCAGCTCTTCCGGCGGAGACCTGGAGATCACCACACACAGCTTCAACTGCCGGGGCGAGR3CGCTTCTCCCTCTCGACCACCCGTCTCTTGGCAGCTGTAGGGGCCACTCCCAGGGGTTTGATCTCGACCACCTTGTACTTGTACAGCTCGF4CAGACAGGCTCATTGCAACATCAGCAAGGACAAGTGGGACGAGACACTGCAGCGGGTGAGCAAGAAACTGGCCGAGCACTTCCCCAACAAR4TGATGCTGGCAGCGCCCATGGTGCTCCCGGCAGCTCCCAGGAAGCCCAGGAACACAGCTCCCAGGCCCACGGCCCGCTTCTCCCTCTCGAF5ATAACACCAGGAAGAGCATCAGAATTGGGCCCGGCCAGACCTTCTATGCTACCGGCGACATCATTGGCGACATCAGACAGGCTCATTGCAR5GCTTCGATGGCTCTGAGCAGGTTGCTCTGTTGCTGCACGATGCCGCTCAGGAGCTGTCTGGCTTGCACGGTCAGGGTGATGCTGGCAGCGF6GACCAATAACGTGAAGACCATCATTGTGCACCTGAACAAGAGCGTGGAGATCGTGTGCACCCGGCCCAACAATAACACCAGGAAGAGCATR6CCGTTCGATGGCGAGCACCCGGGTCTGGAGTTGCTTGATGCCCCACACGGTCAGCTGGAGCATGTGCTGTTGGGCTTCGATGGCTCTGAGF7GTCGTGTCCACCCAGCTGCTCCTGAATGGAAGCCTGGCCGAGAGAGAGATCATTATCCGGAGCGAGAACCTGACCAATAACGTGAAGACCR7TCCAGGGCACGGCGGTTGTGCAGATCAGCTTTCCGGAACAGCCCCAGATGCCGAGCAGCTGCTGGTCCTTCAGGTACCGTTCGATGGCGAF8ACGACAAAATCTTCAACGGCACCGGACAGTGTCACAACGTGTCCACCGTGCAGTGCACCCATGGCATCAAGCCCGTCGTGTCCACCCAGCR8GCTGATCTCCTTGTCCCACTGCATCCAGGTCATGTTGTCCCAGATTTCCTGTTGGCTCTTGTTAGACCAGCTGGAGTTCCAGGGCACGGCF9GCCCCAAGGTGACCTTCGACCCTATTCCCATCCACTACTGCACCCCCGCCGGCTACGCCATCCTGAAGTGCAACGACAAAATCTTCAACGR9GCAGGTCCTTCTCATTCCGCTCCTGTTGGTTCTGGCTGTCCTCGAGCAGTCTGTAGATGGTGTTGGTGTAGTTGCTGATCTCCTTGTCCCF10ACGAGAACAGCGGCAAGAACTCCAGCGAGTACTATCGGCTGATCAACTGCAACACCAGCGCCATCACCCAGGCCTGCCCCAAGGTGACCTR10AGATTTTAATGTACCACAGCCAGTTAGTGATGTCAAACCAGCTCCACAGGTTCTTCCAGCTGTCCAGGGCGAGCAGGTCCTTCTCATTCCF11CCACCACACTGCTCAGAGACCGGAAGAAAACCGTGTACGCCCTGTTCTACAGACTGGACATTGCTCCCCTGAACGACGAGAACAGCGGCAR11ACTCTGTTCACGATGCTCAGCACGGCGAAGATAATCCTGCTTCCGATCAGCCCGCCCACGATCATAATGAAGATTTTAATGTACCACAGCF12TCCAACGGCAACGGCACACGGAACGAGACCTACAACGAGAGCGTGAAGGAGGTGAAGAACTGCAGCTTCAACGCCACCACACTGCTCAGAR12TGCCCAGTCTGCCAGGTCCGCCGGGGTTAGGGGTGGGGATCTGGAAGCTCAGTGGGGAGTAGCCCTGCCGCACTCTGTTCACGATGCTCAF13CCTGTGGGACCAGAGCCTGAAGCCCTGCGTGAAGCTGACCCCCCTGTGCGTGACCCTGGAATGTCGGAACGTGAGCTCCAACGGCAACGGR13AGGCCAGGGCCAGGAAGCCGTTCACCAGCCTGATGCTCCGGGTCTTGTCCTGTTCGCCTCCCTCTTCCTCGATTCTGCCCAGTCTGCCAGF14ATGGAGAACGTGACCGAGAATTTCAACATGTGGAATAACGACATGGTGAACCAGATGCACGAGGACGTGATCAGCCTGTGGGACCAGAGCR14ACTCCCCTAGCAGTCAGGAGGATGAAGTCGCTCAGTCTGTGGTAGCTGAACAGGCACAGGTTCCGCAGATCGTCCCAGGCCAGGGCCAGGF15CGAGACCGAGGTGCACAACGTCTGGGCCACCCATGCCTGCGTGCCAACCGACCCTAACCCACAGGAGATCGTGATGGAGAACGTGACCGAR15AGGTTGCCCAGGTACTTCAGAGCTTCCCATCCCCGCTGCAGGCCCCTCAGAGAGTTTCTCCCGAGCAGCTCCACTCCCCTAGCAGTCAGGF16ACCGTCTACTATGGCGTGCCCGTCTGGAAGGAGGCCAAGACCACACTGTTCTGTGCCAGCGACGCTAAGGCCTACGAGACCGAGGTGCACR16GCGACCACGATGGCGATGGTGTCCACCAGGGAGATTGTGCTTTTCTTCAGCTCCAGGCCCCAGTACTGCACCAGGTTGCCCAGGTACTTCF17CAGTGGTGGATCTGGGGCGTGCTGGGCTTCTGGATGCTGATGATCTGCAACGTGGAGGGCAACCTGTGGGTGACCGTCTACTATGGCGTGR17TCTGATCCTTCTAGGCACGTTGTGGATGGCCCGGCAAATTCCCTGCACGATGTTAATGATTCTATCGGTGCCCTCGGCGACCACGATGGCF18 ATGAGAGTGAGGGGCACCAGACGGAACTACCAACAGTGGTGGATCTGGGGR18 TCACTGCAGAGCGGCCTCCAGTCCCTGTCTGATCCTTCTAGGCACG1.F代表正向引物，R代表反向引物；2.下劃線部分為引物與模板互補部分；3. 線部分為引入的新限制性核酸內(nèi)切酶(RE)位點Xba I， 線部分為引入的新RE位點BamH I；4.基因合成的原理及過程本合成HIV基因采用聚合酶鏈式反應(yīng)法，即PCR法。PCR法是用一對與模板DNA互補的單鏈寡聚DNA作為引物，通過“加溫變性-退火-延伸”這一周期的多次循環(huán)，使與引物互補的模板DNA引物之間的區(qū)段得到擴增。擴增的產(chǎn)物應(yīng)該包括引物序列，如果在引物的末端含有一段非互補的序列，它們也能夠被包含在擴增的產(chǎn)物序列中。因此，可以利用這種原理在一段DNA的兩端按照合成引物的序列延長該DNA片段，經(jīng)過多輪PCR即可達到合成HIV基因之目的。
第一輪PCR的目的是合成該基因中間的一段DNA序列，所以設(shè)計合成一對引物F1和R1，F(xiàn)1為正向引物，R1為反向引物，F(xiàn)1與所要合成的基因的中間部分的有義鏈序列一致，R1與所要合成的基因的中間部分的反義鏈序列一致，且它們的3’端互補(見引物序列的下劃線處)，因此，第一輪PCR不需要加入模板，只需要加入Taq酶緩沖液、4種dNTP、引物F1、引物R1、Taq酶，補加水至一定體積，按照PCR的“加溫變性-退火-延伸”的程序進行多次循環(huán)。
第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，引物為F2和R2，F(xiàn)2將使擴增產(chǎn)物向5’端延長，R2將使擴增產(chǎn)物向3’端延長，該輪PCR產(chǎn)物為F2與R2之間的區(qū)段。
第三輪PCR以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，引物為F3和R3，其余操作過程與第二輪PCR相同。以后與此類同，經(jīng)過29輪PCR可合成GPCINS基因；經(jīng)過18輪PCR可合成ENVCINS基因。
2.3抗原修飾的結(jié)果合成的全新gagpol(GPCINS)和env(ENVCINS)基因序列如下GPCINS基因序列如SEQ ID NO2ENVCINS基因序列如SEQ ID NO3我們對GagPol修飾前后的核苷酸序列進行了比較，為了增加GagPol抗原的表達水平，修飾前后核苷酸序列變化較大，但核苷酸長度沒有變化，為4280bp。合成后我們用FseI限制性內(nèi)切酶切去了整合酶3’端531個堿基對，新的GagPol核苷酸長度為3730bp，從1至3730個堿基對中修飾后堿基變化個數(shù)為994，突變率為26.6％。
同時，我們對Env修飾前后的核苷酸序列進行了比較，為了增加Env抗原的表達水平，修飾前后核苷酸序列變化較大，但核苷酸長度沒有變化，為2577bp，修飾后堿基變化數(shù)量為692個，突變率為26.9％，env讀碼框架沒有改變。
基因修飾前后Gag、Env氨基酸序列與野生型完全一致。
我們對Pol基因中的protease蛋白酶活性中心進行了失活突變(Pol第336位天門冬氨酸突變?yōu)榻M氨酸)，目的是使protease失去活性，從而也消除了逆轉(zhuǎn)錄酶保持活性的可能性。另外，由于我們用FseI限制性內(nèi)切酶切去了整合酶3’端531個堿基對，從而使整合酶完全失去活性，同時，由于修飾后整合酶基因所表達的蛋白與HIV-1病毒整合酶基因所表達的蛋白有較大的區(qū)別，這一點也可以用來區(qū)分該疫苗在人體內(nèi)引起的免疫反應(yīng)與HIV-1病毒感染引起的免疫反應(yīng)的不同。
實施例2 核酸疫苗的構(gòu)建1、表達載體的選擇1.1概述。
本DNA疫苗D-GPEi的載體(VR)的構(gòu)建借鑒了Vical公司開發(fā)的VR1012載體的多克隆位點(包括XbaI和BamHI等)以及CMV啟動子、卡那霉素抗性基因、原核細胞高拷貝因子、內(nèi)含子A和BGH PolyA翻譯終止信號等常規(guī)部件。VR1012是美國FDA正式批準的可以用于人體基因疫苗臨床試驗的載體，已經(jīng)完成的臨床試驗表明其在人體的應(yīng)用是安全的。
本DNA疫苗的構(gòu)建思路是以VR1012為模板，復(fù)制了包括CMV啟動子、IntronA和BGH polyA信號，然后利用合適的酶切位點把此表達框架再克隆回VR1012。因此，新質(zhì)粒由兩個CMV啟動子，一個卡那霉素抗性基因，一個原核細胞高拷貝因子，兩個IntronA和兩個BGH polyA信號等部件組成。新質(zhì)粒所有部件均符合美國FDA有關(guān)人體臨床試驗的安全標準，并具有穩(wěn)定和高效表達外源基因等特點。
2、質(zhì)粒D-GPEi的構(gòu)建2.1質(zhì)粒構(gòu)建的主要材料和方法如下2.1.1試劑限制性內(nèi)切酶購于NEW ENGLAND BIOLABS，INC.32 TozerRoad，Beveerly，MA 01915-5599 USA；瓊脂糖Invitrogen Life Technologies公司1600 Faraday Avenue，PO Box 6482，Carlsbad，California 92008，USA；TAE電泳緩沖液0.04mol/L Tris—乙酸 Invitrogen Life Technologies公司0.001mol/L EDTA，pH8.0 Invitrogen Life Technologies公司EB染料 Invitrogen Life Technologies公司T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購于NEW ENGLAND BIOLABS INC；QIAquick膠回收試劑盒購于QIAGEN Inc.，28159 Avenue Stanford，Valencia，CA91355，USA；LB液體培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10gInvitrogen Life Technologies公司細菌培養(yǎng)用酵母提取物5g Invitrogen Life Technologies公司NaCl 5g Invitrogen Life Technologies公司加水至1升，調(diào)pH值至7.0，高壓滅菌。
LB固體培養(yǎng)基.
細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10gInvitrogen Life Technologies公司細菌培養(yǎng)用酵母提取物5g Invitrogen Life Technologies公司NaCl 5g Invitrogen Life Technologies公司瓊脂15gInvitrogen Life Technologies公司加水至1升，調(diào)pH值至7.0，高壓滅菌，加入適當抗生素，鋪平板。
0.1M CaCl2溶液 高壓滅菌 Invitrogen Life Technologies公司抗生素 Invitrogen Life Technologies公司E.coli DH5αInvitrogen Life Technologies公司質(zhì)粒提取QIAGEN Plasmid Maxi kit QIAGEN Inc.公司2.1.2方法①酶切實驗 按下述方法設(shè)立酶切反應(yīng)體系，即將1μg DNA加入到無菌微量離心管中，加入10×限制性內(nèi)切酶緩沖液5μl，加入限制性內(nèi)切酶10units，加水至50μl，按酶切反應(yīng)溫度反應(yīng)1小時，然后瓊脂糖電泳檢查酶切反應(yīng)結(jié)果。
②連接實驗 用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化質(zhì)粒和外源DNA，利用QIAGEN的QIAquick膠回收試劑盒回收載體和外源DNA片斷，測定其DNA含量，建立連接反應(yīng)體系，將50ng載體DNA加入到無菌微量離心管中，加入4倍摩爾量的外源DNA片斷，加入10×T4 DNA連接酶緩沖液2μl，加入400units T4 DNA連接酶，補水至20μl，16℃反應(yīng)3小時。
③細菌轉(zhuǎn)化實驗 挑取一個單菌落接種于50ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下以250rpm震蕩過夜培養(yǎng)。取4ml過夜培養(yǎng)物接種于400ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃以250rpm震蕩培養(yǎng)至OD590為0.375。將培養(yǎng)基分裝到8個50ml預(yù)冷的無菌聚丙烯離心筒中，冰浴10分鐘，4℃下1600g離心7分鐘沉淀菌體，棄去上清，用10ml預(yù)冷CaCl2溶液重懸菌體沉淀，4℃下1100g離心5分鐘沉淀菌體，棄去上清，用10ml預(yù)冷CaCl2溶液重懸菌體沉淀，冰浴30分鐘，4℃下1100g離心5分鐘沉淀菌體。用2ml預(yù)冷CaCl2溶液重懸菌體沉淀，分裝成每管100ul菌體溶液，即為感受態(tài)細胞。在感受態(tài)細胞中加入一定量DNA，混勻，冰浴10分鐘，然后將感受態(tài)細胞于42℃水浴加熱45秒，冰浴2分鐘，加入900ulLB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)1小時。將菌液均勻涂布于抗性LB平板上，37℃培養(yǎng)12至16小時。
④菌種擴增 將菌體平板劃線于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，加LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)過夜，第二天在新的培養(yǎng)基中加入1％體積的過夜培養(yǎng)菌液，繼續(xù)培養(yǎng)至適當菌體濃度即可。
⑤質(zhì)粒提取 方法參照試劑盒中說明書。將500ml培養(yǎng)物到入離心筒中，于4℃以6000g離心15分鐘，棄去培養(yǎng)基，將沉淀菌體重懸于10mlBufferP1中，加入10ml BufferP2，溫和顛倒離心管5次，徹底混合溶液，室溫放置5分鐘。加入10ml預(yù)冷的BufferP3，立即溫和顛倒離心管5次，徹底混合溶液，冰浴20分鐘。4℃下20000g離心30分鐘，取上清重新離心15分鐘。在QIAGEN-tip 500柱加10ml Buffer QBT，放置濾過溶液，平衡膜。將上清轉(zhuǎn)移至柱中，放置濾過溶液，加入30ml Buffer QC，放置濾過溶液，重復(fù)用30mlBuffer QC洗膜。加入15ml Buffer QF，靜置，濾液即為所提DNA溶液。濾液加入10.5ml異丙醇，混勻。4℃下15000g離心30分鐘，棄去上清，用5ml 70％乙醇洗滌沉淀，15000g離心10分鐘，在空氣中干燥沉淀10分鐘，DNA沉淀溶解于適當體積水中。
⑥瓊脂糖電泳分析 根據(jù)所要電泳的DNA分子量大小配制相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠，在TAE電泳緩沖液中加入適量的瓊脂糖，加熱至瓊脂糖溶解，使溶液冷卻至60℃，加入EB至終濃度為0.5μg/ml，充分混勻，將溶液倒入膠模中，待凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入足量的電泳緩沖液。DNA樣品與加樣緩沖液混勻后，加入樣品槽中，蓋上電泳槽并通電，使DNA向陽極移動，采用5V/cm的電壓降，電泳至溴酚藍遷移至適當距離，切斷電流，在紫外燈下檢查凝膠中的DNA條帶，并根據(jù)DNA分子量標準判斷其大小。
2.2構(gòu)建步驟見圖2，首先利用載體上XbaI和BamHI位點把合成的gagpol基因(GPCINS)克隆到上述載體上，形成VR-GPCINS；利用VR載體上BamHI位點把合成的env基因(ENVCINS)克隆到上述載體上，形成VR-ENVCINS。
用VR載體作為模板利用PCR擴增BGH翻譯終止信號片段，并使該片段5`端帶有BglII位點，3`端依次帶有MluI和BamHI(上游引物為5`-AGATCTCACGTGGAATTCGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAG-3`；下游引物為5`-GGATCCACGCGTGCTAGCGGCCGCCATAGAGCCCACCGCATCC-3`)。由于BglII和BamHI含有相同的粘性末端，因此可利用VR-GPCINS的BamHI位點把BGH翻譯終止信號片段克隆到VR-GPCINS上形成VR-GPCINS-BGH-BGH質(zhì)粒，在兩個BGH片段之間帶有MluI位點。
以VR-ENVCINS為模板利用PCR擴增env基因(ENVCINS)表達框架，該片段包括CMV啟動子、intronA和env基因(ENVCINS)，該PCR產(chǎn)物5`端和3`端都帶有AscI位點(上游引物5`-GGCGCGCCGTTGACATTGATTATTGACT-3`；下游引物5`-GGCGCGCCTCACTGCAGAGCGGCCTC-3`)。
由于AscI和MluI有相同的粘性末端，因此可利用VR-GPCINS-BGH-BGH質(zhì)粒上的MluI位點把env基因(ENVCINS)表達框架克隆到VR-GPCINS-BGH-BGH質(zhì)粒上形成D-GPEi。
2.3構(gòu)建結(jié)果我們構(gòu)建的艾滋病核酸疫苗D-GPEi能在人細胞中高效表達HIV-1核心結(jié)構(gòu)蛋白Gag、GagPol和外殼蛋白Env，全長13KB。D-GPEi質(zhì)粒的骨架主要含有三部分(1)真核細胞表達單位，包括CMV啟動子，多酶切位點和BGH轉(zhuǎn)錄終止信號；(2)原核啟動子驅(qū)動的抗卡那霉素基因(在真核細胞內(nèi)沒有功能)；(3)大腸桿菌復(fù)制子，此用于擴增DNA質(zhì)粒所用，在哺乳動物中不表達。
D-GPEi含有的抗原基因是經(jīng)過修飾的HIV-1中國流行株的gagpol和env，該DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄2個RNA產(chǎn)物用于表達HIV-1的結(jié)構(gòu)蛋白Gag，GagPol和Env。
我們已經(jīng)對D-GPEi進行了全序列測定，其含有13113bp，堿基組成份為adenines24.81％；thymidines20.15％；guanines27.19％；cytosines27.85％。該DNA可溶解在生理鹽水中，濃度可達2mg/ml。
2.4 D-GPEi基因序列與人基因組基因序列同源性分析在人基因組數(shù)據(jù)庫中，用D-GPEi基因序列(共13113bp)與人基因組(共2826392627bp)進行了同源序列比較，沒有發(fā)現(xiàn)有相似性。比較結(jié)果如下。這一結(jié)果從理論上消除了D-GPEi與人基因組發(fā)生高幾率重組的可能性。
3、質(zhì)粒D-GPEi質(zhì)粒的全序列測定。
以3700DNA序列自動分析儀對D-GPEi進行全序列測定，測序結(jié)果SEQ ID NO1。
我們采用DNA序列分析軟件VectorNTI對上述序列進行分析，結(jié)果表明，測定序列與理論序列一致。抗原基因Gag、Pol和Env讀碼框架如下圖所示，氨基酸序列完全正確。
Gag氨基酸序列如下SEQ ID NO4Pol氨基酸序列如下SEQ ID NO5Env氨基酸序列如下SEQ ID NO6根據(jù)以上測序結(jié)果及氨基酸分析，證實了插入基因和表達框架的正確性。
4質(zhì)粒D-GPEi在哺乳動物細胞中抗原表達4.1目的檢測D-GPEi質(zhì)粒在哺乳動物細胞中抗原表達情況。
4.2方法以HIV-1中國流行株陽性人血清、HIV-1 P24蛋白單克隆抗體、抗gp120羊抗血清，通過免疫印跡法檢測D-GPEi質(zhì)粒的表達情況。
4.3試驗材料和儀器6孔板、CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma產(chǎn)品)、LipofectamineTM2000(Invitrogen LifeTechnologies產(chǎn)品)、HEK293細胞細胞；丙烯酰胺和N，N`-亞甲雙丙烯酰胺(購于Sigma公司)；底物顯色液(購于Sigma公司)；細胞裂解液DTT 0.617g，SDS 0.8g，1M Tris-HCl pH6.8 3.2ml，甘油4ml，bromphenol0.08g，H2O 12.8ml；(化學(xué)試劑均購于Sigma公司)Tris-甘氨酸電泳緩沖液25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸(電泳級)(pH8.3)，0.1％SDS；(化學(xué)試劑均購于Sigma公司)轉(zhuǎn)移緩沖液39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris堿，0.037％ SDS(電泳級)，20％ 甲醇；(化學(xué)試劑均購于Sigma公司)5％脫脂奶粉溶液10g脫脂奶粉，200ml 1×PBST；(化學(xué)試劑均購于Sigma公司)HIV-1人陽性抗血清廣西壯族自治區(qū)疾病控制中心提供；抗HIV-1 P24蛋白單克隆抗體美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)試劑中心提供；抗Env羊抗血清美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)試劑中心提供；抗體稀釋液100-150μl HIV-1人陽性抗血清(或抗Env羊抗血清)加入到10-15ml 3％脫脂奶粉溶液中；PBS-T含0.05％ TWEEN 20的PBS(TWEEN 20購于Sigma公司)；二抗液堿性磷酸酶偶聯(lián)羊抗人IgG抗體、堿性磷酸酶偶聯(lián)羊抗鼠IgG抗體和堿性磷酸酶偶聯(lián)兔抗羊IgG抗體購于Jackson ImmunoResearch laboratories，INC4.4試驗步驟這里首先要說明的是我們分別用HIV-1中國流行株陽性人血清(B/C重組亞型，來源于中國廣西)、抗HIV-1 P24蛋白單克隆抗體(美國NIH試劑中心提供)和抗gp120羊抗血清(美國NIH試劑中心提供)作為抗體進行的免疫印記分析。由于HIV-1 Env保守性較差，因此難以找到適合的單克隆抗體。用HIV-1中國流行株陽性人血清進行免疫印記分析，不但能夠檢測抗原表達情況，而且能從另一方面驗證該DNA疫苗的抗原性與HIV-1中國流行株抗原性的一致性。
我們用DNA疫苗D-GPEi感染哺乳動物細胞，然后用上述幾種不同的抗體(HIV-1中國流行株陽性人血清、HIV-1 P24蛋白單克隆抗體、抗gp120羊抗血清)對表達結(jié)果進行檢驗。操作如下4.4.1 D-GPEi以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染細胞①于6孔板內(nèi)每孔加入1.0×106個細胞(HEK293細胞株)，1.5ml細胞培養(yǎng)液(DEAE，10％小牛血清)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24小時至80-90％貼滿板壁。
②每孔中加入如下轉(zhuǎn)染液以無血清無抗生素培養(yǎng)基250μl溶解DNA質(zhì)粒4μg；另在無血清無抗生素培養(yǎng)基250μl加入LipofectamineTM2000 10μl，混勻，室溫放置5分鐘；將上述二種溶液混合，混勻，使DNA充分吸附于LipofectamineTM2000上，室溫放置20分鐘。
③六孔板內(nèi)加入轉(zhuǎn)染液后，混勻。
④將六孔板置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-72小時。
4.4.2細胞裂解①棄去培養(yǎng)液，每孔以2ml PBS洗細胞。
②每孔加入1ml PBS，以細胞刮將細胞刮下轉(zhuǎn)移至具塞小離心管中，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上清。
③向離心管中加入細胞裂解液100μl，搖勻，100℃煮沸10分鐘，11800轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清于另一離心管中。
4.4.3電泳①膠板的配制10％聚丙烯酰胺分離膠10ml30％丙烯酰胺溶液3.3ml，1.5mol/LTris(pH8.8)2.5ml，10％SDS 0.1ml，10％過硫酸銨0.1ml，TEMED 0.004ml；5％濃縮膠溶液5ml30％丙烯酰胺溶液0.83ml，1.0mol/L Tris(pH6.8)0.63ml，10％SDS 0.05ml，10％過硫酸銨0.05ml，TEMED 0.005ml。
迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長再加1cm)。用巴斯德吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層異丙醇(當丙烯酰胺濃度＞10％時)。將凝膠垂直放置于室溫下。
分離膠聚合完全后(30分鐘)，傾出覆蓋層液體，用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的丙烯酰胺。盡可能排去凝膠上的液體，再用紙巾的邊緣吸凈殘留液體。
在已聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的Telfon梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。
濃縮膠聚合完全后(30分鐘)，小心移出Telfon梳子，立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙烯酰胺。如有必要，使用注射器上的注射針頭把濃縮膠上加樣槽之間的齒弄直。把凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。
②每孔加入樣品或?qū)φ掌?5μl，將電泳裝置與電源相接(正極應(yīng)接下槽)。凝膠上所加電壓為200V。當電泳直至溴酚藍到達分離膠底部(約需40分鐘)，然后關(guān)閉電源。
③從電泳裝置上卸下玻璃板，放在紙巾上，撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔(第一槽)凝膠下部切去一角以標注凝膠的方位。
4.4.4免疫印跡①切6張Whatman 3MM濾紙和1張硝酸纖維素膜(Millipo HAWP或相應(yīng)的濾膜)，其大小都應(yīng)與凝膠大小完全吻合；以轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡硝酸纖維素膜、濾紙。用軟鉛筆在濾膜一角作好標記。將凝膠于去離子水中略漂洗一下。
②安裝轉(zhuǎn)移裝置采用simi-dry(Biorad產(chǎn)品)方法把電泳膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。安裝方法由底層依次安裝底部電極(陽極)、3層濾紙、一張硝酸纖維素膜、凝膠、3層濾紙、頂部電極(陰極)。凝膠左下角置于硝酸纖維素膜標記處。排除所有氣泡。
③連接電源，15V轉(zhuǎn)移30分鐘，斷開電源。
④卸下裝置，取出硝酸纖維素膜，放入5％脫脂奶粉溶液中，室溫搖床搖1小時。
⑤棄去脫脂奶粉溶液，以1×PBST 15ml，室溫搖床洗膜15分鐘。
⑥分別加入稀釋的HIV-1中國流行株陽性人血清、HIV-1 P24蛋白單克隆抗體、抗gp120羊抗血清10-15ml，室溫搖床振蕩1小時，棄去陽性血清或單克隆抗體，硝酸纖維素膜以雙蒸水沖洗兩次。
⑦以1×PBST 15ml，室溫洗膜三次，每次5分鐘。
⑧棄去PBST，分別加入二抗液10μl，1×PBST 20ml，室溫搖床振蕩45分鐘。
⑨取出膜，棄去液體；以1×PBST洗膜，棄去洗液；再以1×PBST洗膜，搖床振搖10分鐘。
4.4.5顯色棄去液體，加入底物顯色液20ml。
4.4.6終止反應(yīng)顯色清晰后棄去顯色液，加水適量，振搖，棄去水，將硝酸纖維素膜取出，晾干。
4.5試驗結(jié)果用D-GPEi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，試驗結(jié)果如圖3所示，Gag、GagPol和Env在哺乳動物細胞中都得到較好的表達。能正確表達Gag、GagPol和Env蛋白，也從另一個角度證明了插入基因和表達框架的正確性。
實施例3 質(zhì)粒D-GPEi的抗原性研究目的通過質(zhì)粒D-GPEi在哺乳動物細胞中的抗原表達，考察質(zhì)粒D-GPEi的抗原性。
具體的實驗方法和儀器試劑同實施例2中4質(zhì)粒D-GPEi在哺乳動物細胞中抗原表達。
結(jié)果和討論為保證本艾滋病疫苗的抗原性與艾滋病病毒中國流行株(區(qū)域性)抗原性的一致性，我們根據(jù)大量流行病學(xué)研究結(jié)果確認了HIV-1中國流行株的基因序列。為增加抗原在體內(nèi)的表達效率，我們對野生型HIV-1的基因序列進行了修飾，設(shè)計了艾滋病疫苗抗原部分的基因序列，但保證抗原蛋白氨基酸殘基順序不變。
為進一步確認艾滋病疫苗的抗原性與艾滋病病毒中國流行株抗原性的一致性，我們用D-GPEi轉(zhuǎn)染HEK293細胞來表達HIV-1抗原，并且采用免疫印跡的方法確認上述表達的抗原是否被中國的流行(來源于廣西壯族自治區(qū)HIV-1高發(fā)區(qū))毒株抗血清在免疫印跡試驗中所識別。同時用HIV-1中國流行株(來源于廣西壯族自治區(qū)HIV-1高發(fā)區(qū))病毒抗原作為陽性對照，試驗結(jié)果如圖4所示。
綜上所述，D-GPEi所表達蛋白能夠被中國流行(區(qū)域性)的抗血清所識別并與對應(yīng)的標準病毒抗原性一致。
實施例4 藥用組合物質(zhì)粒D-GPEi與生理鹽水的重量體積比為1.5mg/ml，每次注射2ml，注射3次。
實施例6 藥用組合物質(zhì)粒D-GPEi與生理鹽水的重量體積比為2mg/ml，每次注射2ml，注射3次。
實施例7 藥用組合物質(zhì)粒D-GPEi與生理鹽水的重量體積比為2.5mg/ml，每次注射2ml，注射3次。
序列表SEQ ID NO1TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGACTCTATAGGCACACCCCTTTGGCTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGCCTATACACCCCCGCTTCCTTATGCTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTATCTCTATTGGCTATATGCCAATACTCTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCCCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACAACGCCGTCCCCCGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAGCGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCCACATCCGAGCCCTGGTCCCATGCCTCCAGCGGCTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACAATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCACGGCTGACGCAGATGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTATTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCGTCGACACGTGTGATCAGATATCGCGGCCGCTCTAGAATGGGCGCCCGGGCCAGCATCCTGCGGGGAGGCAAGCTGGACAAATGGGAGAAGATCCGGCTGAGACCCGGAGGCAAGAAACACTACATGCTGAAGCACCTGGTGTGGGCCAGCCGGGAGCTGGAAAGATTCGCCCTGAACCCCGGCCTCCTGGAGACCAGCGAAGGCTGCAAGCAGATCATTAAGCAGCTGCAACCCGCCCTGCAGACCGGCACCGAGGAACTGCGGAGCCTGTTCAACACCGTGGCCACCCTGTACTGCGTGCACGAGGAAATCGAGGTGCGGGACACCAAGGAGGCCCTGGACAAGATCGAGGAAGAGCAGAACAAGATCCAGCAAAAGACCCAGCAGGCCAAGAAAGCCGACGAGAAGGTGAGCCAGAACTACCCCATCGTGCAGAACCCCCAGGGCCAGATGGTGCACCAGCCTCTGAGCCCCCGGACCCTGAACGCCTGGGTGAAGGTCGTGGAGGAAAAGGCCTTCAGCCCCGAGGTGATCCCTATGTTCACCGCCCTGAGCGAGGGCGCCACCCCCCAGGACCTGAACACCATGCTGAACACCGTGGGCGGGCACCAGGCTGCCATGCAGATGCTGAAGGACACCATCAACGAGGAAGCCGCTGAGTGGGACCGGCTGCACCCCGTGCACGCCGGCCCCGTGGCCCCTGGCCAGATGCGGGAGCCCAGAGGCAGCGACATCGCCGGCACCACATCCAGCCTGCAGGAGCAGATCGGCTGGATGACCAACAATCCTCCCATCCCAGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATTATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCCACCTCCATCCTG
GACATCAAGCAGGGCCCTAAGGAGCCCTTCCGGGACTACGTGGATAGATTCTTTAAGACCCTGCGGGCCGAGCAGGCCACCCAGGACGTGAAGAACTGGATGACCGACACCCTGCTCGTGCAGAATGCCAACCCCGACTGCAAGACCATCCTGCGGGCCCTGGGCAGCGGCGCCTCCCTGGAAGAGATGATGACCGCCTGCCAGGGCGTGGGAGGCCCCAGCCACAAGGCCCGGGTGCTGGCTGAGGCCATGAGCCAGACCTCCAACACCATCCTGATGCAGCGGAGCAACTTCAAGGGCAGCAAACGGATCGTGAAGTGCTTCAACTGTGGCAAGGAGGGCCACATCGCCAAGAACTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAAGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAAGACTGTACTGAAAGGCAGGCGAATTTTTTAGGGAAATTTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTCCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGCAGAGAGCTTCAGGTTCGAGGAGACAACCCCAGCTCCGAAGCAGGAACCGAAAGACAGGGAACCCTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTTGTCTCAATAAAAGTAGGGGGCCAGATAAAAGAGGCTCTCTTGGCCACCGGCGCCGATGACACCGTGCTGGAGGAAGTGAACCTGCCCGGCAAGTGGAAGCCCAAGATGATCGGCGGGATCGGAGGCTTCATCAAGGTGCGGCAGTACGAGCAGATCCCCATTGAGATCTGCGGCAAGAAAGCCATCGGCACCGTGCTGGTGGGCCCCACCCCCGTGAACATCATTGGCCGGAACATGCTGACCCAGCTGGGCTGCACCCTGAACTTCCCCATCAGCCCCATCGAGACCGTGCCCGTGAAGCTGAAGCCCGGCATGGACGGCCCCAAGGTGAAGCAGTGGCCCCTGACCGAGGAAAAGATCAAGGCCCTGACCGCCATCTGCGACGAGATGGAAAAGGAGGGCAAGATCACCAAGATCGGCCCCGACAACCCCTACAACACCCCCATCTTCGCCATCCGGAAGAAAGACAGCTCCAAGTGGCGGAAGCTGGTGGACTTCCGGGAGCTGAACAAGCGGACCCAGGACTTCTGGGAGGTGCAGCTGGGCATCCCCCACCCCGCCGGCCTGAAGAAAAAGAAAAGCGTGACCGTGCTGGACGTGGGCGACGCCTACTTCAGCGTGCCCCTGGATAAGGACTTCCGGAAGTACACCGCCTTCACCATCCCCAGCGTGAACAATGAGACCCCCGGCATCCGGTACCAGTACAACGTGCTGCCCCAGGGCTGGAAGGGCAGCCCCGCCATCTTCCAGTGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACCCCGACATCGTGATCTACCAGTACATGCATGATCTGTACGTGGGCAGCGACCTGGAGATCGGCCAGCACCGGACCAAGATCGAGGAACTGCGGGAGCACCTCCTGAAGTGGGGCTTCACCACACCCGACAAGAAACACCAGAAGGAGCCTCCCTTCCTGTGGATGGGCTACGAGCTGCACCCCGACAAGTGGACCGTGCAGCCCATCCAGCTGCCCGAGAAGGACAGCTGGACCGTGAACGACATCCAGAAGCTGGTGGGCAAGCTGAACTGGGCCAGCCAGATCTACCCCGGCATCAAGGTGCGGCAGCTGTGCAAGCTCCTGCGGGGCGCCAAGGCCCTGACCGACATCGTGCCCCTGACCGAGGAAGCCGAGCTGGAACTGGCCGAGAACCGGGAGATCCTGAAGGAGCCCGTGCACGGCGCCTACTATGACCCCAGCAAGGAGCTGATCGCCGAGATCCAGAAGCAGGGCCAAGACCAGTGGACCTACCAGATCTACCAGGAGCCCTTCAAGAACCTGAAGACCGGCAAGTACGCCAAGATGCGGACCGCCCACACCAACGACGTGAAGCAGCTGACCGAGGCCGTGCAGAAGATCGCCATGGAGAGCATCGTGATTTGGGGCAAGATCCCCAAGTTCCGGCTGCCCATCCAGAAGGAGACCTGGGAGACCTGGTGGACCGACTACTGGCAGGCCACCTGGATCCCCGAGTGGGAGTTCGTGAACACCCCTCCCCTGGTGAAGCTGTGGTACCAGCTGGAGAAGGACCCCATCGCCGGCGTGGAGACCTTCTACGTGGACGGCGCCGCTAACCGGGAGACCAAGATCGGCAAGGCCGGCTACGTGACCGACAGAGGCCGGAAGAAAATCGTGAGCCTGACCGACACAACCAACCAGAAGACCGAGCTGCAGGCCATCTACATCGCCCTGCAGGACAGCGGCAGCGAGGTGAACATCGTGACCGACAGCCAGTACGCCCTGGGCATCATTCAGGCCCAGCCCGACAAGAGCGAGAGCGAGCTGGTGAACCAGATCATTGAGCAGCTGATCAAGAAAGAGCGGGTGTACCTGAGCTGGGTGCCCGCCCACAAGGGCATCGGGGGCAACGAGCAGGTGGACAAGCTGGTGAGCAACGGCATCCGGAAGGTGCTGTTCCTGGACGGCATCGACAAGGCCCAGGAGGAACACGAGAAGTACCACAGCAACTGGCGGGCCATGGCCAGCGACTTCAACCTGCCTCCCATCGTGGCCAAGGAGATCGTGGCCAGCTGCGACCAGTGTCAGCTGAAGGGCGAGGCCATGCACGGCCAGGTGGACTGCAGCCCCGGCATCTGGCAGCTGGACTGCACCCACCTGGAGGGCAAGATCATTCTGGTGGCCGTCCACGTGGCCAGCGGCTACATCGAGGCCGAGGTGATCCCCGCCGAGACCGGCCAGGAGACCGCCTACTTCATCCTGAAGCTGGCCGGCCGGCAGGATGAGGACTGAGGATCTCACGTGGAATTCGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCC
ATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGCACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCGGCCGCTAGCACGCGCCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGACTCTATAGGCACACCCCTTTGGCTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGCCTATACACCCCCGCTTCCTTATGCTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTATCTCTATTGGCTATATGCCAATACTCTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCCCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACAACGCCGTCCCCCGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAGCGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCCACATCCGAGCCCTGGTCCCATGCCTCCAGCGGCTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACAATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCACGGCTGACGCAGATGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTATTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCGTCGACACGTGTGATCAGATATCGCGGCCGCTCTAGACCAGGCGCCTGGATCCGCCCAGATCTACCATGAGAGTGAGGGGCACCAGACGGAACTACCAACAGTGGTGGATCTGGGGCGTGCTGGGCTTCTGGATGCTGATGATCTGCAACGTGGAGGGCAACCTGTGGGTGACCGTCTACTATGGCGTGCCCGTCTGGAAGGAGGCCAAGACCACACTGTTCTGTGCCAGCGACGCTAAGGCCTACGAGACCGAGGTGCACAACGTCTGGGCCACCCATGCCTGCGTGCCAACCGACCCTAACCCACAGGAGATCGTGATGGAGAACGTGACCGAGAATTTCAACATGTGGAATAACGACATGGTGAACCAGATGCACGAGGACGTGATCAGCCTGTGGGACCAGAGCCTGAAGCCCTGCGTGAAGCTGACCCCCCTGTGCGTGACCCTGGAATGTCGGAACGTGAGCTCCAACGGCAACGGCACACGGAACGAGACCTACAACGAGAGCGTGAAGGAGGTGAAGAACTGCAGCTTCAACGCCACCACACTGCTCAGAGACCGGAAGAAAACCGTGTACGCCCTGTTCTACAGACTGGACATTGCTCCCCTGAACGACGAGAACAGCGGCAAGAACTCCAGCGAGTACTATCGGCTGATCAACTGCAACACCAGCGCCATCACCCAGGCCTGCCCCAAGGTGACCTTCGACCCTATTCCCATCCACTACTGCACCCCCGCCGGCTACGCCATCCTGAAGTGCAACGACAAAATCTTCAACGGCACCGGACAGTGTCACAACGTGTCCACCGTGCAGTGCACCCATGGCATCAAGCCCGTCGTGTCCACCCAGCTGCTCCTGAATGGAAGCCTGGCCGAGAGAGAGATCATTATCCGGAGCGAGAACCTGACCAATAACGTGAAGACCATCATTGTGCACCTGAACAAGAGCGTGGAGATCGTGTGCACCCGGCCCAACAATAACACCAGGAAGAGCATCAGAATTGGGCCCGGCCAGACCTTCTATGCTACCGGCGACATCATTGGCGACATCAGACAGGCTCATTGCAACATCAGCAAGGACAAGTGGGACGAGACACTGCAGCGGGTGAGCAAGAAACTGGCCGAGCACTTCCCCAACAAGACCATCAAGTTTGCCAGCTCTTCCGGCGGA
GACCTGGAGATCACCACACACAGCTTCAACTGCCGGGGCGAGTTCTTTTACTGCAACACCAGCGGACTGTTCAACGGCACCTACAACGGCACCAAGGACAACAGCTCCAGCATCATTACCATCCCCTGTCGGATCAAGCAGATTATCAACATGTGGCAGGAAGTGGGACGGGCCATGTACGCTCCACCCATCGAGGGCAACATCACCTGCAAGTCCAACATCACCGGCCTGCTCCTGGTGCGGGACGGCGGAAGAACAGAGAGCAACGACACCGAAATCTTCAGACCCGGCGGAGGCGACATGCGGAACAATTGGCGGAACGAGCTGTACAAGTACAAGGTGGTCGAGATCAAACCCCTGGGAGTGGCCCCTACAGCTGCCAAGAGACGGGTGGTCGAGAGGGAGAAGCGGGCCGTGGGCCTGGGAGCTGTGTTCCTGGGCTTCCTGGGAGCTGCCGGGAGCACCATGGGCGCTGCCAGCATCACCCTGACCGTGCAAGCCAGACAGCTCCTGAGCGGCATCGTGCAGCAACAGAGCAACCTGCTCAGAGCCATCGAAGCCCAACAGCACATGCTCCAGCTGACCGTGTGGGGCATCAAGCAACTCCAGACCCGGGTGCTCGCCATCGAACGGTACCTGAAGGACCAGCAGCTGCTCGGCATCTGGGGCTGTTCCGGAAAGCTGATCTGCACAACCGCCGTGCCCTGGAACTCCAGCTGGTCTAACAAGAGCCAACAGGAAATCTGGGACAACATGACCTGGATGCAGTGGGACAAGGAGATCAGCAACTACACCAACACCATCTACAGACTGCTCGAGGACAGCCAGAACCAACAGGAGCGGAATGAGAAGGACCTGCTCGCCCTGGACAGCTGGAAGAACCTGTGGAGCTGGTTTGACATCACTAACTGGCTGTGGTACATTAAAATCTTCATTATGATCGTGGGCGGGCTGATCGGAAGCAGGATTATCTTCGCCGTGCTGAGCATCGTGAACAGAGTGCGGCAGGGCTACTCCCCACTGAGCTTCCAGATCCCCACCCCTAACCCCGGCGGACCTGGCAGACTGGGCAGAATCGAGGAAGAGGGAGGCGAACAGGACAAGACCCGGAGCATCAGGCTGGTGAACGGCTTCCTGGCCCTGGCCTGGGACGATCTGCGGAACCTGTGCCTGTTCAGCTACCACAGACTGAGCGACTTCATCCTCCTGACTGCTAGGGGAGTGGAGCTGCTCGGGAGAAACTCTCTGAGGGGCCTGCAGCGGGGATGGGAAGCTCTGAAGTACCTGGGCAACCTGGTGCAGTACTGGGGCCTGGAGCTGAAGAAAAGCACAATCTCCCTGGTGGACACCATCGCCATCGTGGTCGCCGAGGGCACCGATAGAATCATTAACATCGTGCAGGGAATTTGCCGGGCCATCCACAACGTGCCTAGAAGGATCAGACAGGGACTGGAGGCCGCTCTGCAGTGAGGATCCAGATCTGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGCACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTACCCAGGTGCTGAAGAATTGACCCGGTTCCTCCTGGGCCAGAAAGAAGCAGGCACATCCCCTTCTCTGTGACACACCCTGTCCACGCCCCTGGTTCTTAGTTCCAGCCCCACTCATAGGACACTCATAGCTCAGGAGGGCTCCGCCTTCAATCCCACCCGCTAAAGTACTTGGAGCGGTCTCTCCCTCCCTCATCAGCCCACCAAACCAAACCTAGCCTCCAAGAGTGGGAAGAAATTAAAGCAAGATAGGCTATTAAGTGCAGAGGGAGAGAAAATGCCTCCAACATGTGAGGAAGTAATGAGAGAAATCATAGAATTTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATAT
GAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCGPCINS基因序列如SEQ ID NO2ATGGGCGCCCGGGCCAGCATCCTGCGGGGAGGCAAGCTGGACAAATGGGAGAAGATCCGGCTGAGACCCGGAGGCAAGAAACACTACATGCTGAAGCACCTGGTGTGGGCCAGCCGGGAGCTGGAAAGATTCGCCCTGAACCCCGGCCTCCTGGAGACCAGCGAAGGCTGCAAGCAGATCATTAAGCAGCTGCAACCCGCCCTGCAGACCGGCACCGAGGAACTGCGGAGCCTGTTCAACACCGTGGCCACCCTGTACTGCGTGCACGAGGAAATCGAGGTGCGGGACACCAAGGAGGCCCTGGACAAGATCGAGGAAGAGCAGAACAAGATCCAGCAAAAGACCCAGCAGGCCAAGAAAGCCGACGAGAAGGTGAGCCAGAACTACCCCATCGTGCAGAACCCCCAGGGCCAGATGGTGCACCAGCCTCTGAGCCCCCGGACCCTGAACGCCTGGGTGAAGGTCGTGGAGGAAAAGGCCTTCAGCCCCGAGGTGATCCCTATGTTCACCGCCCTGAGCGAGGGCGCCACCCCCCAGGACCTGAACACCATGCTGAACACCGTGGGCGGGCACCAGGCTGCCATGCAGATGCTGAAGGACACCATCAACGAGGAAGCCGCTGAGTGGGACCGGCTGCACCCCGTGCACGCCGGCCCCGTGGCCCCTGGCCAGATGCGGGAGCCCAGAGGCAGCGACATCGCCGGCACCACATCCAGCCTGCAGGAGCAGATCGGCTGGATGACCAACAATCCTCCCATCCCAGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATTATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCCACCTCCATCCTGGACATCAAGCAGGGCCCTAAGGAGCCCTTCCGGGACTACGTGGATAGATTCTTTAAGACCCTGCGGGCCGAGCAGGCCACCCAGGACGTGAAGAACTGGATGACCGACACCCTGCTCGTGCAGAATGCCAACCCCGACTGCAAGACCATCCTGCGGGCCCTGGGCAGCGGCGCCTCCCTGGAAGAGATGATGACCGCCTGCCAGGGCGTGGGAGGCCCCAGCCACAAGGCCCGGGTGCTGGCTGAGGCCATGAGCCAGACCTCCAACACCATCCTGATGCAGCGGAGCAACTTCAAGGGCAGCAAACGGATCGTGAAGTGCTTCAACTGTGGCAAGGAGGGCCACATCGCCAAGAACTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAAGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGACACCA
AATGAAAGACTGTACTGAAAGGCAGGCGAATTTTTTAGGGAAATTTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTCCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGCAGAGAGCTTCAGGTTCGAGGAGACAACCCCAGCTCCGAAGCAGGAACCGAAAGACAGGGAACCCTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTTGTCTCAATAAAAGTAGGGGGCCAGATAAAAGAGGCTCTCCTGGACACCGGCGCCGATGACACCGTGCTGGAGGAAGTGAACCTGCCCGGCAAGTGGAAGCCCAAGATGATCGGCGGGATCGGAGGCTTCATCAAGGTGCGGCAGTACGAGCAGATCCCCATTGAGATCTGCGGCAAGAAAGCCATCGGCACCGTGCTGGTGGGCCCCACCCCCGTGAACATCATTGGCCGGAACATGCTGACCCAGCTGGGCTGCACCCTGAACTTCCCCATCAGCCCCATCGAGACCGTGCCCGTGAAGCTGAAGCCCGGCATGGACGGCCCCAAGGTGAAGCAGTGGCCCCTGACCGAGGAAAAGATCAAGGCCCTGACCGCCATCTGCGACGAGATGGAAAAGGAGGGCAAGATCACCAAGATCGGCCCCGACAACCCCTACAACACCCCCATCTTCGCCATCCGGAAGAAAGACAGCTCCAAGTGGCGGAAGCTGGTGGACTTCCGGGAGCTGAACAAGCGGACCCAGGACTTCTGGGAGGTGCAGCTGGGCATCCCCCACCCCGCCGGCCTGAAGAAAAAGAAAAGCGTGACCGTGCTGGACGTGGGCGACGCCTACTTCAGCGTGCCCCTGGATAAGGACTTCCGGAAGTACACCGCCTTCACCATCCCCAGCGTGAACAATGAGACCCCCGGCATCCGGTACCAGTACAACGTGCTGCCCCAGGGCTGGAAGGGCAGCCCCGCCATCTTCCAGTGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACCCCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGACGATCTGTACGTGGGCAGCGACCTGGAGATCGGCCAGCACCGGACCAAGATCGAGGAACTGCGGGAGCACCTCCTGAAGTGGGGCTTCACCACACCCGACAAGAAACACCAGAAGGAGCCTCCCTTCCTGTGGATGGGCTACGAGCTGCACCCCGACAAGTGGACCGTGCAGCCCATCCAGCTGCCCGAGAAGGACAGCTGGACCGTGAACGACATCCAGAAGCTGGTGGGCAAGCTGAACTGGGCCAGCCAGATCTACCCCGGCATCAAGGTGCGGCAGCTGTGCAAGCTCCTGCGGGGCGCCAAGGCCCTGACCGACATCGTGCCCCTGACCGAGGAAGCCGAGCTGGAACTGGCCGAGAACCGGGAGATCCTGAAGGAGCCCGTGCACGGCGCCTACTATGACCCCAGCAAGGAGCTGATCGCCGAGATCCAGAAGCAGGGCCAAGACCAGTGGACCTACCAGATCTACCAGGAGCCCTTCAAGAACCTGAAGACCGGCAAGTACGCCAAGATGCGGACCGCCCACACCAACGACGTGAAGCAGCTGACCGAGGCCGTGCAGAAGATCGCCATGGAGAGCATCGTGATTTGGGGCAAGATCCCCAAGTTCCGGCTGCCCATCCAGAAGGAGACCTGGGAGACCTGGTGGACCGACTACTGGCAGGCCACCTGGATCCCCGAGTGGGAGTTCGTGAACACCCCTCCCCTGGTGAAGCTGTGGTACCAGCTGGAGAAGGACCCCATCGCCGGCGTGGAGACCTTCTACGTGGACGGCGCCGCTAACCGGGAGACCAAGATCGGCAAGGCCGGCTACGTGACCGACAGAGGCCGGAAGAAAATCGTGAGCCTGACCGACACAACCAACCAGAAGACCGAGCTGCAGGCCATCTACATCGCCCTGCAGGACAGCGGCAGCGAGGTGAACATCGTGACCGACAGCCAGTACGCCCTGGGCATCATTCAGGCCCAGCCCGACAAGAGCGAGAGCGAGCTGGTGAACCAGATCATTGAGCAGCTGATCAAGAAAGAGCGGGTGTACCTGAGCTGGGTGCCCGCCCACAAGGGCATCGGGGGCAACGAGCAGGTGGACAAGCTGGTGAGCAACGGCATCCGGAAGGTGCTGTTCCTGGACGGCATCGACAAGGCCCAGGAGGAACACGAGAAGTACCACAGCAACTGGCGGGCCATGGCCAGCGACTTCAACCTGCCTCCCATCGTGGCCAAGGAGATCGTGGCCAGCTGCGACCAGTGTCAGCTGAAGGGCGAGGCCATGCACGGCCAGGTGGACTGCAGCCCCGGCATCTGGCAGCTGGACTGCACCCACCTGGAGGGCAAGATCATTCTGGTGGCCGTCCACGTGGCCAGCGGCTACATCGAGGCCGAGGTGATCCCCGCCGAGACCGGCCAGGAGACCGCCTACTTCATCCTGAAGCTGGCCGGCCGGTGGCCCGTGAAGGTGATCCACACCGACAACGGCAGCAACTTCACCAGCGCCGCTGTGAAGGCAGCCTGCTGGTGGGCCGGCATCCAGCAAGAGTTCGGCATCCCCTACAACCCCCAGAGCCAGGGCGTGGTGGAGAGCATGAACAAGGAGCTGAAAAAGCTGATCGGCCAGGTGCGGGACCAGGCCGAGCACCTGAAGACCGCCGTGCAGATGGCCGTGTTCATCCACAACTTCAAGCGGAAGGGCGGGATCGGAGGCTACAGCGCCGGCGAGCGGATCGTGGACATTATCGCCACCGACATCCAGACCCGGGAGCTGCAGAAGCAGATCATTAAGATCCAGAACTTCCGGGTGTACTATAGAGACAGCCGGGACCCCATCTGGAAGGGCCCCGCCAAGCTGCTCTGGAAGGGCGAGGGCGCCGTCGTGATCCAGGACAACAGCGACATCAAGGTCGTGCCCAGAC
GGAAGGCCAAGATTATCAAGGACTACGGCAAGCAGATGGCCGGCGCCGACTGCGTGGCCGGCCGGCAGGATGAGGACTGAENVCINS基因序列如SEQ ID NO3ATGAGAGTGAGGGGCACCAGACGGAACTACCAACAGTGGTGGATCTGGGGCGTGCTGGGCTTCTGGATGCTGATGATCTGCAACGTGGAGGGCAACCTGTGGGTGACCGTCTACTATGGCGTGCCCGTCTGGAAGGAGGCCAAGACCACACTGTTCTGTGCCAGCGACGCTAAGGCCTACGAGACCGAGGTGCACAACGTCTGGGCCACCCATGCCTGCGTGCCAACCGACCCTAACCCACAGGAGATCGTGATGGAGAACGTGACCGAGAATTTCAACATGTGGAATAACGACATGGTGAACCAGATGCACGAGGACGTGATCAGCCTGTGGGACCAGAGCCTGAAGCCCTGCGTGAAGCTGACCCCCCTGTGCGTGACCCTGGAATGTCGGAACGTGAGCTCCAACGGCAACGGCACACGGAACGAGACCTACAACGAGAGCGTGAAGGAGGTGAAGAACTGCAGCTTCAACGCCACCACACTGCTCAGAGACCGGAAGAAAACCGTGTACGCCCTGTTCTACAGACTGGACATTGCTCCCCTGAACGACGAGAACAGCGGCAAGAACTCCAGCGAGTACTATCGGCTGATCAACTGCAACACCAGCGCCATCACCCAGGCCTGCCCCAAGGTGACCTTCGACCCTATTCCCATCCACTACTGCACCCCCGCCGGCTACGCCATCCTGAAGTGCAACGACAAAATCTTCAACGGCACCGGACAGTGTCACAACGTGTCCACCGTGCAGTGCACCCATGGCATCAAGCCCGTCGTGTCCACCCAGCTGCTCCTGAATGGAAGCCTGGCCGAGAGAGAGATCATTATCCGGAGCGAGAACCTGACCAATAACGTGAAGACCATCATTGTGCACCTGAACAAGAGCGTGGAGATCGTGTGCACCCGGCCCAACAATAACACCAGGAAGAGCATCAGAATTGGGCCCGGCCAGACCTTCTATGCTACCGGCGACATCATTGGCGACATCAGACAGGCTCATTGCAACATCAGCAAGGACAAGTGGGACGAGACACTGCAGCGGGTGAGCAAGAAACTGGCCGAGCACTTCCCCAACAAGACCATCAAGTTTGCCAGCTCTTCCGGCGGAGACCTGGAGATCACCACACACAGCTTCAACTGCCGGGGCGAGTTCTTTTACTGCAACACCAGCGGACTGTTCAACGGCACCTACAACGGCACCAAGGACAACAGCTCCAGCATCATTACCATCCCCTGTCGGATCAAGCAGATTATCAACATGTGGCAGGAAGTGGGACGGGCCATGTACGCTCCACCCATCGAGGGCAACATCACCTGCAAGTCCAACATCACCGGCCTGCTCCTGGTGCGGGACGGCGGAAGAACAGAGAGCAACGACACCGAAATCTTCAGACCCGGCGGAGGCGACATGCGGAACAATTGGCGGAACGAGCTGTACAAGTACAAGGTGGTCGAGATCAAACCCCTGGGAGTGGCCCCTACAGCTGCCAAGAGACGGGTGGTCGAGAGGGAGAAGCGGGCCGTGGGCCTGGGAGCTGTGTTCCTGGGCTTCCTGGGAGCTGCCGGGAGCACCATGGGCGCTGCCAGCATCACCCTGACCGTGCAAGCCAGACAGCTCCTGAGCGGCATCGTGCAGCAACAGAGCAACCTGCTCAGAGCCATCGAAGCCCAACAGCACATGCTCCAGCTGACCGTGTGGGGCATCAAGCAACTCCAGACCCGGGTGCTCGCCATCGAACGGTACCTGAAGGACCAGCAGCTGCTCGGCATCTGGGGCTGTTCCGGAAAGCTGATCTGCACAACCGCCGTGCCCTGGAACTCCAGCTGGTCTAACAAGAGCCAACAGGAAATCTGGGACAACATGACCTGGATGCAGTGGGACAAGGAGATCAGCAACTACACCAACACCATCTACAGACTGCTCGAGGACAGCCAGAACCAACAGGAGCGGAATGAGAAGGACCTGCTCGCCCTGGACAGCTGGAAGAACCTGTGGAGCTGGTTTGACATCACTAACTGGCTGTGGTACATTAAAATCTTCATTATGATCGTGGGCGGGCTGATCGGAAGCAGGATTATCTTCGCCGTGCTGAGCATCGTGAACAGAGTGCGGCAGGGCTACTCCCCACTGAGCTTCCAGATCCCCACCCCTAACCCCGGCGGACCTGGCAGACTGGGCAGAATCGAGGAAGAGGGAGGCGAACAGGACAAGACCCGGAGCATCAGGCTGGTGAACGGCTTCCTGGCCCTGGCCTGGGACGATCTGCGGAACCTGTGCCTGTTCAGCTACCACAGACTGAGCGACTTCATCCTCCTGACTGCTAGGGGAGTGGAGCTGCTCGGGAGAAACTCTCTGAGGGGCCTGCAGCGGGGATGGGAAGCTCTGAAGTACCTGGGCAACCTGGTGCAGTACTGGGGCCTGGAGCTGAAGAAAAGCACAATCTCCCTGGTGGACACCATCGCCATCGTGGTCGCCGAGGGCACCGATAGAATCATTAACATCGTGCAGGGAATTTGCCGGGCCATCCACAACGTGCCTAGAAGGATCAGACAGGGACTGGAGGCCGCTCTGCAGTGAGag氨基酸序列如下SEQ ID NO4Met Gly Ala Arg Ala Ser Ile Leu Arg Gly Gly Lys Leu Asp Lys TrpGlu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys His Tyr Met Leu Lys
His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn ProGly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Lys Gln Ile Ile Lys Gln LeuGln Pro Ala Leu Gln Thr Gly Thr Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe AsnThr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Glu Ile Glu Val Arg AspThr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ile GlnGln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Lys Ala Asp Glu Lys Val Ser Gln AsnTyr Pro Ile Val Gln Asn Pro Gln Gly Gln Met Val His Gln Pro LeuSer Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys AlaPhe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Thr Ala Leu Ser Glu Gly AlaThr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His GlnAla Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala GluTrp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Val Ala Pro Gly GlnMet Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Ser LeuGln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val GlyGlu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val ArgMet Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Lys Gln Gly Pro Lys GluPro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala GluGln Ala Thr Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Asp Thr Leu Leu ValGln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Arg Ala Leu Gly SerGly Ala Ser Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly GlyPro Ser His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Thr SerAsn Thr Ile Leu Met Gln Arg Ser Asn Phe Lys Gly Ser Lys Arg IleVal Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn CysArg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly HisGln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys PheTrp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg ProGlu Pro Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ser Phe Arg Phe Glu Glu Thr ThrPro Ala Pro Lys Gln Glu Pro Lys Asp Arg Glu Pro Leu Thr Ser LeuArg Ser Leu Phe Gly Ser Asp Pro Leu Ser GlnPol氨基酸序列如下SEQ ID NO5Phe Phe Arg Glu Ile Leu Ala Phe Pro Gln Gly Glu Ala Arg Glu PheSer Pro Glu Gln Thr Arg Ala Asn Ser Pro Thr Ser Arg Glu Leu GlnVal Arg Gly Asp Asn Pro Ser Ser Glu Ala Gly Thr Glu Arg Gln GlyThr Leu Asn Phe Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val SerIle Lys Val Gly Gly Gln Ile Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly AlaAsp Asp Thr Val Leu Glu Glu Val Asn Leu Pro Gly Lys Trp Lys ProLys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr GluGln Ile Pro Ile Glu Ile Cys Gly Lys Lys Ala Ile Gly Thr Val LeuVal Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Met Leu Thr GlnLeu Gly Cys Thr Leu Asn Phe Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr Val ProVal Lys Leu Lys Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp ProLeu Thr Glu Glu Lys Ile Lys Ala Leu Thr Ala Ile Cys Asp Glu MetGlu Lys Glu Gly Lys Ile Thr Lys Ile Gly Pro Asp Asn Pro Tyr AsnThr Pro Ile Phe Ala Ile Arg Lys Lys Asp Ser Ser Lys Trp Arg LysLeu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp GluVal Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys SerVal Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu AspLys Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Val Asn AsnGlu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly TrpLys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Cys Ser Met Thr Lys Ile Leu GluPro Phe Arg Lys Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met AspAsp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln His Arg Thr LysIle Glu Glu Leu Arg Glu His Leu Leu Lys Trp Gly Phe Thr Thr ProAsp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr GluLeu His Pro Asp Lys Trp Thr Val Gln Pro Ile Gln Leu Pro Glu LysAsp Ser Trp Thr Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu AsnTrp Ala Ser Gln Ile Tyr Pro Gly Ile Lys Val Arg Gln Leu Cys LysLeu Leu Arg Gly Ala Lys Ala Leu Thr Asp Ile Val Pro Leu Thr GluGlu Ala Glu Leu Glu Leu Ala Glu Asn Arg Glu Ile Leu Lys Glu Pro
Val His Gly Ala Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Glu Leu Ile Ala Glu IleGln Lys Gln Gly Gln Asp Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Glu ProPhe Lys Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Ala Lys Met Arg Thr Ala HisThr Asn Asp Val Lys Gln Leu Thr Glu Ala Val Gln Lys Ile Ala MetGlu Ser Ile Val Ile Trp Gly Lys Ile Pro Lys Phe Arg Leu Pro IleGln Lys Glu Thr Trp Glu Thr Trp Trp Thr Asp Tyr Trp Gln Ala ThrTrp Ile Pro Glu Trp Glu Phe Val Asn Thr Pro Pro Leu Val Lys LeuTrp Tyr Gln Leu Glu Lys Asp Pro Ile Ala Gly Val Glu Thr Phe TyrVal Asp Gly Ala Ala Asn Arg Glu Thr Lys Ile Gly Lys Ala Gly TyrVal Thr Asp Arg Gly Arg Lys Lys Ile Val Ser Leu Thr Asp Thr ThrAsn Gln Lys Thr Glu Leu Gln Ala Ile Tyr Ile Ala Leu Gln Asp SerGly Ser Glu Val Asn Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr Ala Leu Gly IleIle Gln Ala Gln Pro Asp Lys Ser Glu Ser Glu Leu Val Asn Gln IleIle Glu Gln Leu Ile Lys Lys Glu Arg Val Tyr Leu Ser Trp Val ProAla His Lys Gly Ile Gly Gly Asn Glu Gln Val Asp Lys Leu Val SerAsn Gly Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Asp Gly Ile Asp Lys Ala GlnGlu Glu His Glu Lys Tyr His Ser Asn Trp Arg Ala Met Ala Ser AspPhe Asn Leu Pro Pro Ile Val Ala Lys Glu Ile Val Ala Ser Cys AspGln Cys Gln Leu Lys Gly Glu Ala Met His Gly Gln Val Asp Cys SerPro Gly Ile Trp Gln Leu Asp Cys Thr His Leu Glu Gly Lys Ile IleLeu Val Ala Val His Val Ala Ser Gly Tyr Ile Glu Ala Glu Val IlePro Ala Glu Thr Gly Gln Glu Thr Ala Tyr Phe Ile Leu Lys Leu AlaGly Arg Trp Pro Val Lys Val Ile His Thr Asp Asn Gly Ser Asn PheThr Ser Ala Ala Val Lys Ala Ala Cys Trp Trp Ala Gly Ile Gln GlnGlu Phe Gly Ile Pro Tyr Asn Pro Gln Ser Gln Gly Val Val Glu SerMet Asn Lys Glu Leu Lys Lys Leu Ile Gly Gln Val Arg Asp Gln AlaGlu His Leu Lys Thr Ala Val Gln Met Ala Val Phe Ile His Asn PheLys Arg Lys Gly Gly Ile Gly Gly Tyr Ser Ala Gly Glu Arg Ile ValAsp Ile Ile Ala Thr Asp Ile Gln Thr Arg Glu Leu Gln Lys Gln IleIle Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asp ProIle Trp Lys Gly Pro Ala Lys Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala ValVal Ile Gln Asp Asn Ser Asp Ile Lys Val Val Pro Arg Arg Lys AlaLys Ile Ile Lys Asp Tyr Gly Lys Gln Met Ala Gly Ala Asp Cys ValAla Gly Arg Gln Asp Glu AspEnv氨基酸序列如下SEQ ID NO6Met Arg Val Arg Gly Thr Arg Arg Asn Tyr Gln Gln Trp Trp Ile TrpGly Val Leu Gly Phe Trp Met Leu Met Ile Cys Asn Val Glu Gly AsnLeu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala LysThr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Thr Glu ValHis Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn ProGln Glu Ile Val Met Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp AsnAsn Asp Met Val Asn Gln Met His Glu Asp Val Ile Ser Leu Trp AspGln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr LeuGlu Cys Arg Asn Val Ser Ser Asn Gly Asn Gly Thr Arg Asn Glu ThrTyr Asn Glu Ser Val Lys Glu Val Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ala ThrThr Leu Leu Arg Asp Arg Lys Lys Thr Val Tyr Ala Leu Phe Tyr ArgLeu Asp Ile Ala Pro Leu Asn Asp Glu Asn Ser Gly Lys Asn Ser SerGlu Tyr Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Asn Thr Ser Ala Ile Thr Gln AlaCys Pro Lys Val Thr Phe Asp Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Thr ProAla Gly Tyr Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asp Lys Ile Phe Asn Gly ThrGly Gln Cys His Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile LysPro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu ArgGlu Ile Ile Ile Arg Ser Glu Asn Leu Thr Asn Asn Val Lys Thr IleIle Val His Leu Asn Lys Ser Val Glu Ile Val Cys Thr Arg Pro AsnAsn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe TyrAla Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Asn IleSer Lys Asp Lys Trp Asp Glu Thr Leu Gln Arg Val Ser Lys Lys LeuAla Glu His Phe Pro Asn Lys Thr Ile Lys Phe Ala Ser Ser Ser GlyGly Asp Leu Glu Ile Thr Thr His Ser Phe Asn Cys Arg Gly Glu Phe
Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Gly Leu Phe Asn Gly Thr Tyr Asn Gly ThrLys Asp Asn Ser Ser Ser Ile Ile Thr Ile Pro Cys Arg Ile Lys GlnIle Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Arg Ala Met Tyr Ala Pro ProIle Glu Gly Asn Ile Thr Cys Lys Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu LeuVal Arg Asp Gly Gly Arg Thr Glu Ser Asn Asp Thr Glu Ile Phe ArgPro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asn Asn Trp Arg Asn Glu Leu Tyr LysTyr Lys Val Val Glu Ile Lys Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Ala AlaLys Arg Arg Val Val Glu Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly Leu Gly AlaVal Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala AlaSer Ile Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile ValGln Gln Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His MetLeu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Thr Arg Val LeuAla Ile Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp GlyCys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ser SerTrp Ser Asn Lys Ser Gln Gln Glu Ile Trp Asp Asn Met Thr Trp MetGln Trp Asp Lys Glu Ile Ser Asn Tyr Thr Asn Thr Ile Tyr Arg LeuLeu Glu Asp Ser Gln Asn Gln Gln Glu Arg Asn Glu Lys Asp Leu LeuAla Leu Asp Ser Trp Lys Asn Leu Trp Ser Trp Phe Asp Ile Thr AsnTrp Leu Trp Tyr Ile Lys Ile Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu IleGly Ser Arg Ile Ile Phe Ala Val Leu Ser Ile Val Asn Arg Val ArgGln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln Ile Pro Thr Pro Asn Pro GlyGly Pro Gly Arg Leu Gly Arg Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Gln AspLys Thr Arg Ser Ile Arg Leu Val Asn Gly Phe Leu Ala Leu Ala TrpAsp Asp Leu Arg Asn Leu Cys Leu Phe Ser Tyr His Arg Leu Ser AspPhe Ile Leu Leu Thr Ala Arg Gly Val Glu Leu Leu Gly Arg Asn SerLeu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Trp Glu Ala Leu Lys Tyr Leu Gly AsnLeu Val Gln Tyr Trp Gly Leu Glu Leu Lys Lys Ser Thr Ile Ser LeuVal Asp Thr Ile Ala Ile Val Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Ile IleAsn Ile Val Gln Gly Ile Cys Arg Ala Ile His Asn Val Pro Arg ArgIle Arg Gln Gly Leu Glu Ala Ala Leu Gln選擇的HIV-1中國流行株gagpol基因序列如SEQ ID NO7ATGGGTGCGAGAGCGTCAATATTAAGAGGGGGAAAATTAGATAAATGGGAAAAAATTAGGTTAAGGCCAGGGGGAAAAAAACACTATATGCTAAAACACCTAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTGGAAAGATTTGCACTTAACCCTGGCCTTTTAGAGACATCAGAAGGCTGTAAGCAAATAATAAAACAGCTACAACCAGCTCTTCAGACAGGAACAGAGGAACTTAGATCATTATTCAACACAGTAGCAACTCTCTATTGTGTACATGAAGAGATAGAAGTACGAGACACCAAAGAAGCCTTAGACAAGATAGAGGAAGAACAAAATAAAATTCAGCAAAAAACACAGCAGGCAAAAAAAGCTGACGAGAAGGTCAGTCAAAATTATCCTATAGTGCAGAATCCCCAAGGGCAAATGGTACATCAGCCCCTATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTGGAAGAGAAGGCTTTTAGCCCAGAAGTAATACCCATGTTCACAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGTTAAATACAGTAGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGATACCATCAATGAAGAGGCTGCAGAATGGGATAGATTGCATCCAGTGCATGCAGGGCCAGTGGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTAGTCTTCAGGAGCAAATAGGATGGATGACAAATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAAACAAGGGCCAAAGGAACCCTTTAGAGACTATGTAGACCGGTTCTTTAAAACTTTAAGAGCTGAACAAGCTACACAAGATGTAAAAAATTGGATGACAGACACCTTGTTAGTCCAAAATGCGAACCCAGATTGTAAGACCATTTTAAGAGCATTAGGATCAGGGGCTTCATTAGAAGAAATGATGACAGCATGTCAGGGAGTAGGAGGACCTAGCCACAAAGCAAGAGTGTTGGCTGAGGCAATGAGCCAAACAAGCAATACCATACTGATGCAGAGAAGCAATTTTAAAGGCTCTAAAAGAATTGTTAAATGTTTCAACTGTGGCAAGGAAGGGCACATAGCCAAAAATTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAAGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAAGACTGTACTGAAAGGCAGGCGAATTTTTTAGGGAAATTTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTCCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGCAGAGAGCTTCAGGTTCGAGGAGACAACCCCAGCTCC
GAAGCAGGAACCGAAAGACAGGGAACCCTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTTGTCTCAATAAAAGTAGGGGGCCAGATAAAAGAGGCTCTCTTAGACACCGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAGTAAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGAGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAATATGAGCAAATACCTATAGAAATTTGTGGAAAAAAGGCTATAGGTACAGTATTAGTGGGACCCACACCTGTCAACATAATAGGAAGAAATATGTTGACCCAGCTTGGATGCACACTAAATTTTCCAATCAGTCCCATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAGGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAACAGCAATTTGTGATGAAATGGAGAAGGAAGGAAAAATTACAAAAATTGGGCCTGACAATCCATATAACACTCCAATATTTGCCATAAGAAAGAAGGACAGTAGTAAGTGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGGGAACTCAATAAAAGAACTCAAGATTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACACCCAGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTTCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTATACTGCATTTACCATACCTAGTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTGCTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCTTTTAGAAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGACTTGTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAACAAAAATAGAGGAACTGAGAGAACATCTGTTAAAGTGGGGATTTACCACACCAGACAAGAAACATCAGAAAGAACCTCCATTTCTTTGGATGGGGTATGAACTCCATCCTGACAAATGGACAGTACAGCCTATACAGCTGCCAGAAAAGGATAGCTGGACTGTCAATGATATACAGAAGTTAGTGGGAAAATTAAACTGGGCAAGTCAGATTTACCCAGGAATTAAAGTAAGGCAACTTTGTAAACTCCTTAGGGGGGCCAAAGCACTAACAGACATAGTACCACTAACTGAAGAAGCAGAATTAGAATTAGCGGAAAACAGGGAAATTTTAAAAGAACCAGTACATGGAGCATATTATGACCCATCAAAAGAATTGATAGCTGAAATACAGAAACAGGGGCAGGACCAATGGACATATCAAATTTACCAAGAACCATTCAAAAATCTGAAAACAGGGAAGTATGCAAAAATGAGGACTGCCCACACTAATGATGTAAAACAGTTAACAGAGGCTGTGCAGAAAATAGCCATGGAAAGCATAGTAATATGGGGAAAGATTCCTAAATTTAGATTACCAATCCAAAAAGAAACATGGGAGACATGGTGGACAGACTATTGGCAAGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGAATTTGTTAATACCCCTCCCTTAGTAAAATTATGGTACCAACTGGAGAAAGATCCCATAGCAGGAGTAGAAACTTTCTATGTAGATGGAGCAGCTAATAGGGAGACTAAAATAGGGAAAGCAGGGTATGTTACTGACAGAGGAAGGAAGAAAATTGTTTCCCTAACTGACACAACAAATCAGAAGACTGAATTGCAAGCAATTTATATAGCTTTGCAAGATTCAGGATCAGAAGTAAACATAGTAACAGATTCACAGTATGCATTAGGGATCATTCAAGCACAACCAGATAAGAGTGAATCAGAGTTAGTTAACCAAATAATAGAACAATTAATAAAAAAGGAAAGGGTCTACCTGTCATGGGTACCAGCACATAAAGGAATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGTAAGTAATGGAATCAGGAAAGTGCTATTTCTAGATGGAATAGATAAAGCTCAAGAAGAGCATGAAAAGTATCACAGCAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGACTTTAATCTGCCACCCATAGTAGCAAAAGAAATAGTAGCTAGCTGTGATCAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGCCATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGGATATGGCAATTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAATCATTCTGGTAGCAGTCCATGTAGCCAGTGGCTACATAGAAGCAGAGGTTATCCCAGCAGAAACAGGACAAGAAACAGCATACTTTATACTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTCAAAGTAATACATACAGACAATGGTAGTAATTTCACCAGTGCTGCAGTTAAGGCAGCCTGTTGGTGGGCAGGTATCCAACAGGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAGGGAGTAGTAGAATCCATGAATAAGGAATTAAAGAAACTTATAGGGCAGGTAAGAGATCAAGCTGAGCACCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAGAGAATTACAAAAACAAATTATAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGAGACAGCAGAGACCCCATTTGGAAAGGACCAGCCAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAGGTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAAATCATTAAGGACTATGGAAAACAGATGGCAGGTGCTGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAAGATTAG選擇的HIV-1中國流行株env基因序列如SEQ ID NO8
ATGAGAGTGAGGGGGACACGGAGGAATTATCAACAATGGTGGATATGGGGCGTCTTGGGCTTTTGGATGTTAATGATTTGTAATGTGGAAGGAAACTTGTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGTGGAAAGAAGCAAAAACTACTCTATTCTGTGCGTCAGATGCTAAAGCATATGAGACAGAAGTGCATAATGTCTGGGCTACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCCAACCCACAAGAAATAGTTATGGAAAATGTAACAGAAAATTTTAACATGTGGAACAATGATATGGTGAATCAGATGCATGAGGATGTAATCAGTTTATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAAGTTGACCCCACTCTGTGTCACTTTAGAATGTAGAAATGTTAGCAGTAATGGTAATGGTACCCGCAATGAGACCTACAATGAGAGCGTGAAGGAGGTAAAAAATTGCTCTTTCAATGCAACCACATTATTAAGAGATAGGAAGAAGACAGTGTATGCCCTTTTTTATAGACTTGATATAGCACCCCTTAATGATGAGAACTCTGGTAAGAACTCTAGTGAGTATTATAGATTAATAAATTGTAATACCTCAGCCATAACACAAGCCTGTCCAAAGGTCACTTTTGATCCAATTCCTATACACTATTGCACTCCAGCTGGTTATGCGATTCTAAAGTGTAATGATAAGATATTCAATGGGACAGGACAATGCCATAATGTTAGCACGGTACAATGTACACATGGAATTAAGCCAGTGGTATCAACTCAACTACTGTTAAATGGTAGCCTAGCAGAAAGAGAGATAATAATTAGATCTGAAAATCTGACAAACAATGTCAAAACAATAATAGTACATCTTAATAAATCTGTAGAAATTGTATGTACAAGACCCAACAATAATACAAGAAAAAGTATAAGGATAGGACCAGGACAAACATTCTATGCAACAGGAGACATCATAGGAGACATAAGACAAGCACATTGTAACATTAGTAAAGATAAATGGGATGAAACTTTACAGAGGGTAAGTAAAAAATTAGCAGAACACTTCCCTAATAAAACAATAAAATTTGCATCATCCTCAGGAGGGGACCTAGAAATTACAACACATAGCTTTAATTGTAGAGGAGAATTTTTCTATTGTAATACATCAGGCCTGTTTAATGGTACATACAATGGTACAAAAGATAATTCAAGCTCAATCATCACAATCCCATGCAGAATAAAGCAAATTATAAACATGTGGCAGGAGGTAGGACGAGCAATGTATGCCCCTCCCATTGAAGGAAACATAACATGTAAATCAAATATCACAGGACTACTATTGGTACGTGATGGAGGAAGAACAGAGTCAAATGATACAGAGATATTCAGACCTGGTGGAGGAGATATGAGAAACAATTGGAGAAATGAATTATATAAATATAAAGTGGTAGAAATTAAGCCATTGGGAGTAGCACCCACTGCAGCAAAAAGGAGAGTGGTGGAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGACTAGGAGCTGTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCGGCGTCAATAACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTGTTGTCTGGTATAGTGCAACAGCAAAGCAATTTGCTGAGAGCTATAGAGGCGCAACAGCATATGTTGCAACTCACGGTCTGGGGCATTAAGCAGCTACAGACAAGAGTCCTGGCTATAGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTAGGGATTTGGGGCTGCTCTGGAAAACTTATCTGCACTACTGCTGTACCTTGGAACTCCAGTTGGAGTAACAAATCTCAACAAGAGATTTGGGATAACATGACCTGGATGCAGTGGGATAAGGAAATTAGTAATTACACAAACACAATATACAGGTTGCTTGAAGACTCGCAAAACCAGCAGGAAAGAAATGAAAAAGATTTATTAGCATTGGACAGTTGGAAAAATCTATGGAGTTGGTTTGACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAAATATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGATAGGTTCAAGAATAATTTTTGCTGTGCTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATACTCACCTTTGTCGTTTCAGATCCCTACCCCGAACCCAGGGGGACCAGGCAGGCTCGGAAGAATCGAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAAAACCAGATCCATTCGATTAGTGAACGGGTTCTTAGCACTTGCCTGGGACGACCTACGGAACCTGTGCCTCTTCAGTTACCACCGCTTGAGTGACTTCATATTACTGACAGCGAGAGGGGTGGAACTTCTGGGACGCAACAGCCTCAGGGGACTACAGAGGGGGTGGGAAGCCCTTAAATATCTGGGAAATCTTGTGCAGTATTGGGGTCTGGAGCTAAAAAAGAGTACTATTAGTCTGGTTGATACCATAGCAATAGTAGTAGCTGAAGGAACAGATAGGATTATAAACATAGTACAAGGAATTTGTAGAGCTATCCACAACGTACCTAGAAGAATAAGACAGGGCCTTGAAGCAGCTTTGCAATAA
權(quán)利要求
1.一種含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列，所述轉(zhuǎn)錄單位編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白序列，該人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白序列是具有免疫原性的人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)抗原，其中轉(zhuǎn)錄單位指導(dǎo)該抗原的合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列，所含有的轉(zhuǎn)錄單位編碼的是人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重組型的結(jié)構(gòu)蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列，其轉(zhuǎn)錄單位所編碼的結(jié)構(gòu)蛋白包括人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白Gag、編碼酶類蛋白Pol和外膜蛋白Env。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列，其中編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Pol和Env的核苷酸序列來源于經(jīng)過人工修飾的編碼野生型中國流行株人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重組型的結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列，其編碼Gag和Pol的核苷酸序列為SEQ ID NO2，編碼Env的核苷酸序列為SEQ ID NO3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列是脫氧核糖核酸DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列，其中包含兩個巨細胞病毒早期啟動子CMV，一個控制GagPol蛋白的表達，另一個控制Env蛋白的表達，它含有由原核啟動子驅(qū)動的抗卡那霉素基因和用于擴增DNA質(zhì)粒所需的原核細胞高拷貝因子，含有內(nèi)含子A和牛生長激素多聚腺苷酸加尾終止信號(BGH polyA)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列，其核苷酸序列如SEQID NO1所述。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列，其所編碼的人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Pol、Env的氨基酸序列分別如SEQ ID NO4、SEQID NO5、SEQ ID NO6所述。
9.一種組合物，其中含有如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列和一種可藥用的載體。
10.一種抗原，由如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的人工合成的核酸序列表達產(chǎn)生，該表達產(chǎn)生的是人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Pol和Env。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防艾滋病的核酸疫苗，所述疫苗為含有編碼人類免疫缺陷病毒－1(HIV－1)結(jié)構(gòu)蛋白的經(jīng)過人工修飾的Gag、Pol和Env核苷酸序列的重組核酸。這些疫苗在體內(nèi)施用時用作病毒蛋白抗原生物合成的轉(zhuǎn)錄單位。本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果(1)改進DNA疫苗生產(chǎn)工藝，力圖擴大DNA疫苗產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本；(2)為確保安全性，我們在動物模型上進行了該DNA疫苗在多種器官和組織的分布，持續(xù)時間和整合試驗，結(jié)果顯示沒有任何可檢測到的整合的跡象；(3)疫苗靶抗原包括了幾乎所有的HIV－1結(jié)構(gòu)蛋白，如GagPol和Env，更好的誘導(dǎo)人體產(chǎn)生對HIV有效的免疫保護。
文檔編號A61P31/00GK1631441SQ200410011250
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月24日
發(fā)明者孔維, 于曉方, 田春娟, 劉濱東 申請人:長春百克藥業(yè)有限責(zé)任公司