專利名稱：Dgpp在制備治療缺血性心臟病藥物上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說涉及DGPP在制備治療缺血性心臟病藥物上 的新用途。
背景技術(shù)：
二?；视徒沽姿?英文名稱為Diacylglycerol pyrophosphate,簡稱為DGPP) 是一種磷脂酸，可以通過磷脂酸激酶作用使磷脂酸磷酸化而獲得，可以作為一種細(xì)胞內(nèi)第 二信使發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。DGPP具有多種生物學(xué)作用。例如，在動物細(xì)胞中，DGPP能 夠激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，進(jìn)而使細(xì)胞漿中PLA2磷酸化和蛋白激酶C轉(zhuǎn)移 至細(xì)胞膜(Balboa MA等.J BiolChem. 1999 ;274(1) :522-526)。在人的血小板中，DGPP 是LPA的拮抗劑(FischerDJ.Mol Pharmacol. 2001 ;60(4) :776-784)。在植物中，DGPP會 發(fā)生聚集以應(yīng)對干旱(Munnik T等.Plant J.2000;22(2) : 147-154)、高滲環(huán)境(Munnik T等.PlantJ. 2000 ;22(2) :147-154。 Meijer HJ等.Plant J. 2001 ;25(5) :541-548。 Pical C等.JBiol Chem. 1999 ;274 (53) :38232-38240)、疾病侵襲(van der Luit AH 等 PlantPhysiol. 2000 ;123(4) :1507-1516)和共生(den Hartog M等 Plant J. 2001 ; 25(1) :55-65)等。 心肌梗死是發(fā)病率和死亡率均較高的疾病，對人的身體健康和生活造成嚴(yán)重威 脅。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell,簡稱為MSCs)移植是治療心肌梗死的一 種有效途徑。移植至缺血心肌的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以有效改善心肌供血，部分改善心功 能(Hamano K等 Ann Thorac Surg. 2002 ;73(4) :1210-1215。 Feygin J等 Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007 ;293 (3) :H1772_1780)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌作用是其發(fā) 揮作用的一個重要原因，其中血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor, 簡稱為VEGF)可由MSCs分泌，具有促血管生成(Sellke FW等.Am J Physiol. 1996 ;271(2 Pt 2) :H713-720)、抗細(xì)胞凋亡和抑制病理性心肌重構(gòu)(Nor JE等 Am J Pathol. 1999 ; 154(2) :375-384。 Uemura R等 Circ Res. 2006 ;98 (11) :1414-1421.)等功能。在動物模 型中直接注射VEGF蛋白或者應(yīng)用VEGF基因均能夠增加缺血區(qū)新生毛細(xì)血管網(wǎng)的密度，促 進(jìn)側(cè)枝循環(huán)建立(Banai S等 Circulation. 1994 ;89 (5) :2183-2189。 Schwarz ER等.J Am Coll Cardiol. 2000 ;35(5) :1323-1330)。冠心病病人經(jīng)心肌注射VEGF蛋白或VEGF基因 治療，可減輕心絞痛癥狀，心肌缺血得到改善(Losordo DW等.Circulation. 1998 ;98(25): 2800-2804。 Rosengart TK等 Circulation. 1999 ; 100 (5) :468-474)。
促進(jìn)MSCs分泌VEGF能有效提高細(xì)胞移植治療的效果(Das H等.PLoSOne. 2009 ; 4(10) :e7325。 An SS等.Childs Nerv Syst. 2009。 Zisa D等 BiochemBiophys Res Commun. 2009 ;390(3) :834-838。 Dai Y等.JMol Cell Cardiol. 2007 ;42 (6) :1036-1044)。 因此尋找能促進(jìn)促進(jìn)MSCs分泌VEGF的物質(zhì)可以是提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療效果的 有效途徑。 經(jīng)檢索，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)DGPP促進(jìn)MSCs分泌VEGF的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病時存在的治療效果不十 分理想等問題，本發(fā)明第一 目的提供DGPP在制備促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌VEGF藥物上 的應(yīng)用。 本發(fā)明第二目的提供DGPP在制備治療缺血性心臟病藥物上的應(yīng)用。
本發(fā)明第三目的提供DGPP在制備治療神經(jīng)缺血性損傷藥物上的應(yīng)用。
所述的DGPP是指DGPP或含有DGPP的藥物組合物。 所述的DGPP (中文名稱為二?；视徒沽姿幔⑽拿Q為Diacylglycerol pyrophosphate,簡稱為DGPP)，分子式為C19H44N20uP2，分子量為538. 507，結(jié)構(gòu)式為
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O 本發(fā)明所述的DGPP通過購買獲得，使用時以BSA稀釋至所需濃度即可。
本發(fā)明的使用方法(1)在細(xì)胞移植前將10-50 M DGPP與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混 合，然后在37t:孵育6小時；(2)在細(xì)胞移植前，給患者口服或注射DGPP，以提高血清中 DGPP的含量。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明能顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的VEGF的含量，促進(jìn)心 肌梗死區(qū)血管生成，改善缺血心肌的供血，從而顯著提高利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的治 療效果。


圖1. ELISA法檢測VEGF分泌結(jié)果柱形圖；其中橫坐標(biāo)標(biāo)記"0"柱形條為對照組; 其余為加入不同濃度DGPP的處理組。 圖2. ELISA法檢測VEGF分泌柱形圖，其中橫坐標(biāo)標(biāo)記"control"柱形條表示對照 組；其余為加入不同濃度DGPP的處理組。 圖3. ELISA法檢測VEGF分泌柱形圖；其中橫坐標(biāo)標(biāo)記"0"柱形條的表示對照組;
其余為加入不同濃度DGPP的處理組。 圖4. Brdu合成摻入法檢測細(xì)胞增殖柱形圖。 圖5. AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡圖；其中標(biāo)記"control"表示對 照組；其余為加入不同濃度DGPP的處理組。 圖6.不同DGPP濃度下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量柱形圖；其中AnnexinV—/PI—:存活 細(xì)胞；Annexin V+/PI—:早期凋亡細(xì)胞；Annexin V+/PI+ :晚期凋亡細(xì)胞；Annexin V—/PI+ :壞 死細(xì)胞。
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具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但下面的具體實(shí)施方案僅為舉
例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實(shí)施例1 :DGPP促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌VEGF試驗(yàn) 按照以下方法進(jìn)行 (1)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取60克Sprague-Dawley雄性大鼠(SPF級，購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有 限公司)，以70mg/Kg鹽酸氯胺酮腹腔麻醉后，75%乙醇浸泡5min。超凈臺內(nèi)剪開動物腿部 皮膚，分離腿部肌肉，取出動物腿部股骨和脛骨。用PBS(組成成份及其比例為8g NaCl， 0. 2g KCl，1.44g Na2HP04，0. 24g 1(112 04溶于800ml蒸餾水，調(diào)PH至7. 4，定容至1L) (Gibcol 公司)洗去所取骨骼上的殘留血液，剔除骨骼上殘留的骨骼肌，除去長骨兩端的軟骨帽。輕 輕刮去一層骨端的骨垢，用完全培養(yǎng)液(MDM+15% FBS) (MDM和FBS均購自Gibcol公司) 緩慢沖出骨髓腔中的細(xì)胞。將沖出的細(xì)胞直接種到塑料培養(yǎng)瓶中，24小時后給細(xì)胞換液，以 后每隔48小時給細(xì)胞換液。4 5天后細(xì)胞可達(dá)到70-80%融合，以1 : 2傳代，傳至第3 代使用。 (2)實(shí)驗(yàn)分組及處理 (a)對照組取步驟(1)中的3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用10% FBS的MDM培養(yǎng)48 小時，換成含2% FBS的IMDM培養(yǎng)24小時后，進(jìn)行相應(yīng)檢測。 (b)DGPP處理組取步驟(1)中的3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用10% FBS的MDM培 養(yǎng)48小時，換成含2% FBS的IMDM培養(yǎng)24小時，用DGPP (購自AvantiPolar Lipids公司) 處理細(xì)胞，進(jìn)行相應(yīng)檢測。其中所述DGPP的配制方法是將DGPP溶于二甲基亞砜(匿SO)，配 成儲存濃度DGPP試劑(濃度為ImM)，應(yīng)用時以IMDM稀釋至所需的工作濃度即可。
(3)內(nèi)皮生長因子(VEGF)含量的檢測 VEGF含量測定使用大鼠VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(R&D公司)，檢測方法按照試 劑盒說明書進(jìn)行。具體如下①稀釋標(biāo)準(zhǔn)品將大鼠VEGF標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋成下列濃度-0， 31. 2， 62. 5， 125， 250， 500， 1000， 2000pg/ml ;②收集DGPP處理組及對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清，在 1000rpm下離心5min，取lml上清液加入EP管中；③取50 ii 1 Assay diluent RD1-41加入 相應(yīng)的微管中，再分別加入50 1上述的標(biāo)準(zhǔn)液、對照組和DGPP處理組細(xì)胞上清，封口 ，于 搖床上震蕩2小時； 用Wash Buffer洗微管5遍，加入VEGF 二抗，封口，搖床上震蕩1小 時； 用Wash Buffer洗微管5遍，加入100 ii 1 SubstanceSolution (A、 B液等量混合，提 前15分鐘混勻)；⑥加入100ii1 StopSolution于各微孔，酶標(biāo)儀上450nm波長檢測，570nm 波長校正；⑦將已知標(biāo)準(zhǔn)濃度(ng/ml)及其對應(yīng)的吸光光度值分別標(biāo)于對數(shù)坐標(biāo)的X軸和 Y軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和所測吸光度值，計算各樣品中VEGF濃度。
ELISA結(jié)果顯示①與對照組比較，濃度大于10iiM的DGPP有明顯的促進(jìn)MSCs分 泌VEGF作用(見圖1);②50 ii M DGPP作用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時間超過6小時，MSCs分泌 VEGF明顯增加(見圖2)。③分別應(yīng)用50 ii M DGPP和50 y M LPA處理MSCs24小時，結(jié)果顯 示DGPP和LPA都促進(jìn)了 MSCs分泌VEGF，而DGPP促分泌效果明顯高于LPA (見圖3)。說明 DGPP能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌VEGF，而且比LPA的促分泌效果高。
實(shí)施例2DGPP對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖影響試驗(yàn)
細(xì)胞增殖測定使用Brdu細(xì)胞增殖試劑盒(Calbiochem公司)，該試劑盒包括 Brdu標(biāo)記液、小鼠抗Brdu抗體、抗小鼠二抗、固定/破膜液、洗滌液、酶底物溶液、反應(yīng)終止 液以及抗體稀釋液。檢測步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，具體如下①上述實(shí)施例1步驟(1) 中所得的3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于96孔板達(dá)到60%融合后，用含2% BSA的MDM靜 息24小時，再分別用5， 10， 20， 50， 100iiM的DGPP處理MSCs 24小時；②各孔中分別加入 10 ii 1Brdu標(biāo)記液，繼續(xù)孵育4小時；③去除上清培養(yǎng)液(離心所得嗎？)，加入200 iU固 定液室溫靜置30min ;④洗滌后，加入小鼠抗Brdu抗體100 y 1室溫孵育1小時；⑤用洗滌 液清洗各孔4遍后，加入抗小鼠抗體100 ii 1室溫孵育30min ;⑥洗滌液清洗各孔4遍，加入 酶底物室溫孵育15min，加入反應(yīng)終止液，酶標(biāo)儀上450nm檢測。 結(jié)果(見圖4)隨著DGPP濃度的增高，DGPP明顯抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Brdu的 摻入，即DGPP抑制細(xì)胞增殖。而ELISA檢測結(jié)果顯示隨著DGPP濃度增高，VEGF分泌增加。 因此，說明DGPP促進(jìn)VEGF的分泌增高并非是細(xì)胞數(shù)量增加而引起的。
實(shí)施例3DGPP對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活影響試驗(yàn) AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。AnnexinV/PI雙染試劑盒購置，具體 檢測步驟如下①實(shí)施例1步驟(1)中3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，2XFBS 的MDM培養(yǎng)24小時后，分別加入5， 25， 50 ii M的DGPP處理MSCs 24小時，同時設(shè)置對照組; ②取6X 105細(xì)胞，用0. 25%胰酶/0. 04% EDTA消化細(xì)胞；③1000rpm、4t:下離心5min，棄 上清；細(xì)胞用PBS洗1-2次后懸浮于200 y 1 binding buffer ; 加入10 y 1異硫氰酸熒光 素(FITC)標(biāo)記的Annexin V(An證in V-FITC)，輕輕混勻，4。C避光反應(yīng)15 20min ;⑤加 入5 ill PI和300 ill binding buffer,輕輕混勻；⑥流式細(xì)胞儀檢測，以區(qū)分活細(xì)胞、早期 凋亡和中晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。 結(jié)果(見圖5和圖6)MSCs在2% MDM條件下培養(yǎng)24小時，細(xì)胞沒有發(fā)生明顯的 凋亡，不同濃度的DGPP對存活細(xì)胞數(shù)量沒有顯著影響，因此說明DGPP促VEGF分泌增加并 非由于細(xì)胞數(shù)量改變的結(jié)果。
權(quán)利要求
DGPP在制備促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌VEGF藥物上的應(yīng)用。
2. DGPP在制備治療缺血性心臟病藥物上的應(yīng)用。
3. DGPP在制備治療神經(jīng)缺血性損傷藥物上的應(yīng)用。
4. 按照權(quán)利要求1、2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的DGPP是指DGPP或含有DGPP 的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了DGPP在制備促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌VEGF藥物上的應(yīng)用，本發(fā)明還公開了DGPP在制備治療缺血性心臟病或神經(jīng)缺血性損傷藥物上的應(yīng)用。本發(fā)明DGPP可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌VEGF，促進(jìn)血管生成，增加新生毛細(xì)血管網(wǎng)的密度，大大提高利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性心臟病的效果。
文檔編號A61P25/00GK101780097SQ201010139139
公開日2010年7月21日 申請日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者叢祥鳳, 陳曦, 魏華 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院