專利名稱：藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體地涉及藥物組合物及其用途。更具體地，本發(fā)明提供了藥物組合物、藥物組合物在制備藥物中的用途、制備藥物的方法、藥物以及對(duì)藥物組合物或藥物進(jìn)行檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
尖銳濕疣(CA)又稱為性病疣、生殖器疣或肛門生殖器疣，是一種人乳頭瘤病毒(HPV)感染引起的主要發(fā)生在男女性外生殖器和肛門部位皮膚粘膜的疾病。這種疣表現(xiàn)為與眾不同的乳頭狀或雞冠樣腫瘤，而且有積累和多發(fā)的傾向。尖銳濕疣的發(fā)病率高，患者人 數(shù)也在迅速增加，此病發(fā)病率現(xiàn)居我國(guó)性傳播疾病的第二位。目前，CA的治療主要有兩種方式物理治療和藥物治療。物理治療方案主要為CO2激光治療、液氮冷凍治療、高頻電治療或液氮冷凍微波治療。對(duì)于大體積尖銳濕疣或?qū)λ幬锘駽O2激光的治療表現(xiàn)較為頑固且短期內(nèi)反復(fù)發(fā)作的疣體可考慮外科手術(shù)切除，再進(jìn)行藥物治療。對(duì)于小體積疣體患者自己用藥治療方案主要藥物為0.5%足葉草毒素酊(或0. 15%足葉草毒素霜)和5%咪喹莫特(imiquimod)霜。但事實(shí)上，0.5%足葉草毒素酊(或0. 15%足葉草毒素霜)臨床用藥的復(fù)發(fā)率高，對(duì)受損皮膚刺激性強(qiáng)，常伴有灼痛、紅腫、糜爛及壞死等副作用，進(jìn)而有導(dǎo)致局部感染的風(fēng)險(xiǎn)，另外此藥有致畸作用。5%咪喹莫特霜治療尖銳濕疣的疣體清除率平均僅為56%，同時(shí)伴有較強(qiáng)局部刺激作用。物理療法優(yōu)點(diǎn)為去疣效果快速明顯，但缺點(diǎn)是復(fù)發(fā)率高，疼痛明顯，皮下組織疏松部位治療后可至明顯水腫。作為女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，宮頸癌的發(fā)生與人類乳頭瘤病毒(HPV)感染密切相關(guān)。HPV感染生殖道是一個(gè)長(zhǎng)期的過程，可潛伏在細(xì)胞內(nèi)若干年，一旦機(jī)體免疫力降低，潛伏的病毒可恢復(fù)活力。HPV感染過程通常分為潛伏感染期、亞臨床感染期、臨床癥狀期和HPV相關(guān)的腫瘤期。宮頸感染高危HPV (HR HPV)，各亞型產(chǎn)生E6、E7兩種癌蛋白，可與宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(抑癌蛋白如P53、RB等)相結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞周期控制失常，造成細(xì)胞增殖異常，異形性變，發(fā)展為CIN(宮頸癌前病變或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變的簡(jiǎn)稱)。根據(jù)嚴(yán)重程度CIN分成三級(jí)宮頸上皮內(nèi)輕、中、高度瘤變，即CINI、CINII、CINIII，由這些癌前病變進(jìn)一步發(fā)展為原位癌和浸潤(rùn)癌。目前認(rèn)為，從CIN發(fā)展到宮頸癌，是一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間(大約10年)連續(xù)發(fā)展的過程。對(duì)CIN的早期篩查和合理干預(yù)，清除女性生殖道HPV持續(xù)感染，阻斷CIN的形成，是有效降低宮頸癌發(fā)病率的關(guān)鍵。人類是HPV的唯一宿主，因而無法在體外和動(dòng)物模型中進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，這使得預(yù)防或治療HPV感染的藥物研發(fā)受到極大限制，造成在全世界范圍內(nèi)尚無療效確切的預(yù)防和治療HPV感染的藥物，因此所謂治療主要是針對(duì)由HPV引起的宮頸或外生殖器的局部病變。宮頸癌前病變由于病位特殊，目前臨床上以局部治療為主?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療主要采用物理治療和手術(shù)治療，物理療法包括激光、冷凍、紅外線、微波、電灼和聚焦超聲等，但治療后常出現(xiàn)陰道分泌物增多、水樣排液及陰道不規(guī)則出血，還可能引起宮頸管狹窄、黏連甚至不孕等副作用，宮頸錐切術(shù)、宮頸廣泛切除、子宮全切除等手術(shù)治療病灶消除快，但手術(shù)切除對(duì)人體的創(chuàng)傷重，痛苦大，治療費(fèi)用高，且存在易感染，易復(fù)發(fā)，對(duì)病變時(shí)間較長(zhǎng)的患者治愈率偏低，CIN復(fù)發(fā)在治療后平均2. 5年之內(nèi)。
另外HPV感染還能引起的疾病有宮頸糜爛，女陰上皮內(nèi)瘤變，疣病，如扁平疣、尋常疣、掌跖疣、尖銳濕疣和免疫功能低下引起的傳染性軟疣，以及皮膚癌前病變?nèi)缃腔ち?、日光性角化病、溢脂性角化病等。目前?duì)治療由HPV感染引起的宮頸疾病、女陰上皮內(nèi)瘤變、疣病及皮膚癌前病變的藥物，仍有待進(jìn)一步研究和改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的近幾十年來，利用中醫(yī)藥治療女性生殖道HPV感染取得了一定的成效，但使用的大多是多味中藥組成的復(fù)方，成分復(fù)雜，目前仍沒有成分簡(jiǎn)單、療效確切的藥物組合物應(yīng)用于臨床來預(yù)防或治療HPV感染以及其誘發(fā)的良性或惡性病變，特別是針對(duì)致濕疣的低危型HPV感染，以及致宮頸癌前病變及宮頸癌的高危型HPV感染。中藥金蕎麥微辛、澀、涼，歸肺經(jīng)，主要功效為清熱解毒、排膿祛瘀，可用于肺癰吐膿、肺熱喘咳、乳蛾腫痛等病癥?，F(xiàn)代研究表明，金蕎麥具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗突變等藥理作用。金蕎麥具有抗癌作用的活性成分是一類原花色素縮合性單寧物質(zhì)的混合物(簡(jiǎn)稱金蕎麥c)，其主要由表兒茶素及其二聚體組成，包含表兒茶素、原花色素B2、原花色素Cl等成分。文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)金蕎麥中該類成分的提取指標(biāo)多以其中表兒茶素和原花色素B2的含量為指標(biāo)，方法比較繁瑣，成本較高。吳茱萸辛、苦、熱；有小毒。歸肝、脾、胃、腎經(jīng)。具有散寒、止痛、燥濕助陽等功效，近年來在豐富傳統(tǒng)用藥的基礎(chǔ)上對(duì)吳茱萸現(xiàn)代藥理作用有了深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有殺蟲、抗菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛等作用，對(duì)其抗腫瘤研究開展較晚，但已有研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，并能誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡。吳茱萸主要有效成分為吳茱萸堿、吳茱萸次堿、羥基吳茱萸堿、檸檬苦素、辛弗林、吳茱萸烯等。發(fā)明人在前期對(duì)大量藥材及不同藥物組合初步藥效篩選及綜合評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，對(duì)上述兩種藥材的組合物治療尖銳濕疣和宮頸癌前病變的藥效進(jìn)行了深入研究。發(fā)明人在藥理藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中驚奇的發(fā)現(xiàn)，將金蕎麥吳茱萸這兩味中藥組合而制成的藥物組合物，對(duì)HPV-DNA有明顯的破壞作用，對(duì)HPVE7基因有明顯的抑制作用，可顯著抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的體外增殖，抑制宮頸上皮異型細(xì)胞增生，金蕎麥吳茱萸藥物組合物可用于對(duì)感染人乳頭瘤病毒(HPV)的治療，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)中藥金蕎麥與吳茱萸藥物組合物在制備治療HPV感染的藥物中的應(yīng)用未見報(bào)道。本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。本發(fā)明提供了一種可以有效地用于治療HPV感染的藥物組合物及其用途，該藥物組合物可用于制備治療由HPV感染引起的宮頸疾病如宮頸糜爛、宮頸癌前病變、宮頸癌；由HPV感染引起的女陰上皮內(nèi)瘤變；以及由HPV感染引起的疣病，如扁平疣、尋常疣、掌跖疣、尖銳濕疣和免疫功能低下引起的傳染性軟疣；以及由HPV感染引起的皮膚癌前病變?nèi)缃腔ち觥⑷展庑越腔?、溢脂性角化病的藥物。根?jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該藥物組合物包含金蕎麥提取物和吳茱萸提取物作為活性成分。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選金蕎麥提取物和吳茱萸提取物的重量比例為I 6 1，更優(yōu)選金蕎麥提取物與吳茱萸提取物的重量比例為1.5 4 1，最優(yōu)選金蕎麥提取物與吳茱萸提取物的重量比例為2. 5 I。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該藥物組合物包含金蕎麥和吳茱萸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，按提取物是藥材經(jīng)提取純化得到的換算，優(yōu)選金蕎麥和吳茱萸的重量比例為0.28 1.67 I，更優(yōu)選金蕎麥提取物與吳茱萸提取物的重量比例為0.42 I. 12 1，最優(yōu)選金蕎麥與吳茱萸的重量比例為0.69 I。本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該藥物組合物包括金蕎麥提取物和吳茱萸提取物，其中，所述金蕎麥提取物是醇提取物；所述吳茱萸提取物是醇提取物。利用該藥物組合物，能夠有效地治療HPV感染引起的疾病，能夠?qū)PV感染引起的宮頸糜爛、宮頸癌前病變、宮頸癌、女陰上皮內(nèi)瘤變，扁平疣、尋常疣、掌跖疣、尖銳濕疣和免疫功能低下引起的傳染性軟疣及皮膚癌前病變?nèi)缃腔ち?、日光性角化病、溢?性角化病進(jìn)行有效地治療。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該藥物組合物可以有效地抑制HPV E7基因(在本文中有時(shí)也簡(jiǎn)單稱為“E7基因”)的表達(dá)。并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)利用該藥物組合物還能夠有效用于使宮頸癌前病變細(xì)胞向良性轉(zhuǎn)化。此外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該藥物組合物能夠治療炎癥。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，炎癥的類型并不受特別限制。在本發(fā)明的實(shí)施例中，采用二甲苯處理的小鼠作為炎癥的動(dòng)物模型，證明了本發(fā)明藥物組合物能夠有效治療炎癥。二甲苯處理的小鼠是醫(yī)藥領(lǐng)域中公知認(rèn)可的炎癥的動(dòng)物模型，關(guān)于其應(yīng)用的具體實(shí)例，可以參見湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005年第7卷第3期，31-33頁(yè)(關(guān)于接觸性皮炎)；遼寧中醫(yī)雜志，2010年第37卷增刊，第227-230頁(yè)(關(guān)于宮頸炎)；遼寧中醫(yī)雜志，2009年第36卷第7期，第1193-1194頁(yè)(關(guān)于肺炎)。廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2009年6月，25(3)，第295-298頁(yè)(關(guān)于鼻炎)，在此通過參照將這些文獻(xiàn)并入本文。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的藥物組合物中金蕎麥提取物與吳茱萸提取物優(yōu)選的重量比例為1-6 I,優(yōu)選重量比例為I. 5 4 I,最優(yōu)選重量比例為2. 5 I。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從金蕎麥制備金蕎麥提取物即金蕎麥的醇提取物的方法，并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，金蕎麥提取物是通過下列步驟制備的將金蕎麥進(jìn)行加醇提取，以便獲得金蕎麥提取液；以及將金蕎麥提取液進(jìn)行純化、干燥，以便獲得金蕎麥提取物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將金蕎麥進(jìn)行加醇提取可以進(jìn)一步包括將金蕎麥用8-12倍重量的30-60%乙醇，在50-70攝氏度下回流提取2_3次，每次0. 5-2小時(shí)，并合并提取液，以便獲得金蕎麥提取液，優(yōu)選地，將金蕎麥用8倍重量的50%乙醇，在60攝氏度下回流提取3次，每次I小時(shí)，并合并提取液，以便獲得金蕎麥提取液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將金蕎麥提取液進(jìn)行純化、干燥可以進(jìn)一步包括首先，將金蕎麥提取液進(jìn)行過濾，以便獲得金蕎麥提取液濾液。其次，利用大孔吸附樹脂對(duì)金蕎麥提取液濾液進(jìn)行純化，以便獲得經(jīng)過純化的金蕎麥提取液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，大孔樹脂的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些示例，大孔樹脂可以采用例如D101、DM-130、或者HPD-600大孔樹脂。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，利用非極性大孔吸附樹脂對(duì)金蕎麥提取液濾液進(jìn)行純化，可以進(jìn)一步包括將金蕎麥提取液濾液上樣至DlOl大孔吸附樹脂；使用除雜洗脫劑進(jìn)行除雜；以及使用洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，以便獲得經(jīng)過純化的金蕎麥提取液。其中，所述金蕎麥提取液濾液的上樣濃度為
0.02-0. 20g/ml優(yōu)選0. 08g/ml，其上樣速度為0. 5-4樹脂柱體積/小時(shí)優(yōu)選2樹脂柱體積/小時(shí)；除雜洗脫劑為水，其洗脫流速為3-6樹脂柱體積/小時(shí)優(yōu)選4樹脂柱體積/小時(shí)；洗脫溶劑為60-90%乙醇優(yōu)選70%乙醇，該洗脫溶劑的洗脫速度為1-3樹脂柱體積/小時(shí)優(yōu)選2樹脂柱體積/小時(shí)。然后，將經(jīng)過純化的金蕎麥提取液進(jìn)行減壓濃縮和真空干燥，以便獲得金蕎麥提取物，其中減壓濃縮是在50-60攝氏度下進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，減壓濃縮采用60攝氏度減壓濃縮。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從吳茱萸制備吳茱萸提取物即吳茱萸的醇提取物的方法，并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，吳茱萸提取物是通過下列步驟制備的將所述吳茱萸用8-12倍重量的pH值為2-4的鹽酸乙醇，加熱回流提取2-3次，每次1_2小時(shí)，合并提 取液，獲得吳茱萸提取液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將吳茱萸進(jìn)行加醇提取可以進(jìn)一步包括將吳茱萸用10倍重量的pH值為3的鹽酸乙醇，加熱回流提取3次，每次I. 5小時(shí)，合并提取液，獲得吳茱萸提取液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將吳茱萸提取液進(jìn)行純化、干燥可以進(jìn)一步包括首先，將吳茱萸提取液進(jìn)行過濾，獲得吳茱萸提取液濾液。接下來，利用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂對(duì)吳茱萸提取液濾液進(jìn)行純化，獲得純化后的吳茱萸提取液。最后，將純化后的吳茱萸提取液進(jìn)行干燥。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂對(duì)吳茱萸提取液濾液進(jìn)行純化進(jìn)一步包括首先，將吳茱萸提取物濾液減壓濃縮，濃縮至50°C測(cè)相對(duì)密度為
1.15-1. 25，優(yōu)選為I. 20，調(diào)整濃縮液pH值至2-3，靜置，離心，上清液用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行純化。接著，使用除雜洗脫劑進(jìn)行除雜。接下來，使用洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，以便獲得經(jīng)過純化的吳茱萸提取液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所采用的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂為D001、732型、0011型、或D072，其中優(yōu)選采用732型。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，吳茱萸提取液濾液的上樣流速可以為0. 5-1. 5樹脂柱體積/小時(shí)，優(yōu)選I樹脂柱體積/小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以采用的除雜洗脫劑為水，該洗脫劑的洗脫流速可以為1-3樹脂柱體積/小時(shí)，優(yōu)選2樹脂柱體積/小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以采用的洗脫溶劑為70% -90%乙醇，該洗脫溶劑的洗脫速度可以為1-3樹脂柱體積/小時(shí)，優(yōu)選采用80%乙醇作為洗脫溶劑并且洗脫速度為2樹脂柱體積/小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的輔料，從而可以使得藥物組合物能夠呈現(xiàn)適于給藥的形式。優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物可以呈選自軟膏劑、凝膠劑、栓劑、外用洗劑、片劑、顆粒劑、口服溶液、膠囊劑、內(nèi)服膏劑、氣霧劑或噴霧劑的至少一種的形式，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，其中臨床劑型優(yōu)選為泡騰片、軟膏、栓齊U、凝膠劑。由此，可以方便使得本發(fā)明的藥物組合物適于為對(duì)象進(jìn)行給藥。進(jìn)一步，本發(fā)明的藥物組合物，是以有效量的金蕎麥和吳茱萸為原料，加入藥學(xué)上可接受的輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床可接受的中藥制劑，如軟膏劑、凝膠劑、栓劑、外用洗劑、片劑、顆粒劑、口服溶液、膠囊劑、內(nèi)服膏劑、氣霧劑或噴霧劑。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選金蕎麥和吳茱萸的重量比例為0.28 I. 67 1，更優(yōu)選金蕎麥與吳茱萸的重量比例為0.42 I. 12 1，最優(yōu)選金蕎麥與吳茱萸的重量比例為0. 69 I。進(jìn)一步，本發(fā)明的藥物組合物，是以有效量的金蕎麥提取物和吳茱萸提取物為原料，加入藥學(xué)上可接受的輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床可接受的中藥制劑，如軟膏劑、凝膠劑、栓劑、外用洗劑、片劑、顆粒劑、口服溶液、膠囊劑、內(nèi)服膏劑、氣霧劑或噴霧劑。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選金蕎麥提取物和吳茱萸提取物的重量比例為I 6 1，更優(yōu)選金蕎麥提取物與吳茱萸提取物的重量比例為I. 5 4 1，最優(yōu)選金蕎麥提取物與吳茱萸提取物的重量比例為2. 5 I。具體地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物中的金蕎麥提取物和吳茱萸提取物可以分別由以下方法制備。需要說明的是，在本文中使用的單位“目”，指的是顆粒粒度能夠?qū)崿F(xiàn)通過每平方英寸上具有所限定數(shù)目孔的篩子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地通過公式目數(shù)X孔徑(微米數(shù))=15000，確定篩的孔徑，從而可以確定以微米為單位的顆粒粒度。其中，金蕎麥提取物的制備方法，步驟如下(I)備料將檢測(cè)合格的金蕎麥生藥過40-60目篩粉碎，得金蕎麥粉；(2)提取金蕎麥粉用8-12倍量30% -60%的乙醇，50_70°C回流提取2_3次，每次0. 5-2小時(shí)。提取液合并過濾，60°C減壓濃縮至無醇味，加藥材重量0. 5-1. 5倍量的水溶解后，抽濾，備用；(3)純化濾液用已處理合格的大孔吸附樹脂分離純化，上樣濃度選擇
0.02-0. 20g/ml，上樣流速為0. 5-4樹脂柱體積/小時(shí)，吸附4小時(shí)后，先用4_8樹脂柱體積的水洗脫除雜，洗脫流速為3-6柱體積/小時(shí)，再用60% -90%的乙醇洗脫6-10個(gè)柱體積，洗脫流速為1-3柱體積/小時(shí)，回收乙醇洗脫部分，50-60°C減壓濃縮至干，真空干燥，粉碎，得紅棕色粉末即金蕎麥提取物。其中，在步驟(3)中，大孔樹脂吸附能力的大小除取決于比表面積外，還與吸附質(zhì)的分子量和構(gòu)型有關(guān)，只有當(dāng)孔徑對(duì)于吸附質(zhì)足夠大時(shí)，比表面積才能充分發(fā)揮作用。因此，需要綜合考慮比表面積和孔徑大小不同的大孔樹脂分離效果。有大量不同類型的大孔樹脂可以從市售獲得，從中可以優(yōu)選出適合金蕎麥多酚類物質(zhì)提取純化的特定類型。本發(fā)明人進(jìn)行了艱苦的研究，進(jìn)行對(duì)多種不同型號(hào)大孔樹脂的研究，其中D101、DM-130、HPD-600可以獲得顯著良好的純化效果。吳茱萸提取物的制備方法，步驟如下(I)備料將檢測(cè)合格的吳茱萸生藥粉碎，過40-60目篩，得吳茱萸粉碎料；(2)提取加入?yún)擒镙欠鬯榱峡偭?-12倍量的pH值為2_4的鹽酸乙醇作為提取溶劑，加熱回流提取2-3次，每次1-2小時(shí)，過濾，合并濾液，濃縮至50°C測(cè)相對(duì)密度為
1.15-1. 25，放冷，得濃縮液，調(diào)整濃縮液pH值至2-3，靜置，過濾，備用。(3)純化取與藥液等體積量的樹脂裝柱，徑高比為I : 10，藥液pH值1-3，上樣流速0. 5-1. 5樹脂柱體積/小時(shí)；上樣完畢，吸附1-3小時(shí)，用6-9倍體積水，洗至流出液無顏色，洗脫流速為1-3倍樹脂體積/小時(shí)；收集70% -90%乙醇洗出液至生物堿檢查呈陰性(流出液滴加10%硅鎢酸無沉淀)，洗脫流速為1-3倍樹脂體積/小時(shí)，回收乙醇，減壓濃縮，真空干燥后，粉碎，得棕色粉末。其中，在步驟(3)中，吳茱萸的主要成分是吲哚類生物堿，堿性較弱，可以采用強(qiáng)、酸性陽離子交換樹脂。交聯(lián)度大的離子交換樹脂，交換容量大，但交聯(lián)網(wǎng)孔小，不利于大離子的進(jìn)入；交聯(lián)度小的樹脂，交換容量小，但交聯(lián)網(wǎng)孔大，易于離子的擴(kuò)散和交換，因此，需要綜合考慮交聯(lián)度不同的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的交換能力。有大量不同類型的陽離子交換樹脂可以從市售獲得，從中可以優(yōu)選出適合吳茱萸總生物堿純化的特定類型。本發(fā)明人進(jìn)行了多種強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的研究，型號(hào)為D001、732型、OOll型、D072的樹脂均獲得良好的純化效果。將金蕎麥提 取物和吳茱萸提取物混合，并加入藥學(xué)上可接受的輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床可接受的中藥制劑，如制成軟膏劑、凝膠劑、栓劑、泡騰片、外用洗劑、片劑、顆粒劑、口服溶液、膠囊劑、內(nèi)服膏劑、氣霧劑或噴霧劑。本發(fā)明所述組合物優(yōu)選的制備工藝如下金蕎麥提取物的制備方法，優(yōu)選步驟如下(I)備料將檢測(cè)合格的金蕎麥生藥過50目篩粉碎，得金蕎麥粉；(2)提取金蕎麥粉用8倍量50%的乙醇，60°C回流提取3次，每次I小時(shí)。提取液合并過濾，60°C減壓濃縮至無醇味，加藥材重量I倍量的水溶解后，抽濾，備用；(3)純化濾液用已處理合格的DlOl大孔樹脂分離純化，上樣濃度選擇0. 08g/ml,上樣流速為2樹脂柱體積/小時(shí)，吸附4小時(shí)后，先用6樹脂柱體積的水洗脫除雜，洗脫流速為4樹脂柱體積/小時(shí)，再用70%的乙醇洗脫8樹脂柱體積，洗脫流速為2樹脂柱體積/小時(shí)，回收乙醇洗脫部分，60°C減壓濃縮至干，真空干燥，粉碎，得紅棕色粉末。吳茱萸提取物的制備方法，優(yōu)選步驟如下(I)備料將檢測(cè)合格的吳茱萸生藥粉碎，過50目篩，得吳茱萸粉碎料；(2)提取加入?yún)擒镙欠鬯榱峡偭?0倍量的pH值為3的鹽酸乙醇作為提取溶劑，加熱回流提取3次，每次I. 5小時(shí)，過濾，合并濾液，濃縮至50°C測(cè)相對(duì)密度為I. 20，放冷，得濃縮液，調(diào)整濃縮液PH值至3，靜置，過濾，濾液作為樣品純化備用溶液；(3)純化取與藥液等體積量的732型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂裝柱，徑高比為I 10，藥液pH值2，上樣流速I樹脂體積/小時(shí)；上樣完畢，吸附2小時(shí)，用8倍體積水，洗至流出液無顏色，洗脫流速為2倍樹脂體積/小時(shí)；收集80%乙醇洗出液至生物堿檢查呈陰性(流出液滴加10%硅鎢酸無沉淀)，洗脫流速為2倍樹脂體積/小時(shí)，回收乙醇，減壓濃縮，真空干燥后，粉碎，得棕色粉末。將金蕎麥提取物和吳茱萸提取物混合，并且加入藥學(xué)上可接受的輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床可接受的中藥制劑，如制成軟膏劑、凝膠劑、栓劑、泡騰片、外用洗劑、片劑、顆粒劑、口服溶液、膠囊劑、內(nèi)服膏劑、氣霧劑或噴霧劑。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選金蕎麥提取物和吳茱萸提取物的重量比例為I 6 1，更優(yōu)選金蕎麥提取物與吳茱萸提取物的重量比例為I. 5 4 1，最優(yōu)選金蕎麥提取物與吳茱萸提取物的重量比例為2. 5 I。針對(duì)不同的劑型及適應(yīng)癥，本發(fā)明制劑優(yōu)選的劑型為軟膏劑、栓劑、凝膠劑、泡騰片。本發(fā)明的技術(shù)方案所優(yōu)選的劑型之一為軟膏劑，由金蕎麥提取物和吳茱萸提取物作為活性成分，其他成分為藥用軟膏基質(zhì)輔料。其中輔料可為凡士林、羊毛脂、液體石蠟、石蠟、硬脂酸鎂、蜂蠟、肉豆蘧酸異丙酯等軟膏基質(zhì)。
金蕎麥吳茱萸軟膏的制備方法可以如下取白凡士林、蜂蠟、十八醇、單硬脂酸丙二醇酯置于70°C水浴中熔化，將處方量的金蕎麥提取物和吳茱萸提取物(過100目篩)和肉豆蘧酸異丙酯混合，攪拌均勻，必要時(shí)可置于研缽中研磨均勻，然后緩慢加入其他已熔化好的基質(zhì)中，邊加邊攪拌，待完全均勻后，停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫，即得。在上述金蕎麥吳茱萸組合物制備方法中，以總重量為IOOg計(jì)，優(yōu)選的制備方法包括取白凡士林10 40g、蜂臘5 20g、十八醇0. 5 10g、單硬脂酸丙二醇酯I 5g置于70°C水浴中熔化，將處方量的金蕎麥提取物3. 5 14g (過100目篩)、吳茱萸提取物I. 5g 6g(過100目篩)和肉豆蘧酸異丙酯20 40g混合，攪拌均勻，必要時(shí)可置于研缽中研磨均勻，然后緩慢加入其他已熔化好的基質(zhì)中，邊加邊攪拌，待完全均勻后，停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫，即得。在上述金蕎麥吳茱萸組合物制備方法中，以總重量為IOOg計(jì)，優(yōu)選的制備方法包 括取白凡士林30g、蜂臘10g、十八醇5g、單硬脂酸丙二醇酯5g置于70°C水浴中熔化,將處方量的金蕎麥提取物9g(過100目篩)、吳茱萸提取物4. 5g(過100目篩)和肉豆蘧酸異丙酯35g混合，攪拌均勻，必要時(shí)可置于研缽中研磨均勻，然后緩慢加入其他已熔化好的基質(zhì)中，邊加邊攪拌，待完全均勻后，停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫，即得。以有效量的金蕎麥和吳茱萸提取物作為原料，通過加入藥學(xué)上可接受的輔料，按照常規(guī)工藝，還可以制成其他臨床可接受的中藥制劑，如制成凝膠劑、栓劑、泡騰片、外用洗齊U、片劑、顆粒劑、口服溶液、膠囊劑、內(nèi)服膏劑、氣霧劑或噴霧劑。.發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的由藥材提取得到的藥物復(fù)方制劑，采用了兩味中藥的新型提取方法，得到的提取物有效成分含量高，使得本發(fā)明的制劑易于制備并使制劑質(zhì)量顯著得到提高。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物具有易于實(shí)施、實(shí)施效果好、提取物純度高、制劑制備容易、質(zhì)量可控的特點(diǎn)。藥效學(xué)試驗(yàn)表明根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的藥物組合物對(duì)抗二甲苯所致小鼠耳廓腫脹有顯著性抑制作用，表明其具有顯著抗炎作用，并且組合物的抗炎作用明顯高于單獨(dú)使用其中一種的效果。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的藥物組合物對(duì)HPV-DNA有明顯的破壞作用，無論是單獨(dú)還是組合其抗HPV病毒作用均要強(qiáng)于200 u M阿昔洛韋，其組合相比單獨(dú)一種藥物對(duì)于HPV病毒有更強(qiáng)的殺滅作用。與陽性對(duì)照藥阿昔洛韋相比，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的藥物組合物對(duì)HPVE7癌基因表達(dá)的抑制作用非常明顯，進(jìn)一步表明該組合物可用于治療HPV感染引起的疾病，如宮頸糜爛、宮頸癌前病變、宮頸癌等宮頸疾病；女陰上皮內(nèi)瘤變；如扁平疣、尋常疣、掌跖疣、尖銳濕疣和免疫功能低下引起的傳染性軟疣等疣??；以及如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等皮膚癌前病變的藥物。金蕎麥吳茱萸提取物的組合配比試驗(yàn)顯示，當(dāng)金蕎麥提取物和吳茱萸提取物比例在7 3時(shí)，對(duì)HPVE7基因的抑制作用最為明顯，表明在此配比下對(duì)于治療HPV感染引起的疾病具有最佳療效。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的藥物組合物對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖抑制凋亡作用結(jié)果表明，金蕎麥吳茱萸組合物可顯著抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的體外增殖，且藥物對(duì)細(xì)胞的抑制效應(yīng)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加而增加。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的藥物組合物處理后人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率明顯增高，并且具有明顯的時(shí)間和藥物濃度依賴。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的藥物組合物對(duì)宮頸癌前病變(CIN)小鼠宮頸組織PCNA、EGFR和bcl-2表達(dá)的影響試驗(yàn)表明，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的藥物組合物通過抑制增殖因子PCNA, EGFR和bcl-2的表達(dá)而起到抑制宮頸上皮異型細(xì)胞增生作用，與模型組相比具有顯著差異，提示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的藥物組合物對(duì)于治療宮頸癌前病變的極大潛力。組合物刺激性試驗(yàn)表明，低劑量和正常劑量多次連續(xù)給藥對(duì)家兔完整皮膚和破損皮膚無刺激性，高劑量組對(duì)家兔破損皮膚有輕微刺激性，停藥后刺激反應(yīng)很快消失，表明根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的藥物組合物不會(huì)對(duì)藥物制劑的正常使用造成影響，即使在高劑量下對(duì)家兔皮膚的刺激反應(yīng)是輕微的，可逆的。本發(fā)明進(jìn)行的急性毒性試驗(yàn)表明金蕎麥提取物、吳茱萸提取物及其二者組合物的小鼠灌胃給藥劑量相當(dāng)于成人日正常給藥劑量500倍的條件下，僅出現(xiàn)輕微體征反應(yīng)，而且只持續(xù)了短短兩天后即恢復(fù)正常，解剖主要臟器未見病變，表明該組合藥物使用安全，可以安全有效地治療HPV感染引起的疾病。發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用本發(fā)明方法制備得到的藥物組合物對(duì)于同是由于HPV感染引起的宮頸疾病如宮頸糜爛、宮頸癌前病變、宮頸癌；由HPV感染引起的女陰上皮內(nèi)瘤變；以及由HPV感染引起的疣病，如扁平疣、尋常疣、掌跖疣、尖銳濕疣和免疫功能低下引起的傳染性軟疣；以及由HPV感染引起的皮膚癌前病變?nèi)缃腔ち觥⑷展庑越腔?、溢脂性角化病均具有非常好的療效，安全性高。同時(shí)采用本發(fā)明制備方法得到的藥物有效成分含量高，使得本發(fā)明的制劑易于制備并使制劑的工藝、質(zhì)量可控性大大提高，同時(shí)工藝簡(jiǎn)單，無污染，工業(yè)化可操作性強(qiáng)。本發(fā)明所述的藥物或藥物組合物可單獨(dú)應(yīng)用于患者，還可以與手術(shù)、物理治療聯(lián)合使用。給藥的劑量一般由醫(yī)師根據(jù)患者的具體情況(如年齡、性別、患病時(shí)間、患處病變程度、身體狀況等)確定。需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的金蕎麥提取物和吳茱萸提取物的提取純化工藝是經(jīng)過大量試驗(yàn)摸索得出，尤其是對(duì)可能影響吳茱萸生物堿提取的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行了控制，根據(jù)吳茱萸所含化學(xué)成分，吳茱萸所含生物堿為吲哚類弱堿性生物堿，用酸性醇溶液提高生物堿類物質(zhì)的提取得率，并在酸性水溶條件下除去大部分雜質(zhì)，減少后續(xù)去雜工序，732型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)一步去雜。工藝簡(jiǎn)單易操作，所提取生物堿含量高。由此，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物在制備藥物中的用途，該藥物可以用于抑制HPV E7基因的表達(dá)。此外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的藥物能夠用于治療炎癥。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明的藥物能夠用于治療由HPV感染引起的宮頸疾病、女陰上皮內(nèi)瘤變、疣病以及皮膚癌前病變。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的藥物能夠用于治療或預(yù)防宮頸癌或?qū)m頸癌前病變。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的藥物能夠用于治療或預(yù)防尖銳濕疣。具體地，本發(fā)明的藥物能夠用于由HPV感染引起的，如宮頸糜爛、宮頸癌前病變、宮頸癌等宮頸疾?。挥蒆PV感染引起的女陰上皮內(nèi)瘤變；以及由HPV感染引起的如扁平疣、尋常疣、掌跖疣、尖銳濕疣和免疫功能低下引起的傳染性軟疣等疣??；以及由HPV感染引起的，如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等皮膚癌前病變。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種制備藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括下列步驟制備金蕎麥提取物；制備吳茱萸提取物；以及將金蕎麥提取物和吳茱萸提取物按照預(yù)定的重量比率進(jìn)行混合，以便得到藥物，其中，制備金蕎麥提取物進(jìn)一步包括下列步驟將金蕎麥進(jìn)行加醇提取，以便獲得金蕎麥提取液；以及將金蕎麥提取液進(jìn)行純化、干燥，以便獲得金蕎麥提取物。制備吳茱萸提取物進(jìn)一步包括下列步驟將吳茱萸進(jìn)行加醇提取，以便獲得吳茱萸提取液；以及將吳茱萸提取液進(jìn)行純化、干燥，以便獲得吳茱萸提取物。關(guān)于金蕎麥提取物和吳茱萸提取物的制備方法，前面已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述，不再贅述。利用上述制備藥物的方法所得到的藥物，能夠有效地治療和預(yù)防HPV感染引起的疾病，能夠?qū)Ω腥綡PV的患者進(jìn)行有效地治療。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明制備的藥物可以用于抑制HPV E7基因的表達(dá)。此外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的藥物能夠用于治療炎癥。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明的藥物能夠用于治療由HPV感染引起的宮頸疾病、女陰上皮內(nèi)瘤變、疣病以及皮膚癌前病變。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的藥物能夠用于治療或預(yù)防宮頸癌或?qū)m頸癌前病變。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的藥物能夠用于治療或預(yù)防尖銳濕疣。具體地，本發(fā)明 的藥物能夠用于由HPV感染引起的，如宮頸糜爛、宮頸癌前病變、宮頸癌等宮頸疾病；由HPV感染引起的女陰上皮內(nèi)瘤變；以及由HPV感染引起的如扁平疣、尋常疣、掌跖疣、尖銳濕疣和免疫功能低下引起的傳染性軟疣等疣??；以及由HPV感染引起的，如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等皮膚癌前病變。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種藥物，其是通過上述制備藥物的方法制備的。如前所述，利用該藥物，能夠有效地治療和預(yù)防HPV感染引起的疾病，能夠?qū)Ω腥綡PV的患者進(jìn)行有效地治療。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該藥物還可以有效地抑制E7基因的表達(dá)。此外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該藥物能夠治療炎癥。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種對(duì)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物或藥物進(jìn)行檢測(cè)的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括確定藥物組合物或藥物中的有效成分含量；以及將該有效成分含量與預(yù)定的閾值進(jìn)行比較。在本文中所使用的術(shù)語“有效成分”是指這樣一種化合物，該化合物的含量可以有效地反映藥物組合物或者藥物的有效性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，有效成分為選自表兒茶素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的至少一種。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的對(duì)本發(fā)明的藥物組合物或藥物進(jìn)行檢測(cè)的方法，能夠有效地對(duì)藥物組合物或藥物進(jìn)行檢測(cè)，并且檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在該方法中，針對(duì)金蕎麥提取物，其有效成分為表兒茶素，閾值為至少0. 57mg。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在該方法中，針對(duì)吳茱萸提取物，其有效成分為吳茱萸堿和吳茱萸次堿，閾值為至少4. 7mg。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在該方法中，當(dāng)有效成分為表兒茶素時(shí)，確定藥物組合物或藥物中的有效成分含量可以進(jìn)一步包括將藥物組合物或藥物用由氯仿、甲醇和冰醋酸組成的提取劑進(jìn)行超聲提??；將提取液揮發(fā)干燥，并用甲醇溶解殘?jiān)?，以便獲得含有表兒茶素的甲醇溶液；以及通過高效液相色譜分析，確定該含有表兒茶素的甲醇溶液中的表兒茶素含量。由此，能夠方便有效地確定藥物組合物或藥物中的表兒茶素含量。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在該方法中，當(dāng)有效成分為吳茱萸堿和吳茱萸次堿時(shí)，確定藥物組合物或藥物中的有效成分含量進(jìn)一步包括將藥物組合物或藥物用由氯仿、甲醇和氨水組成的提取劑進(jìn)行超聲提??；將提取液揮發(fā)干燥，并用甲醇溶解殘?jiān)?，以便獲得含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的甲醇溶液；以及通過高效液相色譜分析，確定所述含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的甲醇溶液中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總含量。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的藥物組合物或藥物進(jìn)行檢測(cè)的方法可以包括如下(I)取本藥物組合物制劑0. 5g，加無水乙醇10ml，水浴加熱至熔化，超聲處理30分鐘，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取金蕎麥對(duì)照品2g,加無水乙醇20ml,超聲提取60分鐘，過濾，濾液濃縮至5ml，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品濾液20 u I點(diǎn)于硅膠G薄層板上，吸取10 ii I對(duì)照品溶液點(diǎn)于同一娃膠G薄層板上,經(jīng)展開,取出，晾干。展開劑三氯甲烷-甲醇-乙酸(13 4 2. 5)
顯色劑噴以5%的香草醛-濃硫酸顯色劑，105°C加熱顯色至斑點(diǎn)清晰結(jié)論在供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)。(2)取本藥物組合物制劑0. 5g，加無水乙醇10ml，水浴加熱至熔化，超聲處理30分鐘，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取吳茱萸堿對(duì)照品、吳茱萸次堿對(duì)照品，加無水乙醇分別制成每Iml含0. 2mg和I. 5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品濾液20 U I點(diǎn)于硅膠G薄層板上，吸取IOiU對(duì)照品點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，經(jīng)展開，取出，晾干。展開劑以氯仿甲醇氨水飽和(10 : I : 0. 5)顯色劑置紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)論在供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。(3)表兒茶素的含量測(cè)定分別制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，用高效液相色譜法測(cè)定；對(duì)照品為表兒茶素；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)5 ii m, 250mmX 4. 6mm, Dikma C18色譜柱,流動(dòng)相乙腈-0. I %檸檬酸水溶液(13 87)，流速lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)279nm，柱溫25°C，理論塔板數(shù)按表兒茶素計(jì)算不低于5000，表兒茶素峰與相近峰的分離度R大于I. 5。其中對(duì)照品溶液的制備精密稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24小時(shí)的表兒茶素對(duì)照品適量，加甲醇制成每Iml含241. g的對(duì)照品溶液。其中供試品溶液制備稱取本藥物組合物制劑約0. 2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入25ml (氯仿-甲醇I 5. 5)和0.5ml冰乙酸，密塞，稱定重量，超聲提取45min，放冷，搖勻，再稱定重量，甲醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，取濾液5ml，揮干，殘?jiān)舆m量甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)溶至IOml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0. 22 濾膜，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10iU，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。藥物組合物含金蕎麥以表兒茶素(C15H14O6)計(jì)，每I克不得少于0. 57mg。(4)吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量測(cè)定分別制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，用高效液相色譜法測(cè)定；對(duì)照品為吳茱萸堿、吳茱萸次堿；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以Nucleosil 5C18柱(250mmX 4. 6mm, 5 y m,Phenamenex,USA)為色譜柱,流動(dòng)相乙腈-甲醇-磷酸(73 : 27 : 0. 3),流速lml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)225nm，柱溫為室溫，理論板數(shù)按吳茱萸堿峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000。
其中對(duì)照品溶液制備精密稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24小時(shí)的吳茱萸堿、吳茱萸次堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每Iml含吳茱萸堿129 u g、吳茱萸次堿145 y g的對(duì)照品溶液。其中供試品溶液制備稱取本藥物組合物制劑約0. 2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入25ml氯仿-甲醇(4 I)和0.5ml氨水，密塞，稱定重量，超聲提取45min，放冷，搖勻，再稱定重量，氯仿補(bǔ)足減失的重量，過濾，取濾液5ml，揮干，殘?jiān)舆m量甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)溶至IOml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0. 22 y m濾膜，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10iU，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。藥物組合物含吳茱萸以吳茱萸堿(C19H17N3O)和吳茱萸次堿(C18H13N3O)的總量計(jì)，每I克不得少于4. Img0根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，HPLC (高效液相色譜)方法靈敏度高，準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好，優(yōu)于其他測(cè)定方法，也不同于絕大多數(shù)中藥只對(duì)有效部位群進(jìn)行控制而實(shí)際可控性差的現(xiàn) 狀。為了便于理解，以下將通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I金蕎麥提取工藝過程將金蕎麥生藥粉碎，過50目篩，得金蕎麥粗粉料；取2kg金蕎麥粗粉料加入10倍量(重量比，下同)的50%的乙醇溶液中，60°C加熱回流2次，每次I. 5h，合并濾液，過濾，濾液60°C減壓濃縮至無醇味后，加適量2. Ikg水溶解后，抽濾，備用。取預(yù)處理過的D-IOl大孔樹脂裝柱，藥液上樣流速為2樹脂柱體積/小時(shí)，吸附4小時(shí)，先用6個(gè)柱體積的水洗脫除雜，除雜流速為4樹脂柱體積/小時(shí)，再用70%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，洗脫流速為2樹脂柱體積/小時(shí)，回收乙醇洗脫部分，60°C減壓濃縮至干，真空干燥，粉碎，得180g金蕎麥提取物。實(shí)施例2吳茱萸提取工藝過程將吳茱萸生藥粉碎，過50目篩，得吳茱萸粗粉料df6kg吳茱萸粗粉加入10倍量的pH值為3的鹽酸乙醇(醇濃度為80%)溶液，加熱回流3次，每次I. 5h，過濾，合并濾液，濃縮至50°C測(cè)相對(duì)密度為I. 20，放冷，得濃縮液，調(diào)整濃縮液pH值至2，靜置，離心，得上清液4000ml，備用。取4000ml的732強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，裝柱，徑高比約為I : 10，藥液上柱吸附流速I樹脂柱體積/小時(shí)，上樣完畢，吸附2小時(shí)，用8倍體積水，洗至流出液無顏色，洗脫流速為2樹脂柱體積/小時(shí)；收集80%乙醇洗出液至生物堿檢查呈陰性(流出液滴加10%硅鎢酸無沉淀)，洗脫流速為2樹脂柱體積/小時(shí)，回收乙醇，減壓濃縮，真空干燥后，得吳茱萸提取物150g。以下是具體試驗(yàn)證明本發(fā)明藥物組合物效果的實(shí)施例實(shí)施例3比較本發(fā)明藥物組合物與兩種藥物成分單獨(dú)使用時(shí)的抗炎效果—、動(dòng)物及材料(一)動(dòng)物
I、種屬昆明小鼠，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)19-013 ；2、體重18-22g;3、性別雌雄各半；4、年齡成年健康；5、動(dòng)物數(shù)60只。(二)受試物I、受試物金蕎麥提取物(根據(jù)實(shí)施例I制備)、吳茱萸提取物(根據(jù)實(shí)施例2制 備)、將金蕎麥提取物(根據(jù)實(shí)施例I制備)和吳茱萸提取物(根據(jù)實(shí)施例2制備)按I : I的重量比均勻混合制備成的藥物組合物；以阿司匹林為陽性對(duì)照藥。2、含量低、中、高三個(gè)提取物組合物含量分別為25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml，單獨(dú)藥物組(即僅金蕎麥體提取物或者僅吳茱萸提取物)含量為50mg/ml。(三)給藥途徑將用0. 5% CMC-Na溶解的藥物直接涂抹于受試小鼠的耳朵。二、試驗(yàn)方法將動(dòng)物分為6組，每組昆明小鼠10只，共60只。一組為空白對(duì)照組(給不含藥物的0.5% CMC-Na)，五組為試驗(yàn)組(三個(gè)高中低不同劑量組、兩個(gè)單獨(dú)藥物組)。用二甲苯50微升/只，涂于小鼠左耳處致炎，30分鐘后右耳再分別涂以不含藥物的空白基質(zhì)，高中低3個(gè)劑量本發(fā)明制劑、以及2個(gè)單獨(dú)藥物制劑，給藥量為0. 2ml/10g。隔2小時(shí)后脫頸椎處死，剪下每只小鼠左右兩耳廓，用直徑8_打孔器在雙耳對(duì)稱處取下兩耳片，用分析天平稱重，以右耳減去左耳片重為右耳腫脹度，分別計(jì)算腫脹抑制率，各藥物組與對(duì)照組比較，結(jié)果見表I :表I各組藥物對(duì)二甲苯誘致鼠耳廓的腫脹作用結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于，包括金蕎麥提取物和吳茱萸提取物， 其中，所述金蕎麥提取物是醇提取物，所述吳茱萸提取物是醇提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物組合物，其特征在于，所述金蕎麥提取物是通過下列步驟制備的 將金蕎麥進(jìn)行加醇提取，以便獲得金蕎麥提取液；以及 將所述金蕎麥提取液進(jìn)行純化、干燥，以便獲得所述金蕎麥提取物， 任選地，將金蕎麥進(jìn)行加醇提取進(jìn)一步包括 將所述金蕎麥用8-12倍重量的30-60%乙醇，在50-70攝氏度下回流提取2_3次，每次.0. 5-2小時(shí)，合并提取液，獲得所述金蕎麥提取液， 任選地，將金蕎麥進(jìn)行加醇提取進(jìn)一步包括 將所述金蕎麥用8倍重量的50%乙醇，在60攝氏度下回流提取3次，每次I小時(shí)，合并提取液，獲得所述金蕎麥提取液， 任選地，將所述金蕎麥提取液進(jìn)行純化、干燥進(jìn)一步包括 將所述金蕎麥提取液進(jìn)行過濾，獲得金蕎麥提取液濾液； 利用大孔吸附樹脂對(duì)所述金蕎麥提取液濾液進(jìn)行純化，獲得純化后的金蕎麥提取液；以及 將所述純化后的金蕎麥提取液進(jìn)行減壓濃縮和真空干燥， 任選地，利用大孔吸附樹脂對(duì)所述金蕎麥提取液濾液進(jìn)行純化進(jìn)一步包括 將所述金蕎麥提取物濾液減壓濃縮，除醇，用大孔吸附樹脂洗脫； 使用除雜洗脫劑進(jìn)行除雜；以及 使用洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，以便獲得所述經(jīng)過純化的金蕎麥提取液， 其中， 任選地，所述減壓濃縮采用60攝氏度減壓濃縮， 任選地，大孔樹脂采用選自D101、DM-130和HPD-600的至少一種， 任選地，所述金蕎麥提取液濾液的上樣濃度為0. 02-0. 20g/ml，優(yōu)選為0. 08g/ml，所述金蕎麥提取液濾液的上樣流速為0. 5-4樹脂柱體積/小時(shí)，優(yōu)選2樹脂柱體積/小時(shí)， 任選地，所述除雜洗脫劑為水，所述洗脫劑的洗脫流速為3-6樹脂柱體積/小時(shí)，優(yōu)選4樹脂柱體積/小時(shí)， 任選地，所述洗脫溶劑為60-90%乙醇，所述洗脫溶劑的洗脫速度為1-3柱體積/小時(shí)，優(yōu)選采用70%乙醇洗脫溶劑的洗脫速度為2柱體積/小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的藥物組合物，其特征在于，所述吳茱萸提取物是通過下列步驟制備的 將吳茱萸進(jìn)行加醇提取，以便獲得吳茱萸提取液；以及 將所述吳茱萸提取液進(jìn)行純化、干燥，以便獲得所述吳茱萸提取物， 任選地，將吳茱萸進(jìn)行加醇提取進(jìn)一步包括 將所述吳茱萸用8-12倍重量的pH值為2-4的鹽酸乙醇，加熱回流提取2-3次，每次1-2小時(shí)，合并提取液，獲得所述吳茱萸提取液， 任選地，將吳茱萸進(jìn)行加醇提取進(jìn)一步包括 將所述吳茱萸用10倍重量的pH值為3的鹽酸乙醇，加熱回流提取3次，每次I. 5小時(shí)，合并提取液，獲得所述吳茱萸提取液， 任選地，將所述吳茱萸提取液進(jìn)行純化、干燥進(jìn)一步包括 將所述吳茱萸提取液進(jìn)行過濾，獲得吳茱萸提取液濾液； 利用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂對(duì)所述吳茱萸提取液濾液進(jìn)行純化，獲得純化后的吳茱萸提取液；以及 將所述純化后的吳茱萸提取液進(jìn)行減壓濃縮和真空干燥， 任選地，利用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂對(duì)所述吳茱萸提取液濾液進(jìn)行純化進(jìn)一步包括將所述吳茱萸提取物濾液減壓濃縮，調(diào)整濃縮液PH值至1-3，靜置，離心，上清液用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂純化； 使用除雜洗脫劑進(jìn)行除雜；以及 使用洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，以便獲得所述經(jīng)過純化的吳茱萸提取液， 其中， 任選地，所述強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，優(yōu)選采用選自D001、732型、OOll型和D072的至少一種，更優(yōu)選采用732型， 任選地，所述吳茱萸提取液濾液濃縮至50°C相對(duì)密度為I. 15-1. 25，優(yōu)選為I. 20，所述吳茱萸提取液濾液的上樣流速為0. 5-1. 5樹脂柱體積/小時(shí)，優(yōu)選I樹脂柱體積/小時(shí)，任選地，所述除雜洗脫劑為水，所述洗脫劑的洗脫流速為1-3樹脂柱體積/小時(shí)，優(yōu)選2樹脂柱體積/小時(shí)， 任選地，所述洗脫溶劑為70%-90%乙醇，所述洗脫溶劑的洗脫速度為1-3樹脂柱體積/小時(shí)，優(yōu)選采用80%乙醇洗脫溶劑的洗脫速度為2柱體積/小時(shí)， 任選地，所述金蕎麥提取物與所述吳茱萸提取物的重量比例為1-6 1， 任選地，所述金蕎麥提取物與所述吳茱萸提取物的重量比例為1.5-4 1， 任選地，所述金蕎麥提取物與所述吳茱萸提取物的重量比率為2. 5 1， 任選地，所述藥物組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的輔料， 任選地，所述藥物組合物呈選自軟膏劑、凝膠劑、栓劑、外用洗劑、片劑、顆粒劑、口服溶液、膠囊劑、內(nèi)服膏劑、氣霧劑或噴霧劑的至少一種的形式， 任選地，所述片劑為泡騰片， 任選地，所述藥物組合物呈軟膏的形式， 任選地，所述藥物組合物呈栓劑的形式， 任選地，所述藥物組合物呈凝膠劑的形式， 任選地，所述藥物組合物用于抑制HPV E7基因的表達(dá)， 任選地，所述藥物組合物用于治療炎癥， 任選地，所述藥物組合物用于治療由HPV感染引起的宮頸疾病、女陰上皮內(nèi)瘤變、疣病以及皮膚癌前病變， 任選地，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防宮頸癌或?qū)m頸癌前病變， 任選地，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防尖銳濕疣。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制HPV E7基因的表達(dá)， 任選地，所述藥物用于治療炎癥，任選地，所述藥物用于治療由HPV感染引起的宮頸疾病、女陰上皮內(nèi)瘤變、疣病以及皮膚癌前病變， 任選地，所述藥物用于治療或預(yù)防宮頸癌或?qū)m頸癌前病變， 任選地，所述藥物用于治療或預(yù)防尖銳濕疣。
5.一種制備藥物的方法，其特征在于，包括下列步驟 其中，所述金蕎麥提取物是醇提取物； 所述吳茱萸提取物是醇提取物； 將所述金蕎麥提取物和所述吳茱萸提取物按照預(yù)定的重量比例進(jìn)行混合，以便得到所述藥物， 其中， 任選地，所述金蕎麥提取物是通過下列步驟制備的 將金蕎麥進(jìn)行加醇提取，以便獲得金蕎麥提取液；以及 將所述金蕎麥提取液進(jìn)行純化、干燥，以便獲得所述金蕎麥提取物， 所述吳茱萸提取物是通過下列步驟制備的 將吳茱萸進(jìn)行加醇提取，以便獲得吳茱萸提取液；以及 將所述吳茱萸提取液進(jìn)行純化、干燥，以便獲得所述吳茱萸提取物。
任選地，所述金蕎麥提取物與所述吳茱萸提取物的重量比例為1-6 1， 任選地，所述金蕎麥提取物與所述吳茱萸提取物的重量比例為1.5-4 1， 任選地，所述金蕎麥提取物與所述吳茱萸提取物的重量比例為2. 5 1， 任選地，將金蕎麥進(jìn)行加醇提取進(jìn)一步包括 將所述金蕎麥用8-12倍重量的30-60%乙醇，在50-70攝氏度下回流提取2_3次，每次0. 5-2小時(shí)，合并提取液，獲得所述金蕎麥提取液， 任選地，將金蕎麥進(jìn)行加醇提取進(jìn)一步包括 將所述金蕎麥用8倍重量的50%乙醇，在60攝氏度下回流提取3次，每次I小時(shí)，合并提取液，獲得所述金蕎麥提取液， 任選地，將所述金蕎麥提取液進(jìn)行純化、干燥進(jìn)一步包括 將所述金蕎麥提取液進(jìn)行過濾，獲得金蕎麥提取液濾液； 利用大孔吸附樹脂對(duì)所述金蕎麥提取液濾液進(jìn)行純化，獲得純化后的金蕎麥提取液；以及 將所述純化后的金蕎麥提取液進(jìn)行減壓濃縮和真空干燥， 任選地，利用大孔吸附樹脂對(duì)所述金蕎麥提取液濾液進(jìn)行純化進(jìn)一步包括 將所述金蕎麥提取物濾液減壓濃縮，除醇，用非極性大孔吸附樹脂洗脫； 使用除雜洗脫劑進(jìn)行除雜；以及 使用洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，以便獲得所述經(jīng)過純化的金蕎麥提取液， 其中， 任選地，所述減壓濃縮采用60攝氏度減壓濃縮，非極性大孔樹脂采用D101、DM-130或HPD-600大孔樹脂， 所述金蕎麥提取液濾液的上樣濃度為0. 02-0. 20g/ml優(yōu)選為0. 08g/ml，所述金蕎麥提取液濾液的上樣流速為0. 5-4樹脂柱體積/小時(shí)優(yōu)選2樹脂柱體積/小時(shí)，所述除雜洗脫劑為水，所述洗脫劑的洗脫流速為3-6柱體積/小時(shí)優(yōu)選4柱體積/小時(shí)；以及 所述洗脫溶劑為60-90%乙醇，所述洗脫溶劑的洗脫速度為1-3樹脂柱體積/小時(shí)優(yōu)選采用70%乙醇洗脫溶劑的洗脫速度為2柱體積/小時(shí)， 任選地，將吳茱萸進(jìn)行加醇提取進(jìn)一步包括 將所述吳茱萸用8-12倍重量的pH值為2-4的鹽酸乙醇，加熱回流提取2-3次，每次1-2小時(shí)，合并提取液，獲得所述吳茱萸提取液， 任選地，將吳茱萸進(jìn)行加醇提取進(jìn)一步包括 將所述吳茱萸用10倍重量的pH值為3的鹽酸乙醇，加熱回流提取3次，每次I. 5小時(shí)，合并提取液，獲得所述吳茱萸提取液， 任選地，將所述吳茱萸提取液進(jìn)行純化、干燥進(jìn)一步包括 將所述吳茱萸提取液進(jìn)行過濾，獲得吳茱萸提取液濾液； 利用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂對(duì)所述吳茱萸提取液濾液進(jìn)行純化，獲得純化后的吳茱萸提取液；以及 將所述純化后的吳茱萸提取液進(jìn)行減壓濃縮和真空干燥， 任選地，利用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂對(duì)所述吳茱萸提取液濾液進(jìn)行純化進(jìn)一步包括將所述吳茱萸提取物濾液減壓濃縮，調(diào)整濃縮液PH值至2-3，靜置，離心，上清液用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂純化； 使用除雜洗脫劑進(jìn)行除雜；以及 使用洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，以便獲得所述經(jīng)過純化的吳茱萸提取液， 其中， 所述強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂優(yōu)選采用DOOl、732型、0011型D072，優(yōu)選采用732型， 所述吳茱萸提取液濾液濃縮至50°C測(cè)相對(duì)密度為I. 15-1. 25，優(yōu)選為I. 20，所述吳茱萸提取液濾液的上樣流速為0. 5-1. 5柱體積/小時(shí)優(yōu)選I柱體積/小時(shí)， 所述除雜洗脫劑為水，所述洗脫劑的洗脫流速為1-3柱體積/小時(shí)優(yōu)選2柱體積/小時(shí)；以及 所述洗脫溶劑為70% -90%乙醇，所述洗脫溶劑的洗脫速度為1-3柱體積/小時(shí)優(yōu)選采用80%乙醇洗脫溶劑的洗脫速度為2柱體積/小時(shí)， 任選地，進(jìn)一步包括將該方法制備的藥物制成選自軟膏劑、凝膠劑、栓劑、外用洗劑、片齊U、顆粒劑、口服溶液、膠囊劑、內(nèi)服膏劑、氣霧劑或噴霧劑的至少一種的形式， 任選地，所述片劑為泡騰片， 任選地，所述藥物呈軟膏的形式， 任選地，所述藥物呈栓劑的形式， 任選地，所述藥物呈凝膠劑的形式， 任選地，所述藥物用于抑制HPV E7基因的表達(dá)， 任選地，所述藥物用于治療炎癥， 任選地，所述藥物用于治療由HPV感染引起的宮頸疾病、女陰上皮內(nèi)瘤變、疣病以及皮膚癌前病變， 任選地，所述藥物用于治療或預(yù)防宮頸癌或?qū)m頸癌前病變，任選地，所述藥物用于治療或預(yù)防尖銳濕疣。
6.一種藥物，其是根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法制備的。
7.一種對(duì)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的藥物組合物或權(quán)利要求6所述的藥物進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于，包括 確定所述藥物組合物或藥物 中的有效成分含量；以及 將所述有效成分含量與預(yù)定的閾值進(jìn)行比較， 其中， 所述金蕎麥的有效成分為選自表兒茶素； 吳茱萸的有效成分為選自吳茱萸堿和/或吳茱萸次堿的至少一種， 任選地，針對(duì)金蕎麥提取物，所述有效成分為表兒茶素，所述閾值為至少0. 57mg,任選地，針對(duì)吳茱萸提取物，所述有效成分為吳茱萸堿和吳茱萸次堿，所述總量的閾值至少4. 7mg, 任選地，當(dāng)所述有效成分為表兒茶素時(shí)，確定所述藥物組合物或藥物中的有效成分含量進(jìn)一步包括 將所述藥物組合物或所述藥物用由氯仿、甲醇和冰醋酸組成的提取劑進(jìn)行超聲提??；將提取液揮發(fā)干燥，并用甲醇溶解殘?jiān)员惬@得含有表兒茶素的甲醇溶液；以及通過高效液相色譜分析，確定所述含有表兒茶素的甲醇溶液中的表兒茶素含量，任選地，當(dāng)所述有效成分為吳茱萸堿和吳茱萸次堿時(shí)，確定所述藥物組合物或藥物中的有效成分含量進(jìn)一步包括 將所述藥物組合物或所述藥物用由氯仿、甲醇和氨水組成的提取劑進(jìn)行超聲提?。粚⑻崛∫簱]發(fā)干燥，并用甲醇溶解殘?jiān)员惬@得含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的甲醇溶液；以及 通過高效液相色譜分析，確定所述含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的甲醇溶液中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及金蕎麥與吳茱萸的藥物組合物及其制備方法和質(zhì)量檢測(cè)方法。其中，藥物組合物包括金蕎麥提取物和吳茱萸提取物，金蕎麥提取物是醇提取物，吳茱萸提取物是醇提取物。本發(fā)明的藥物組合物可用來制備治療HPV感染的藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102652773SQ20121008821
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者張思佳, 牟峰, 王俊, 陳順欽, 黃偉, 黃璐 申請(qǐng)人:武漢華大基因科技有限公司, 武漢華大藥業(yè)有限公司, 深圳華大基因科技有限公司