一種質(zhì)粒dna規(guī)?；兓椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種質(zhì)粒DNA規(guī)?；兓椒?。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA疫苗，又稱核酸疫苗或基因疫苗，是指把攜帶編碼外源抗原基因的DNA(通常是質(zhì)粒)直接導(dǎo)入體內(nèi)，通過抗原基因表達產(chǎn)物刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)以達到預(yù)防和治療的目的。近年來，DNA免疫被譽為疫苗技術(shù)領(lǐng)域一場新的革命，并在許多動物模型中被證明能夠提供免疫保護力抵抗人類免疫缺陷病毒(HIV)、結(jié)核分枝桿菌、禽流感等傳染性病原體的攻擊。但質(zhì)粒DNA在靶細(xì)胞中的基因表達效率低、持續(xù)時間短，因而其用藥劑量大，這使質(zhì)粒DNA作為生物制劑產(chǎn)品的生產(chǎn)面臨著新的挑戰(zhàn)。目前需要建立的大規(guī)模生產(chǎn)過程，可生產(chǎn)毫克級到千克級產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA，除了數(shù)量上的要求，對質(zhì)粒DNA制品的純度要求也很高，因而分離、純化是生產(chǎn)過程質(zhì)粒DNA的重大挑戰(zhàn)。
[0003]在實驗室的條件下，質(zhì)粒DNA產(chǎn)量通常較低，且提取和制備的質(zhì)粒DNA損失嚴(yán)重。質(zhì)粒的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)除了要除去雜質(zhì)之外，還應(yīng)該避免使用有毒，有機、易燃試劑和動物源性的酶試劑。
[0004]目前廣泛使用規(guī)模化純化質(zhì)粒DNA色譜法產(chǎn)率低，成本高，效率低下。主要原因是目前市場上的商品化的填料主要是針對蛋白，但是質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)與蛋白差異較大，所以導(dǎo)致質(zhì)粒不能進入大多數(shù)的填料孔徑內(nèi)，這就會導(dǎo)致填料對質(zhì)粒的吸附性能下降，這是色譜法生產(chǎn)質(zhì)粒的主要缺點。其次色譜法純化質(zhì)粒DNA需多步驟，首先離子交換層析，疏水層析，最后凝膠層析。設(shè)備投入大，處理量有限，損失大。
[0005]當(dāng)前質(zhì)粒DNA的純化工藝有產(chǎn)量低、成本高的缺點，因此設(shè)計和開發(fā)新型質(zhì)粒生產(chǎn)方法有重要的意義。中空纖維膜過濾技術(shù)屬于切向流過濾技術(shù)(Tangential FlowFiltrat1n, TFF)的范疇，又稱錯流過濾(Cross-Flow Filtrat1n，CFF):料液以一定的流速在膜的上表面循環(huán)，小于膜孔徑的物質(zhì)可以透過膜到透過端，而大于膜孔徑的物質(zhì)會被膜截留，從而實現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的濃縮以及不同物質(zhì)的分級分離。中空纖維膜具有纖維管狀的開放式流道結(jié)構(gòu)，無篩網(wǎng)的管狀流道結(jié)構(gòu)避免了料液的無規(guī)則劇烈湍流，因此具有低的剪切力，溫和的操作可以有效防止質(zhì)粒DNA的斷裂和雜質(zhì)蛋白的聚集，有利于保護質(zhì)粒DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)，同時有助于雜蛋白的透過和去除。目前，對于質(zhì)粒DNA的中空纖維純化及濃縮工藝尚無報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種質(zhì)粒DNA規(guī)?；兓椒ǎ越鉀Q現(xiàn)有技術(shù)的質(zhì)粒DNA純化方法不易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的技術(shù)問題。
[0007]本發(fā)明解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的質(zhì)粒DNA純化方法工藝過于復(fù)雜。
[0008]本發(fā)明解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的質(zhì)粒DNA純化方法成本較高。
[0009]本發(fā)明解決的又一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的質(zhì)粒DNA純化方法收率較低。
[0010]為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0011]一種質(zhì)粒DNA疫苗純化方法，該方法通過澄清純化系統(tǒng)和濃縮系統(tǒng)來實現(xiàn)，在實施該方法之前所述澄清純化系統(tǒng)和濃縮系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)滿足以下條件:
[0012]I系統(tǒng)的組裝
[0013]無菌條件下，將澄清純化系統(tǒng)和濃縮系統(tǒng)按照組裝要求進行組裝。在澄清系統(tǒng)中可安裝無菌0.22 μπι、0.45 μ??或0.65 μπκ完整無損的中空纖維微濾膜，在濃縮系統(tǒng)中可安裝安裝無菌100KD或300KD、完整無損的中空纖維超濾膜。
[0014]2系統(tǒng)完整性檢測
[0015]壓力保持法檢測系統(tǒng)的完整性。
[0016]3系統(tǒng)的處理
[0017]3.1清洗及滅菌
[0018]將0.5Μ NaOH溶液注滿系統(tǒng)的進料罐，浸泡處理20min，開啟循環(huán)栗300rpm，進行系統(tǒng)的清洗及滅菌處理30min。
[0019]3.2水洗及通量檢測
[0020]滅菌結(jié)束后，排盡系統(tǒng)內(nèi)的NaOH溶液。將無菌超純水注滿系統(tǒng)的進料罐，開啟循環(huán)栗，300rpm循環(huán)30min，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的液體，如此反復(fù)水洗，直至系統(tǒng)內(nèi)PH為7.0左右。
[0021]3.3 PBS 處理
[0022]水洗結(jié)束后，棄盡最后一次超純水。將0.0lM PBS溶液注滿進料罐，開啟循環(huán)栗300rpm循環(huán)沖洗20min。
[0023]上述所述技術(shù)方案中，步驟3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、滅菌作用，也可選用50%?80%的酒精溶液，或采用蒸汽滅菌的方式進行系統(tǒng)滅菌。
[0024]—種質(zhì)粒DNA規(guī)?；兓椒?，包括以下步驟:
[0025]I)將氯化鈣加入質(zhì)粒DNA的裂解液中，使終濃度為0.2?2mol/L，過夜沉淀后，用50?500目紗網(wǎng)過濾裂解液，然后再用10?100 μ m囊式濾器過濾裂解液；
[0026]2)將步驟I)過濾后裂解液注入澄清純化系統(tǒng)的進料罐中，開啟循環(huán)栗循環(huán)，而后經(jīng)0.22?0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾，收集透過液待用；
[0027]3)以l:2(v/v)的比例將無菌的0.0lM PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)栗循環(huán)，收集透過液，得到第一洗濾液待用；
[0028]4)以l:2(v/v)的比例將無菌的0.0lM PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)栗循環(huán)，收集透過液，得到第二洗濾液待用；
[0029]5)以l:2(v/v)的比例將無菌的0.0lM PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)栗循環(huán)，收集透過液，得到第三洗濾液待用；
[0030]6)將步驟2)所述透過液、步驟3)所述第一洗濾液、步驟4)所述第二洗濾液、步驟5)所述第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0031]7)將步驟6)得到的混合液注入濃縮系統(tǒng)的進料罐，開啟循環(huán)栗循環(huán)，而后經(jīng)100?500KD中空纖維超濾柱超濾，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為初級質(zhì)粒DNA裂解液；
[0032]8)以1:1 (v/v)的比例將0.0lM PBS注入進料罐中的初級質(zhì)粒DNA裂解液中，重懸，開啟循環(huán)栗循環(huán)，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為二級質(zhì)粒DNA裂解液；
[0033]9)以1:1 (v/v)的比例將0.0lM PBS注入進料罐中的二級質(zhì)粒DNA裂解液中，重懸，開啟循環(huán)栗循環(huán)，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為三級質(zhì)粒DNA裂解液；
[0034]10)以1:1 (v/v)的比例將0.0lM PBS注入進料罐中的三級質(zhì)粒DNA裂解液中，重懸，開啟循環(huán)栗，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為質(zhì)粒DNA裂解液濃縮液；
[0035]11)在步驟10)得到的DNA裂解液濃縮液中加入終濃度0.5?2 % (W/V)的TritonX-114，渦旋振蕩后置于冰浴中10?40min ；
[0036]12)將步驟11)處理后裂解液注入澄清純化系統(tǒng)的進料罐中，開啟循環(huán)栗循環(huán)，而后經(jīng)0.1?0.45 μ m中空纖維微濾柱微濾，收集透過液待用；
[0037]13)將步驟12)得到的透過液注入濃縮系統(tǒng)的進料罐，并注入4倍體積的0.0lMPBS，開啟循環(huán)栗循環(huán)，經(jīng)100?500KD中空纖維超濾柱超濾，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為初級質(zhì)粒DNA純化液；
[0038]14)以2:1 (v/v)的比例將0.0lM PBS注入進料罐中的初級質(zhì)粒DNA裂解液中，重懸，開啟循環(huán)栗循環(huán)，而后棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為二級質(zhì)粒DNA純化液；
[0039]15)以2:1 (v/v)的比例將0.0lM PBS注入進料罐中的二級質(zhì)粒DNA裂解液中，重懸，開啟循環(huán)栗循環(huán)，而后棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為三級質(zhì)粒DNA純化液；
[0040]16)以2:1 (v/v)的比例將0.0lM PBS注入進料罐中的三級質(zhì)粒DNA裂解液中，重懸，開啟循環(huán)栗循環(huán)，而后棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為質(zhì)粒DNA純化液；
[0041]17)將步驟16)得到質(zhì)粒DNA純化液，用0.22 μ m囊式濾器過濾除菌，得到純化的質(zhì)粒DNA成品。
[0042]優(yōu)選的，步驟I)所述的加入的氯化鈣，使終濃度為2mol/L。
[0043]優(yōu)選的，步驟I)所述的紗網(wǎng)孔徑為200