專利名稱：包封uspio的隱形納米脂質(zhì)體注射液及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液， 及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，腫瘤依然是世界范圍內(nèi)死亡率最高的病因之一，每年約有1000萬(wàn)人發(fā)生腫瘤，而腫瘤的治療目前主要是手木，放療和化療相結(jié)合。雖然約有90個(gè)化療藥物被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于癌癥的臨床治療，但是由于化療藥物對(duì)病人的毒副作用和傷害過大而嚴(yán)重限制了化療藥物的使用。而這些毒副作用主要是由于化療藥物的靶向性及個(gè)體化較差導(dǎo)致。隨著人們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的逐漸認(rèn)識(shí)，腫瘤存在著“異質(zhì)性”逐漸被認(rèn)識(shí)，相同類型的腫瘤可能存在不同的分子機(jī)制，原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移腫瘤，腫瘤細(xì)胞之間都存在著不同的分子機(jī)制， 因此，腫瘤的治療應(yīng)當(dāng)以個(gè)體化治療為主。將腫瘤診斷與腫瘤治療整合于一體，在進(jìn)行腫瘤治療的同吋，可以通過臨床診斷設(shè)備進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)腫瘤的標(biāo)志物、藥物的靶部位、腫瘤治療的大小及療效，實(shí)時(shí)跟蹤評(píng)估，將會(huì)大大提高腫瘤治療的效率。磁共振成像(magnetic resonance image, MRI)是臨床常用的非侵入性的診斷方法，具有較高的空間時(shí)間分辨率，尤其對(duì)軟組織具有較好的成像。超微超順磁氧化鐵納米粒 (ultrasmall uperperomagnetic iron oxide, USPI0)是 MRI 的新型造影剤，屬于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)造影剤，通過造影劑的應(yīng)用，增強(qiáng)圖像的對(duì)比性，更有利于病灶的檢出。其代表產(chǎn)品有 Combidex (AMI-227)，SHU555C, Ferumoxtran-IO 等，其基本結(jié)構(gòu)主要為非化學(xué)計(jì)量的 Fii3O4 磁性單晶體組成，外面包裹低分子量的葡聚糖，其內(nèi)核粒徑約為5nm，水溶性粒子的粒徑為 20nm。由于USPIO顆粒在體內(nèi)集中分布于吞噬細(xì)胞或血管內(nèi)，呈腔隙性不均勻分布。造成局部磁場(chǎng)不均勻。水分子(質(zhì)子)擴(kuò)散通過此不均勻磁場(chǎng)時(shí)改變質(zhì)子橫向磁化的相位，加速質(zhì)子去相位的過程，使質(zhì)子的T2值縮短，稱為磁化率效應(yīng)。USPIO也具縮短Tl值的效應(yīng)，低濃度時(shí)Tl增強(qiáng)效應(yīng)較明顯。局部濃度和成像序列不同，可產(chǎn)生T1、T2和T2*增強(qiáng)效應(yīng)。作為網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的造影剤，目前臨床上主要用于良惡性淋巴結(jié)、骨髓病變、肝臟占位性病變等的診斷。作為新型MR造影剤，USPIO相對(duì)于目前順磁性釓類造影剤具有的優(yōu)點(diǎn)包括①毒性小，生物相容性好；②具有一定的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特異性；③弛豫度高，磁場(chǎng)響應(yīng)性高；④體內(nèi)循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，半衰期延長(zhǎng)；⑤可修飾性強(qiáng)，可以廣泛應(yīng)用于其它生物領(lǐng)域，如給藥載體， 干細(xì)胞標(biāo)記等等。盡管如此，USPIO作為MR造影剤用于病灶部位的成像診斷依然存在較大的缺陷，特別是體內(nèi)靶組織選擇性差，在靶組織分布濃度低，MR成像靈敏度低，使正常組織與病變組織的成像信號(hào)對(duì)比度低。因此增強(qiáng)USPIO在靶組織的靶向選擇性，増加病變部位的信號(hào)靈敏度，從而增強(qiáng)病變組織與正常組織的對(duì)比性是目前MR對(duì)比劑的研究熱點(diǎn)。為了增強(qiáng)靈敏性和特異性，人們針對(duì)USPIO進(jìn)行了多種嘗試，如減小粒徑及其分布，改變表面物理化學(xué)性質(zhì)，連接靶向配體等等。這些嘗試多數(shù)是在USPIO單個(gè)粒子上進(jìn)行改進(jìn)，如對(duì)USPIO表面進(jìn)行化學(xué)修飾，增強(qiáng)其對(duì)靶組織的選擇性和靈敏性，這些改變雖然增強(qiáng)了單個(gè)USPIO粒子的靶向性，但是由于體內(nèi)靶分子受體的表達(dá)量通常是極低的，通過
4配體與受體之間的特異性結(jié)合，靶細(xì)胞攝入U(xiǎn)SPIO的量也是極微弱的，可能達(dá)不到有效成像的濃度。并且，采用化學(xué)方法對(duì)USPIO進(jìn)行表面化學(xué)修飾以聯(lián)接靶向配體的方法通常會(huì)降低USPIO的原有的超順磁性，因此如何在不改變USPIO的固有生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上提高 USPIO對(duì)病變組織的選擇性和靈敏度，是提高腫瘤等病變組織的MR診斷效率的關(guān)鍵。隱形納米脂質(zhì)體(stealth nano-liposomes),又稱長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體(long circulating nano-liposomes)或 PEG 化納米月旨質(zhì)體(PEGylation nano—liposomes),作為腫瘤靶向的傳遞載體，具有顯著的優(yōu)勢(shì)，如具有細(xì)胞親和性，生物相容性、靶向性，降低體內(nèi)毒性等。并且目前已經(jīng)有多個(gè)抗腫瘤藥物脂質(zhì)體制劑在臨床使用，如美國(guó)Sequus制藥公司生產(chǎn)的鹽酸阿霉素隱形脂質(zhì)體注射劑(商品名D0XIL)已于1996年在美國(guó)上市銷售； Nexstar公司生產(chǎn)的枸櫞酸柔紅霉素注射用脂質(zhì)體,其商品名DaunoXome ；Depotech公司生產(chǎn)的治療急性粒細(xì)胞白血病的阿糖胞苷注射脂質(zhì)體制劑，其商品名D印ocyt，于1999年上市。阿霉素是蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，由于其結(jié)構(gòu)中既含有脂溶性的蒽環(huán)配基，又有水溶性的柔紅糖胺；并有酸性酚羥基和堿性氨基，因此它是一類作用效果較強(qiáng)的抗腫瘤藥物。 其作用機(jī)理在于可直接作用于DNA，插入DNA的雙螺旋鏈，使后者解開，改變DNA的模板性質(zhì)，抑制DNA聚合酶從而既抑制DNA，也抑制RNA合成；此外，它還具形成超氧基自由基的功能，并有特殊破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的作用。主要適用于治療白血病、惡性淋巴瘤、乳腺癌、 肉瘤、肺癌、膀胱癌等多種惡性疾病，對(duì)多種惡性腫瘤具有明顯療效，是目前臨床常用的抗腫瘤藥物之一。阿霉素具有強(qiáng)烈的心臟毒性和腎毒性，而阿霉素脂質(zhì)體制劑能夠有效降低其心臟毒性和腎毒性，提高生物利用度，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道一種體內(nèi)靶組織選擇性好、在靶組織分布濃度高、MR成像靈敏度也高的USPIO制劑，也無文獻(xiàn)報(bào)道利用納米脂質(zhì)體制備技術(shù)，將MR診斷與腫瘤治療整合于一體，制備同時(shí)包封USPIO及抗腫瘤藥物的納米隱形脂質(zhì)體，集腫瘤的診斷治療于一體， 提高腫瘤的診斷治療效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種體內(nèi)靶組織選擇性好、在靶組織分布濃度高、MR成像靈敏度也高的USPIO制劑，具體為包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，本發(fā)明還提供了該隱形納米脂質(zhì)體注射液的制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明人認(rèn)為，利用隱形納米脂質(zhì)體制備技術(shù)，攜載USPIO傳遞至腫瘤組織具有以下優(yōu)點(diǎn)①脂質(zhì)體不會(huì)影響USPIO的超順磁性；②一個(gè)脂質(zhì)體囊泡可以包封多個(gè)USPI0， 避免稀釋，有利于提高細(xì)胞攝入量及MR靈敏性便于表面靶向修飾，脂質(zhì)體可以連接多種配體,如小分子配體、多肽、單克隆抗體等；④脂質(zhì)體的體內(nèi)行為已經(jīng)被很好地確立,可以通過PEG化實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)；⑤脂質(zhì)體的粒徑相對(duì)可控，通過腫瘤EPR(enhanced permeability and retention, EPR)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)祀向；⑥脂質(zhì)體可以同時(shí)攜載藥物，并且攜載的藥物范圍很廣，包括小分子化學(xué)藥物、大分子蛋白藥物、親水性藥物、疏水性藥物等多種類型的藥物，等等。本發(fā)明的具體技術(shù)方案是提供一種具有高包封率的USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液。本發(fā)明采用隱形納米脂質(zhì)體制備技術(shù)，通過氧化USPIO外層葡聚糖形成醛基，與脂質(zhì)體膜材中的氨基磷脂在堿性條件下形成暫時(shí)性鍵合的方法，提高USPIO在脂質(zhì)體中的包封率和穩(wěn)定性，從而提高M(jìn)R體內(nèi)成像的靈敏度。進(jìn)ー步地，本發(fā)明提供一種高包封率的USPIO及抗腫瘤藥物的隱形納米脂質(zhì)體注射液，在上述的脂質(zhì)體制備過程中將抗腫瘤藥物包封于脂質(zhì)體之內(nèi)，集腫瘤的診斷治療于一體，提高腫瘤的診斷治療效率。本發(fā)明提供了一種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，該注射液是通過以下方法制備得到的首先氧化USPIO外層葡聚糖形成醛基(洪盈等，《有機(jī)化學(xué)》第二版，人民衛(wèi)生出版社，P199頁(yè)，醇羥基的氧化反應(yīng))，然后按以下組分與配比制備隱形納米脂質(zhì)體注射液USPIO (28mg Fe/mL) :0. 05_10mL磷脂材料l-100mg/mL含伯胺基的磷脂材料0. l-50mg/mL膽固醇0.l_40mg/mLPEG 化脂質(zhì)0. l-20mg/mL磷酸鹽緩沖液10mmol/L，pH5-9注射用水余量。本發(fā)明還提供了一種包封USPIO及抗腫瘤藥物的隱形納米脂質(zhì)體注射液，該注射液是通過以下方法制備得到的首先氧化USPIO外層葡聚糖形成醛基，然后按以下組分與配比制備隱形納米脂質(zhì)體注射液USPIO (28mg Fe/mL) :0. 05_10mL抗腫瘤藥物0.05-50mg/mL磷脂材料l-100mg/mL含伯胺基的磷脂材料0. l-50mg/mL膽固醇0.l-40mg/mLPEG 化脂質(zhì)0. l_20mg/mL磷酸鹽緩沖液10mmol/L，pH5-9注射用水余量；所述的抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素、紫杉醇、冬凌草甲素等。上述組分及其配比可優(yōu)選為USPIO (28mg Fe/mL) :0.ト5mL抗腫瘤藥物0.1-lOmg/mL磷脂材料l_30mg/mL含伯胺基的磷脂材料0. 2-10mg/mL膽固醇0.2-10mg/mLPEG 化脂質(zhì)1-5mg/mL磷酸鹽緩沖液10mmol/L，pH5-9注射用水余量。上述組分及其配比最佳地USPIO (28mg Fe/mL) :0. 5mL
鹽酸阿霉素lmg/mL磷脂材料具體是SlOO :20mg/mL含伯胺基的磷脂材料具體是DOPE 3mg/mL膽固醇3mg/mLPEG 化脂質(zhì)具體是 mPEG-DSPE 6mg/mL磷酸鹽緩沖液IOmmoI/L，pH6注射用水余量。上述的磷脂材料選自天然磷脂或合成磷脂，天然磷脂為大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂等；合成磷脂為氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二癸酰磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二芥酰磷脂酰膽堿、I-肉豆蘧酰基-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿或神經(jīng)鞘磷脂等等，所選用的磷脂材料為其中的一種或幾種的混合物，但不限于此；優(yōu)選磷脂材料為大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂或兩者的混合物。上述的含伯胺基的磷脂材料可以是磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等中的一種或兩種的混合物，但不限于此；優(yōu)選磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺或兩者的混合物。上述的PEG化脂質(zhì)可以是聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、聚乙二醇-聚乳酸、 聚乙二醇-聚己內(nèi)酯、聚乙二醇-磷脂酰甘油等中的一種或幾種，但不限于此；優(yōu)選聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或兩者的混合物。本發(fā)明還提供了一種包封USPIO及抗腫瘤藥物的長(zhǎng)循環(huán)隱形納米脂質(zhì)體注射液的制備方法，具體步驟如下(I)USPIO 的氧化取適量USPIO溶液與pH5_8的磷酸鹽緩沖液混合，加入0. 2_3g的高碘酸鈉混勻氧化30min，加0. I-Ig的乙二醇終止反應(yīng)；過S印hadex-G25柱脫鹽，得氧化并純化的USPIO溶液；其中所用的USPIO為具有Fe3O4或與Fe2O3混合物的無機(jī)晶核，外被低分子量葡聚糖的粒徑在10-30nm的納米粒，可以通過共沉淀法、熱分解法等多種文獻(xiàn)報(bào)道方法制備 (① Massart R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media. IEEE Trans Magn 1981 ；17 1247-8.② QiaoR, Yang C, Gao M. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles from preparations to in vivo MRI applications. J Mater Chem 2009 ；19 :6274-93.)自行合成，也可以作為商品購(gòu)買，商品如SHU555C(Superavist, 先靈德雅)，Combidex (Advanced Magnetics 公司)等。(2)包封USPIO及抗腫瘤藥物的長(zhǎng)循環(huán)隱形納米脂質(zhì)體混懸液的制備按上述配比取磷脂、含伯胺基的磷脂、膽固醇、PEG化脂質(zhì)溶于30_50mL的氯仿 /和乙醚中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中37°C旋蒸30-60min去除有機(jī)溶劑得脂質(zhì)膜；向脂質(zhì)膜中加入適量的氧化好的USPIO溶液進(jìn)行渦旋10-20min，繼續(xù)加入適量的含抗腫瘤藥物的磷酸鹽緩沖液(PH5-8)渦旋數(shù)分鐘；加入2-4倍體積的氯仿/和乙醚，置于超聲器中低溫超聲 20-40min，得均勻不分層的初乳混合物；將上述初乳混合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中37°C減壓旋蒸20-40min，真空度0. 05-0. IMpa，先形成凝膠再水化成脂質(zhì)體混懸液；為去除未包封的 USPIO和抗腫瘤藥物(鹽酸阿霉素等)，可將所得的脂質(zhì)體混懸液置于離心機(jī)中SOOOg離心 10-20min,去除上清液，用適量磷酸鹽緩沖液重新混懸得純化的脂質(zhì)體混懸液；(3)將純化的脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行高壓均質(zhì)，0. 22 μ m微孔濾膜過濾滅菌，充氮、分裝即得包封USPIO及抗腫瘤藥物的長(zhǎng)循環(huán)隱形納米脂質(zhì)體注射液。本發(fā)明還提供了上述的包封USPIO及抗腫瘤藥物的長(zhǎng)循環(huán)隱形納米脂質(zhì)體注射液在制備靶向MR造影剤中的應(yīng)用，特別是在腫瘤靶向治療診斷制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的包封USPIO及抗腫瘤藥物的長(zhǎng)循環(huán)隱形納米脂質(zhì)體注射液(以下稱 PLDU)的質(zhì)量評(píng)估(1)粒徑及其分布平均粒徑為(156. 9 士 25. 3)nm。(2)透射電鏡(TEM)觀察外觀及形態(tài)所制備的脂質(zhì)體成圓形或橢圓形，其內(nèi)側(cè)膜周及中間區(qū)域包封有大量鐵粒子，說明脂質(zhì)體包封了大量USPI0。(3)穩(wěn)定性考察為了考察脂質(zhì)體在血液中的穩(wěn)定性，將IOul脂質(zhì)體置于37°C、含有10%的FBS (胎牛血清)的PBS溶液中，放置lh，與脂質(zhì)體的粒徑幾乎沒有變化。(4)阿霉素的平均包封率為68. 5士5. 8%。(5)脂質(zhì)體中鐵的含量為0· 47士0. 05mg/mL。(6)體外磁共振成像特性PLDU與德國(guó)先靈葆雅生產(chǎn)的超小超順磁氧化鐵 SHU555C相比，在相同濃度下，其弛豫度沒有發(fā)生改變。(7)動(dòng)物模型體內(nèi)磁共振評(píng)價(jià)PLDU顯著增強(qiáng)體內(nèi)腫瘤的靶向性，并且可以通過連接靶向配體進(jìn)ー步增強(qiáng)其體內(nèi)病變組織的靶向性。(8)動(dòng)物模型體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)采用裸鼠皮下接種胰腺癌細(xì)胞的方式造腫瘤動(dòng)物模型，分別考察了載USPIO及阿霉素的隱形納米脂質(zhì)體制劑(PLDU)，游離阿霉素溶液 (FD)，以及連接有間皮素單克隆抗體的PLDU(M-PLDU)的抗腫瘤活性。結(jié)果顯示，PLDU給藥組相對(duì)于阿霉素溶液組，腫瘤的生長(zhǎng)顯著被抑制，而表面連接有間皮素單克隆抗體的PLDU 組效果更顯著。本發(fā)明的制劑經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明具有以下優(yōu)點(diǎn)同時(shí)具有MR成像性和抗腫瘤活性，既可以用于腫瘤的診斷，又可以通過MR成像監(jiān)測(cè)腫瘤治療的效果；具有更高的MR靈敏度。一個(gè)脂質(zhì)體包封多個(gè)USPIO粒子，避免了體液稀釋，顯著増加細(xì)胞攝入量，增強(qiáng)MR成像的靈敏度；具有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，通過PEG化可顯著減少血液中調(diào)理素蛋白的吸附，減少單核吞噬細(xì)胞的清除；便于進(jìn)行多種表面功能修飾，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)靶組織的主動(dòng)靶向。USPIO包載入脂質(zhì)體后，在脂質(zhì)體表面可以進(jìn)行多種靶向配體的修飾，配體可以是小分子，多肽，單克隆抗體等等。配體的連接方式有多種，如實(shí)施例中連接有間皮素單克隆抗體的USPIO隱形脂質(zhì)體，不影響USPIO固有的超順磁性；粒徑可控，在100-200nm之間，能有效實(shí)現(xiàn)腫瘤EI3R效應(yīng)。基于以上理論及實(shí)踐，利用隱形納米脂質(zhì)體為載體，將MR診斷及治療整合為ー 體，同時(shí)攜載USPIO及抗腫瘤藥物特別是(鹽酸)阿霉素，制備穩(wěn)定有效的隱形納米脂質(zhì)體制劑，作為MR造影剤，USPIO隱形納米脂質(zhì)體制劑不僅可以提高USPIO在體內(nèi)的組織選擇性，提高靈敏度，更有利于疾病的早期診斷，同時(shí)作為腫瘤治療療效的評(píng)估手段，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤化療的療效，有利于減少病人的過度治療，減少毒副作用，提高腫瘤治療的療效。


圖I為包封USPIO并載藥阿霉素的隱形納米脂質(zhì)體(PLDU)的粒徑及其分布圖
圖2透射電鏡觀察PLDU的外觀形態(tài)；
圖3體外MRI測(cè)定；
圖4動(dòng)物模型體內(nèi)MRI測(cè)定；
圖5給藥后各組模型動(dòng)物的腫瘤體積變化；
圖6給藥后各組模型動(dòng)物的體重變化曲線；
圖7給藥三周后各組腫瘤組織稱重；
圖8給藥后各組腫瘤照片
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。實(shí)施例I :包封USPIO的鹽酸阿霉素隱形脂質(zhì)體靜脈注射液組成為大豆卵磷脂500mg，磷脂酰乙醇胺lOOmg，膽固醇300mg，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺lOOmg，USPIO 15mL，鹽酸阿霉素lOOmg。制備方法取USPIO溶液與pH = 6的磷酸鹽緩沖液混合，加入300mg的高碘酸鈉混勻氧化 30min,加200mg的乙二醇終止反應(yīng),過Sephadex_G25柱脫鹽純化。按上述配比取大豆卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶于30mL的氯仿中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中37°C旋蒸40min，去除有機(jī)溶劑得脂質(zhì)膜；向其中加入U(xiǎn)SPIO溶液進(jìn)行渦旋 20min,繼續(xù)加入含鹽酸阿霉素的磷酸鹽緩沖液(pH8) 20mL渦旋IOmin ;加入60mL的氯仿和乙醚混合溶劑(I 3，V/V)，置于超聲器中低溫超聲20min，得均勻不分層的初乳混合物；將此混合物繼續(xù)37°C減壓旋蒸40min,真空度0. 06Mpa,先形成凝膠再水化成脂質(zhì)體混懸液； 于離心機(jī)中8000g離心20min，去除上清液，用30mL磷酸鹽緩沖液(pH8)重新混懸得純化的脂質(zhì)體，用注射用水定容至IOOmL ;最后進(jìn)行高壓均質(zhì),0. 22 ii m微孔濾膜過濾滅菌,充氮、 分裝即得。實(shí)施例2 :包封USPIO的鹽酸阿霉素隱形脂質(zhì)體靜脈注射液組成為蛋黃卵磷脂500mg，磷脂酰乙醇胺lOOmg，二油酰磷脂酰乙醇胺lOOmg，膽固醇 400mg,聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿150mg, USPIO 15mL,鹽酸阿霉素lOOmg。制備方法取USPIO溶液與pH = 6的磷酸鹽緩沖液混合，加入300mg的高碘酸鈉混勻氧化30min,加200mg的乙二醇終止反應(yīng)，過Sephadex_G25柱脫鹽純化。按上述配比取蛋黃卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、膽固醇、聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿溶于50mL的乙醚中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40°C旋蒸30min，去除有機(jī)溶劑得脂質(zhì)膜；向其中加入 USPIO溶液進(jìn)行渦旋20min，繼續(xù)加入含鹽酸阿霉素的磷酸鹽緩沖液(pH8) 20mL渦旋IOmin ； 加入90mL的氯仿和乙醚混合溶劑(I 2，V/V)，置于超聲器中低溫超聲20min，得均勻不
9分層的初乳混合物；將此混合物繼續(xù)40°C減壓旋蒸40min，真空度0. 08Mpa，先形成凝膠再水化成脂質(zhì)體混懸液；于離心機(jī)中6000g離心30min，去除上清液，用30mL磷酸鹽緩沖液 (pH8)重新混懸得純化的脂質(zhì)體，用注射用水定容至IOOmL ；最后進(jìn)行高壓均質(zhì)，0. 22μπι微孔濾膜過濾滅菌，充氮、分裝即得。實(shí)施例3 包封USPIO的鹽酸阿霉素隱形脂質(zhì)體靜脈注射液組成為蛋黃卵磷脂300mg，氫化大豆卵磷脂300mg，，ニ肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺150mg，膽固醇400mg，聚乙ニ醇-聚乙交酯丙交酯150mg，USPIO 20mL，鹽酸阿霉素lOOmg。制備方法取USPIO溶液與pH = 6的磷酸鹽緩沖液混合，加入300mg的高碘酸鈉混勻氧化 40min，加300mg的乙ニ醇終止反應(yīng)，過kphadex-G25柱脫鹽純化。按上述配比取蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、ニ肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、膽固醇、聚乙ニ醇-聚乙交酯丙交酯溶于30mL的氯仿中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中37°C旋蒸40min，去除有機(jī)溶劑得脂質(zhì)膜；向其中加入 USPIO溶液進(jìn)行渦旋20min，繼續(xù)加入含鹽酸阿霉素的磷酸鹽緩沖液(pH8)20mL渦旋IOmin ； 加入SOmL的氯仿和乙醚混合溶劑(1 1八八)，置于超聲器中低溫超聲20!^11，得均勻不分層的初乳混合物；將此混合物繼續(xù)37°C減壓旋蒸40min，真空度0. IMpa，先形成凝膠再水化成脂質(zhì)體混懸液；于離心機(jī)中SOOOg離心25min，去除上清液，用30mL磷酸鹽緩沖液(pH8) 重新混懸得純化的脂質(zhì)體，用注射用水定容至IOOmL ；最后進(jìn)行高壓均質(zhì)，0. 22 μ m微孔濾膜過濾滅菌，充氮、分裝即得。實(shí)施例4 包封USPIO的鹽酸阿霉素隱形脂質(zhì)體靜脈注射液組成為氫化大豆卵磷脂300mg，氫化蛋黃卵磷脂200mg，ニ硬脂酰磷脂酰乙醇胺200mg，膽固醇400mg，聚乙ニ醇-聚乳酸lOOmg，USPIO 15mL，鹽酸阿霉素80mg。制備方法取USPIO溶液與pH = 6的磷酸鹽緩沖液混合，加入300mg的高碘酸鈉混勻氧化 30min，加200mg的乙ニ醇終止反應(yīng)，過kphadex_G25柱脫鹽純化。按上述配比取氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、ニ硬脂酰磷脂酰乙醇胺、膽固醇、聚乙ニ醇-聚乳酸溶于60mL的氯仿中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中37°C旋蒸40min，去除有機(jī)溶劑得脂質(zhì)膜；向其中加入U(xiǎn)SPIO溶液進(jìn)行渦旋20min，繼續(xù)加入含鹽酸阿霉素的磷酸鹽緩沖液(pH8) 30mL渦旋IOmin ；加入60mL 的氯仿和乙醚混合溶劑(1 3，V/V)，置于超聲器中低溫超聲20min，得均勻不分層的初乳混合物；將此混合物繼續(xù)37°C減壓旋蒸40min，真空度0. 06Mpa，先形成凝膠再水化成脂質(zhì)體混懸液；于離心機(jī)中7000g離心40min，去除上清液，用30mL磷酸鹽緩沖液(pH8)重新混懸得純化的脂質(zhì)體，用注射用水定容至IOOmL ；最后進(jìn)行高壓均質(zhì)，0. 22 μ m微孔濾膜過濾滅菌，充氮、分裝即得。實(shí)施例5 包封USPIO的鹽酸阿霉素隱形脂質(zhì)體靜脈注射液組成為ニ硬脂酰磷脂酰膽堿300mg、ニ癸酰磷脂酰膽堿300mg，ニ油酰磷脂酰乙醇胺 50mg, ニ棕櫚酰磷脂酰乙醇胺lOOmg，膽固醇400mg，聚乙ニ醇-磷脂酰乙醇胺60mg，聚乙ニ 醇-聚己內(nèi)酯50mg，USPIO 20mL，鹽酸阿霉素120mg。
制備方法取USPIO溶液與pH = 6的磷酸鹽緩沖液混合，加入300mg的高碘酸鈉混勻氧化 30min,加300mg的乙二醇終止反應(yīng),過Sephadex_G25柱脫鹽純化。按上述配比取二硬脂酰磷脂酰膽堿、二癸酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、膽固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚己內(nèi)酯溶于50mL的氯仿中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40V旋蒸45min，去除有機(jī)溶劑得脂質(zhì)膜；向其中加入U(xiǎn)SPIO溶液進(jìn)行渦旋20min，繼續(xù)加入含鹽酸阿霉素的磷酸鹽緩沖液(pH8)20mL渦旋IOmin ;加入60mL的氯仿和乙醚混合溶劑(I 2， V/V)，置于超聲器中低溫超聲30min，得均勻不分層的初乳混合物；將此混合物繼續(xù)40°C減壓旋蒸40min,真空度0. 08Mpa,先形成凝膠再水化成脂質(zhì)體混懸液；于離心機(jī)中9000g離心 20min，去除上清液，用30mL磷酸鹽緩沖液(pH8)重新混懸得純化的脂質(zhì)體，用注射用水定容至IOOmL ;最后進(jìn)行高壓均質(zhì)，0. 22 微孔濾膜過濾滅菌，充氮、分裝即得。實(shí)施例6 :其余同實(shí)施例1，阿霉素替換為紫杉醇。實(shí)施例7 :其余同實(shí)施例2，紫杉醇替換為冬凌草甲素。實(shí)施例8 實(shí)施例I制備得到的本發(fā)明的PLDU的質(zhì)量評(píng)估(I)粒徑及其分布采用馬爾文Nano-S型激光粒度分析儀測(cè)量所制備的脂質(zhì)體的粒徑。具體方法為吸取IOii L PLDU，加入比色皿中，用去離子水稀釋至1-1. 5mL，放入測(cè)量槽中，預(yù)平衡2min后測(cè)定，結(jié)果如附圖I所示，平均粒徑為(156. 9±25. 3)nm。(2)透射電鏡(TEM)觀察外觀及形態(tài)將脂質(zhì)體用蒸餾水稀釋后，點(diǎn)樣于銅網(wǎng)上， 用2%的磷鎢酸負(fù)染，然后用透射電鏡觀察其形態(tài)，見附圖2.可見所制備的脂質(zhì)體成圓形或橢圓形，其內(nèi)側(cè)膜周及中間區(qū)域包封有大量鐵粒子，說明脂質(zhì)體包封了大量USPI0。(3)穩(wěn)定性考察為了考察脂質(zhì)體在血液中的穩(wěn)定性，將IOul脂質(zhì)體置于37°C、含有10%的FBS (胎牛血清)的PBS溶液中，放置lh，觀察脂質(zhì)體的粒徑變化，結(jié)果見表I.可見，在水及模擬血液中孵育Ih后，脂質(zhì)體的粒徑幾乎沒有變化。表I.脂質(zhì)體在水及37°C含10% FBS的PBS孵育Ih后的粒徑變化
Stfsj
樣本孵育介質(zhì) -——；-——-
孵育前孵育后_
Water157.3 士 5.2162.3 士 4.3
PLDU
PBS+FBS156.7±5.6162.4±5.0(4)阿霉素的包封率阿霉素脂質(zhì)體的藥物包封率通過離心及UV方法進(jìn)行測(cè)定和評(píng)價(jià)。首先，取一定體積的脂質(zhì)體混懸液在SOOOg下離心持續(xù)20min，并且脂質(zhì)體層用PBS洗兩次后，收集每次的上清液，測(cè)量總的游離藥物的量(DOXu);同時(shí)，取等量脂質(zhì)體混懸液，用TritonX-IOO (5 %，
V/V)破乳，測(cè)量總的阿霉素的含量(D0XT)，則阿霉素的包封率計(jì)算公式為
r nDOSt - DOM-
權(quán)利要求
1.一種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，其特征在于，該注射液是通過以下方法制備得到的首先氧化USPIO外層葡聚糖形成醛基，然后按以下組分與配比制備隱形納米脂質(zhì)體注射液USPIO(28mg Fe/mL) :0. 05_10mL 磷脂材料l-100mg/mL 含伯胺基的磷脂材料0. l-50mg/mL 膽固醇0. l-40mg/mL PEG 化脂質(zhì)0. l-20mg/mL 磷酸鹽緩沖液10mmol/L，pH 5-9 注射用水余量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，其特征在干，制備隱形納米脂質(zhì)體注射液時(shí)包封USPIO和抗腫瘤藥物，其組分與配比如下USPIO(28mg Fe/mL) 0. 05-10mL 抗腫瘤藥物0. 05-50mg/'mL 磷脂材料l-100mg/mL 含伯胺基的磷脂材料0. l-50mg/mL 膽固醇0. l-40mg/mL PEG 化脂質(zhì)0. l-20mg/mL 磷酸鹽緩沖液10mmol/L，pH 5-9 注射用水余量；所述的抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素、紫杉醇或冬凌草素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，其特征在干，制備隱形納米脂質(zhì)體注射液的組分及其配比為USPIO(28mg Fe/mL) :0.ト5mL 抗腫瘤藥物0. 1-lOmg/mL 磷脂材料l-30mg/mL 含伯胺基的磷脂材料0. 2-10mg/mL 膽固醇0. 2-10mg/mL PEG 化脂質(zhì)l-5mg/mL 磷酸鹽緩沖液10mmol/L，pH 5-9 注射用水余量。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，其特征在干，制備隱形納米脂質(zhì)體注射液的組分及其配比為USPIO(28mg Fe/mL) 0. 5mL 鹽酸阿霉素lmg/mL SlOO :20mg/mL DOPE :3mg/mL 膽固醇dmg/mL mPEG-DSPE :6mg/mL磷酸鹽緩沖液10mmol/L, pH 6注射用水余量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的一種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，其特征在于，脂質(zhì)體表面修飾有配體，配體是小分子、多肽或單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，其特征在于，配體是間皮素單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的一種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，其特征在于，所述的磷脂材料選自天然磷脂或合成磷脂，天然磷脂為大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂； 合成磷脂為氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二癸酰磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二芥酰磷脂酰膽堿、 I-肉豆蘧酰基-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿或神經(jīng)鞘磷脂，所選用的磷脂材料為其中的一種或兩種以上的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的一種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，其特征在于，所述的的含伯胺基的磷脂材料是磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一種或兩種以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的一種包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液，其特征在于，所述的的PEG化脂質(zhì)是聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚己內(nèi)酯或聚乙二醇-磷脂酰甘油中的一種或兩種以上。
10.一種如權(quán)利要求I或2所述的包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液的制備方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下A、USPIO的氧化取適量USPIO溶液與pH5-8的磷酸鹽緩沖液混合，加入0. 2-3g的高碘酸鈉混勻氧化 30min，加0. I-Ig的乙二醇終止反應(yīng)；過S印hadex-G25柱脫鹽，得氧化并純化的USPIO溶液；B、包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體混懸液的制備按配比取磷脂、含伯胺基的磷脂、膽固醇、PEG化脂質(zhì)溶于30-50mL的氯仿/和乙醚中， 置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中37°C旋蒸30-60min去除有機(jī)溶劑得脂質(zhì)膜；向脂質(zhì)膜中加入適量的USPIO 溶液進(jìn)行渦旋10-20min，如需加入抗腫瘤藥物可繼續(xù)加入適量的含抗腫瘤藥物的磷酸鹽緩沖液渦旋數(shù)分鐘；加入2-4倍體積的氯仿/和乙醚，置于超聲器中低溫超聲20-40min，得均勻不分層的初乳混合物；將上述初乳混合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中37°C減壓旋蒸20-40min，真空度0. 05-0. IMpa，先形成凝膠再水化成脂質(zhì)體混懸液；C、純化脂質(zhì)體混懸液，進(jìn)行高壓均質(zhì)，0.22um微孔濾膜過濾滅菌，充氮、分裝即得。
11.一種如權(quán)利要求I或2所述的包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液在制備MR造影劑中的應(yīng)用。
12.—種如權(quán)利要求I或2所述的包封USPIO的隱形納米脂質(zhì)體注射液在制備腫瘤靶向治療診斷制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道一種體內(nèi)靶組織選擇性好、在靶組織分布濃度高、MR成像靈敏度也高的USPIO制劑。本發(fā)明利用隱形納米脂質(zhì)體為載體，將MR診斷及治療整合為一體，同時(shí)攜載USPIO及抗腫瘤藥物，制備穩(wěn)定有效的隱形納米脂質(zhì)體制劑，作為MR造影劑，USPIO隱形納米脂質(zhì)體制劑不僅可以提高USPIO在體內(nèi)的組織選擇性，提高靈敏度，更有利于疾病的早期診斷，同時(shí)作為腫瘤治療療效的評(píng)估手段，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤化療的療效，有利于減少病人的過度治療，減少毒副作用，提高腫瘤治療的療效。
文檔編號(hào)A61K31/704GK102526771SQ20121001612
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者叢銳軍, 何志穎, 張佳良, 柯興發(fā), 王鵬龍, 鄧?yán)? 陳建明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)