專利名稱：雙宿主重組桿狀病毒表達載體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術、昆蟲桿狀病毒基因表達系統(tǒng)、基因治療和活載體疫苗
載體，具體涉及一種雙宿主重組桿狀病毒表達載體及其構建方法和應用。
背景技術：
昆蟲桿狀病毒基因表達系統(tǒng)具有超強的表達效率；對表達產物具有翻譯后加工修 飾能力；可保持外源蛋白發(fā)揮其生物學活性所必需的空間結構；不能在動物細胞內復制， 生物安全性高；對細胞基本上沒有毒性；操作簡單，容易制備；插入外源基因容量大等特點 和優(yōu)點，是當前使用最為廣泛的真核表達系統(tǒng)之一。 美國Invitrogen公司推出了 Bac-to-Bac表達系統(tǒng)。Bac-to-Bac系統(tǒng)的穿梭 載體Bacmid含有F因子復制子(可在大腸桿菌中復制)、卡那霉素抗性基因及Tn7轉座 位點attTn7。 Bac-to-Bac系統(tǒng)的轉移載體是一系列商品化的質粒，包括表達非融合蛋白 的pFastBac I，表達融合蛋白的pFastBacHTa、 b、 c以及雙元載體pFastBacDual 。這幾種 質粒的共同特點是都含有mimi-Tn7元件序列、多角體蛋白基因啟動子(pFastBacDual中 還含有P10基因啟動子)、多克隆位點以及作為轉化標記的慶大霉素抗性基因。轉移載體 pFastBacDual是一個雙元表達載體，基本結構與pFastBacI類似，不同之處是在Tn7的左右 臂之間除了有Polyhedrin啟動子以及其后的多克隆酶切位點(MSC)序列外在上游還有一 個反向的plO基因啟動子及多克隆酶切位點(MSC)序列。使用這一載體可以同時將兩種外 源基因引入重組桿狀病毒基因組并實現(xiàn)共表達(名稱一種動物基因工程干擾素a和Y 復合制劑及其生產方法和臨床應用，申請?zhí)?00610128462. 7) 。 Bac-to-Bac系統(tǒng)與傳統(tǒng)的 桿狀病毒載體系統(tǒng)相比，有兩大優(yōu)點一是大大縮短了重組病毒構建所需的時間，傳統(tǒng)方法 即使是技術熟練人員也需6 9周甚至更長的時間，而應用Bac-to-Bac策略用7 9天就 可以獲得所需的重組桿病毒病毒；二是由于重組病毒DNA在細菌內產生，可根據(jù)菌斑顏色 篩選即藍白斑篩選，不存在野生型和非重組型病毒交叉污染的問題，因此不需要傳統(tǒng)繁瑣 的空斑分析來純化重組病毒，而且轉座率高，純化率達100% 。因此Bac-to-Bac表達系統(tǒng)是 目前使用較為廣泛的表達系統(tǒng)。 昆蟲桿狀病毒主要在昆蟲細胞上繁殖，而不能在動物細胞內復制，對細胞基本上 沒有毒性，因此可用于基因治療載和非復制型載體疫苗(名稱一種可用于制作禽類疫苗 的重組桿狀病毒的制備方法，申請?zhí)?00610009656. 5)。 用于在昆蟲細胞上表達外源基因的重組桿狀病毒在表達外源蛋白的同時，重組桿 狀病毒也大量增殖，產生出高梯度的桿狀病毒，這些重組桿狀病毒除留一部分再次用作種 毒外，大多數(shù)無任何利用價值。而用作基因治療和非復制型載體疫苗的重組桿狀病毒，需 要在昆蟲細胞上進行高梯度增殖，然后提取重組桿狀病毒用于基因治療和非復制型載體疫 苗，但重組桿狀病毒在昆蟲細胞上增殖的過程中不表達外源蛋白。因此開發(fā)出既可以在昆 蟲細胞上表達外源基因，同時又可以用作基因治療和非復制型載體疫苗的重組桿狀病毒表 達載體具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種雙宿主重組桿狀病毒表達載體，該重組桿狀病毒表達 載體同時含有昆蟲細胞可識別的Polyhedrin啟動子和動物細胞可識別的CMV-IE啟動子， 該雙宿主重組桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞上可以高水平表達外源基因，同時重組桿狀病 毒大量增殖，高梯度繁殖的重組桿狀病毒又可以用作基因治療和非復制型載體疫苗，在動 物及其細胞上表達外源基因。 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種雙宿主重組桿狀病毒表達載體的構建方法及 其應用。 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的 本發(fā)明的雙宿主重組桿狀病毒表達載體，該重組桿狀病毒表達載體同時含有昆蟲
細胞可識別的Polyhedrin啟動子和動物細胞可識別的CMV-IE啟動子。 本發(fā)明的雙宿主重組桿狀病毒表達載體還含有昆蟲細胞可識別的plO啟動子。 本發(fā)明的雙宿主重組桿狀病毒表達載體的構建方法法包括以下步驟 (1)重組桿狀病毒轉移載體的構建 (A)以桿狀病毒Bac-to-Bac表達系統(tǒng)中轉移載體pFastBac系列為基礎，在 Polyhedrin啟動子上游或Polyhedrin啟動子與p10啟動子之間選擇或引入酶切位點，在 Polyhedrin啟動子和p10啟動子控制下分別插入在昆蟲細胞中表達的目的外源基因序列；
(B)在包含CMV-IE表達盒的另一載體質粒上，在其兩端分別選擇或引入與步驟 (A)中相同的酶切位點，構建配套的輔助質粒，在輔助質粒CMV-IE表達盒中插入在動物細 胞中表達的目的外源基因序列； (C)將CMV-IE啟動子控制下已插入外源基因序列的輔助質?；驍U增片段進行酶
切，回收目的片段，連接到經酶切的在Polyhedrin啟動子和plO啟動子控制下已分別插入
外源基因序列的Bac-to-Bac表達系統(tǒng)轉移載體質粒上，構建在昆蟲細胞和動物細胞中均
可以表達外源基因的重組桿狀病毒轉移載體，稱之為雙宿主轉移載體。 (2)構建重組雙宿主Bacmid穿梭載體將包含外源基因的雙宿主轉移載體質粒轉
化DH10Bac感受態(tài)細胞，經同源重組和選擇性平板在37t:條件下培養(yǎng)48小時，篩選，挑取純
白色菌落進行搖菌擴增，提取質粒并進行鑒定，即為重組雙宿主Bacmid穿梭載體。 雙宿主重組桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞上生產外源蛋白及在基因治療和非復
制型載體疫苗中的應用。 本發(fā)明顯著的進步在于該雙宿主重組桿狀病毒表達載體包含有兩種啟動子系統(tǒng)， 即同時含有昆蟲細胞可識別的Polyhedrin啟動子或/和plO啟動子和動物細胞可識別的 CMV-IE啟動子，既可在昆蟲細胞上表達外源基因，用于制備功能蛋白，又可在動物細胞上表 達外源基因，用作基因治療和非復制型載體疫苗，是一種多功能的重組桿狀病毒表達載體。 本發(fā)明另一顯著的進步是作為重組桿狀病毒表達載體用于制備外源功能蛋白，在制備外源 功能蛋白的同時生產出高梯度的可用于基因治療和非復制型載體疫苗的重組桿狀病毒，即 節(jié)省了資源，降低了成本，又減輕了勞動工作量。


圖1是實施例1中的雙宿主轉移載體結構示意圖。
圖2是實施例1中鑒定Polyhedrin啟動子下豬干擾素y表達的間接免疫熒光圖。 圖3是實施例1中鑒定CMV-IE啟動子下綠色熒光蛋白表達的熒光顯微鏡圖。 圖4是實施例2中的雙宿主轉移載體結構示意圖。 圖5是實施例2中鑒定Polyhedrin啟動子下豬干擾素a表達的間接免疫熒光圖。 圖6是實施例2中鑒定P10啟動子下豬干擾素y表達的間接免疫熒光圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作詳細說明，但并不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1 —種雙宿主重組桿狀病毒表達載體，該重組桿狀病毒表達載體同時含有昆蟲細胞 可識別的Polyhedrin啟動子和動物細胞可識別的CMV-IE啟動子。
該雙宿主重組桿狀病毒表達載體構建方法，其步驟如下
(1)雙宿主重組桿狀病毒轉移載體的構建 (A)以桿狀病毒Bac-to-Bac表達系統(tǒng)中轉移載體pFastBacl系列質粒為基礎，在
Polyhedrin啟動子上游選擇Bstl1071酶切位點，在Polyhedrin啟動子控制下插入在昆蟲
細胞中表達的目的外源基因豬IFN-y序列，插入的外源基因前端可以引入能夠達到分泌
表達的蜂素信號肽(honeybee melittin signalp印tide，匪)基因。 (a)設計二條引物，PCR擴增蜂素信號肽編碼基因 PI :5' _gatcgaattcatgaaattcttagtcaacgttgcccttgtttttatggtcg_3' P2 :5' _3tccgc3teg3tgte3g333tgtetecg3cc3te3333C33gggc_3' PI含EcoR I酶切位點和ATG起始密碼子，引物PI和P2之間有19個堿基的互補。
Pl、P2二個引物互為模板，用Pfu DNA Polymerase擴增編碼蜂素信號肽基因，預計擴增長度
為76bp，擴增片段分別命名為豬INF-y-S。循環(huán)參數(shù)為94t:預變性3min ;94。C變性30s，
55。C退火30s，72。C延伸10min，共30個循環(huán)；72。C延伸10min。 (b)根據(jù)克隆的豬干擾素y基因序列測定結果，設計一對引物 P3 :5' _tacatctatgcggattactgccaggcgccctttttt_3' P4 :5' _agtagcatgcttagtgatggtgatggtgatgttttgatgctctctggcc_3' P3上游5'端與蜂素信號肽編碼基因有15bp的互補，P4下游在終止密碼子前加
入了編碼6個組氨酸的堿基序列和Hind III酶切位點。以克隆載體pGEM-PoINF-y為模
板，用Pfu DNA Polymerase擴增表達片段基因。循環(huán)參數(shù)為94。C預變性10min ;94。C變性
45s，55。C退火lmin，72。C延伸lmin，共30個循環(huán);72。C延伸10min。預計PCR擴增片段長
度為481bp，命名為PoINF-y 。 (c)蜂素信號肽編碼序列和PoINF- y表達片段的PCR連接 將編碼信號肽基因片段豬INF-y-S和編碼豬干擾素y成熟蛋白的基因片段 PoINF- y ，進行10g/L低溶點瓊脂糖凝膠純化回收。將經純化的PoINF- y -S和PoINF- y各 取liiL，用Pfu DNA Polymerase進行PCR五個循環(huán)預擴增，然后加入引物Pl和P4，繼續(xù)進 行PCR擴增，循環(huán)參數(shù)為94t:預變性10min ;94"C變性45s， 55"C退火lmin，72t:延伸lmin， 共32個循環(huán)；72t:延伸10min。預計擴增片段長度為542bp，前端帶有EcoR I酶切位點，后 端帶有Hind III酶切位點，命名為Mels-PoIFN-y-6His。
5
(d)桿狀病毒轉移載體pFastBac I的構建與鑒定 將擴增片段Me 1 s-PoIFN- Y _6Hi s進行膠純化，然后用限制性內切酶EcoR I和 Hind III進行消化。連接到經同樣酶消化的pFastBac I載體質粒上。轉化JM109感受態(tài) 細胞，進行Amp+平板篩選，挑取陽性克隆進行擴增，小量提取質粒，進行EcoR I和Hind III 酶切鑒定，篩選得到陽性轉移載體質粒pFastBac-PoIFN-Y。進行序列測定以驗證插入序列 的正確性。 (B)在包含CMV-IE表達盒的另一載體pAcGFPl-Cl輔助質粒通過PCR擴增出表達
盒，并在兩端引入Bstll07I酶切位點，在輔助質粒CMV-IE表達盒中具有綠色熒光蛋白指示
基因，在其MCS內可插入在動物細胞中表達的目的外源基因序列； 設計二條引物，引物兩端分別設計有Bstl107 I酶切位點，序列如下 P5 :5' _gatcgtatacttctttcctgcgttatcc_3' P6 :5' -cgtagtatactttcggccta
ttggttaa_3' 以pAcGFPl-Cl質粒為模板，PCR擴增出包含CMV-IE啟動子，綠色熒光蛋白(GFP) 和多克隆位點(MCS)及SV40 polyA的核苷酸片段，其中GFP可作為指示基因用于鑒定外源 基因的表達。
1 ii L(100ng) 5 li L 5 li L 1 ii L 1 ii L 1 ii L 36ii L
pAcGFPl-Cl質粒DNA 10XPCR Buffer 2. 5mM d證Mix 引物P5 引物P6
Ex T叫polymerase Sterile Water





_ 總反應體系 50iiL 瞬時離心混勻后，進行PCR，運行程序如下 95。C預變性，3min， 95。C變性50s， 56。C退火50s， 72。C延伸2min， 30個Cycles，最后 72t:延伸10min。預計擴增片段長度為1801bp，將擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳純化回收， 然后進行酶切，體系如下
2ii L





PCR純化產物 10 XK Buffer Bstl1071
總反應體系
20ii L
瞬時離心混勻，37。C酶切3-4h。
(C)將CMV-IE啟動子控制下已插入綠色熒光蛋白基因序列的PCR擴增片段酶切 后，回收目的片段，連接到經同種酶切的在Polyhedrin啟動子控制下已分別插入外源基因 序列的pFastBac I轉移載體質粒上，構建在昆蟲細胞和動物細胞中均可以表達外源基因的 重組桿狀病毒轉移載體，稱之為雙宿主轉移載體，連接體系如下
酶切PCR片段純化產物 5 ii L
酶切轉移載體質粒pFastBac-PoIFN- y 4 ii L 2XK Buffer 10 ii L T4DNA連接酶 1 y L 瞬時離心混勻，在水浴連接箱中16t:連接反應18h。
雙宿主轉移載體結構示意圖見圖1。 (2)雙宿主重組Bacmid穿梭載體的構建將包含外源基因的雙宿主轉移載體 質粒轉化DH10Bac感受態(tài)細胞，經同源重組和涂布在含卡那霉素(50 y g. mL—0 、四環(huán)霉素 (lOii g.mL—"、硫酸慶大霉素(7ii g.mL—0的選擇性平板上，在IPTG和X-gal的誘導下，37。C 條件下培養(yǎng)48小時，篩選，挑取純白色菌落進行搖菌擴增，傳統(tǒng)堿裂解法提取質粒并進行 PCR鑒定，即為重組雙宿主Bacmid穿梭載體。 (3)雙宿主重組桿狀病毒的制備將構建的重組雙宿主Bacmid穿梭載體質粒經脂 質體轉染法轉染對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細胞，即可獲得雙宿主重組桿狀病毒表達載體。轉 染步驟轉染前先將處于對數(shù)生長期的Sf9細胞用Grace' s培養(yǎng)基(不含抗生素和FBS) 吹打細胞，把大約9X 105個.mL—1細胞均勻放置于六孔板，Grace' s培養(yǎng)基體積約2ml，此 時使用的細胞應該是培養(yǎng)了 3 4d處于半對數(shù)生長期，成活率大于97X。允許細胞貼壁至 少lh或貼壁過夜。在1. 5ml滅菌印pendorf管準備下列溶液 a)溶液A :每次轉染，把5 ii L重組Bacmid加到100 ii L的Grace' s培養(yǎng)基，混勻。
b)溶液B :每次轉染，把6 ii L CellFECTIN Reagent加到100 ii L的Grace' s培 養(yǎng)基，混勻。 溶液B加入到溶液A中混合，在室溫孵育30 45min。向溶液A和溶液B混合物 中加入Grace' s培養(yǎng)基0. 8ml，混勻；吸去六孔板中Grace' s培養(yǎng)基，用Grace' s培養(yǎng) 基洗滌一次，然后加入溶液A和溶液B混合物。27t:孵育5h。加入昆蟲細胞完全培養(yǎng)基。 轉染72h以上或細胞出現(xiàn)病變后收集細胞和上清。500Xg離心5min取上清，細胞加小量上 清吸打分散后凍融一次后，500 X g離心5min取上清，與上次上清混合后，通過0. 2 y m濾膜 無菌過濾后避光保存于4°C，即為Pl代雙宿主重組桿狀病毒。PI代繼續(xù)感染對數(shù)生長期的 Sf9細胞，5天后收獲病毒，即為P2代，同樣方法獲得P3代，即得到高梯度的重組桿狀病毒， 可進行表達鑒定。 (4)間接免疫熒光檢測雙宿主重組桿狀病毒外源蛋白在昆蟲細胞中的表達P3代 重組桿狀病毒感染72h的Sf9昆蟲細胞混懸液，滴加在載玻片上數(shù)滴，27t:吸附lh，用濾紙 沿邊緣小心吸除上清，細胞用-2(TC預冷的丙酮-乙醇(3 : 2)固定5min，用含1% BSA的 PBS洗3次，自然風干；加入1 : 2500稀釋的鼠抗豬IFN-y抗體，37t:作用30min ;用含 1XBSA的PBS洗3-5次，自然風干；加入l : 50稀釋的FITC標記的羊抗鼠二抗，37t:作用 30min ;用含1% BSA的PBS洗3 5次，自然風干；熒光顯微鏡下觀察重組桿狀病毒感染的 Sf9昆蟲細胞顯示強熒光信號，其熒光信號主要分布在細胞膜上，證明Polyhedrin啟動子 控制下的外源基因豬IFN-y已在昆蟲細胞中獲得了表達，并且由于引入蜂素信號肽基因， 在昆蟲細胞中實現(xiàn)分泌型表達(見圖2)。 (5)熒光顯微鏡檢測雙宿主重組桿狀病毒外源蛋白在哺乳動物細胞中的表達在 6孔板上，常規(guī)方法制備MARC-145細胞，待長至單層后，棄上清，接種制備的P3代重組桿狀 病毒0. 4mL，吸附30min，然后加入完全培養(yǎng)基，在5% 0)2，371:培養(yǎng)48h，棄上清后，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞內綠色熒光，表明CMV-IE啟動子控制下的綠色熒光蛋白基因在真核 細胞MARC-145中獲得了表達(見圖3)。
實施例2 : —種雙宿主重組桿狀病毒表達載體，該重組桿狀病毒表達載體含有昆蟲細胞可識 別的Polyhedrin啟動子和p10啟動子，同時具有動物細胞可識別的CMV-IE啟動子。
該雙宿主重組桿狀病毒表達載體構建方法，其步驟如下
(1)雙宿主重組桿狀病毒轉移載體的構建 (A)以桿狀病毒Bac-to-Bac表達系統(tǒng)中轉移載體pFastBacDual質粒為基礎，在 Polyhedrin啟動子和plO啟動子控制下分別插入在昆蟲細胞中表達的目的外源基因序列 豬IFN-a (Porcine interferon alpha,PoIFN-a)禾口 IFN_Y (Porcineinterferon alpha, PoIFN-Y)，同時在其前端分別引入可實現(xiàn)分泌表達的蜂素信號肽(honeybee melittin signal p印tide，HBM)基因序列。
(a)設計引物，PCR擴增蜂素信號肽編碼基因 PI :5' _gatcgaattcatgaaattcttagtcaacgttgcccttgtttttatggtcg_3'， P2 :5' _ctagctcgagatgaaattcttagtcaacgttgcccttgtttttatggtcg_3'， P3 :5' _3tccgc3teg3tgte3g333tgtetecg3cc3te3333C33gggc_3'。 PI含EcoR I酶切位點，P2含Xho I酶切位點，PI和P2均為上游引物，P3為下游
引物，上下游引物之間有19個堿基的互補。P1、P3 二個引物和P2、P3 二個引物互為模板，用
Pfu DNA Polymerase擴增編碼蜂素信號肽基因，預計擴增長度為76bp，擴增片段分別命名
為PoINF a -S和PoINF y _S。循環(huán)參數(shù)為94。C預變性3min ;94。C變性30s， 55。C退火30s，
72。C延伸10min，共30個循環(huán)；72。C延伸10min。 (b) PoINF- a禾P PoINF- Y表達片段的PCR擴增 根據(jù)已克隆豬干擾素a的基因序列測定結果，設計一對引物 P4 :5' _tacatctatgcggattgtgacctgcctcagacccac_3'; P5 :5' _catgaagcttagtgatggtgatggtgatgctccttcttcctgagtctgtc_3' 上游5'端與蜂素信號肽編碼基因有15bp的互補，下游在終止密碼子前加入了編
碼6個組氨酸的堿基序列和Hind III酶切位點。以克隆載體pGEM-PoINFa為模板，用Pfu
DNA Polymerase擴增表達片段基因，不包含原有的信號肽序列。循環(huán)參數(shù)為94。C預變性
lOmin ;94。C變性45s，55。C退火lmin，72。C延伸lmin，共32個循環(huán);72。C延伸10min。預計
PCR擴增片段長度544bp，命名為PoINF-a 。 根據(jù)已克隆豬干擾素Y的基因序列測定結果，設計一對引物 P6 :5' _tacatctatgcggattactgccaggcgccctttttt_3' P7 :5' _agtagcatgcttagtgatggtgatggtgatgttttgatgctctctggcc_3' 上游5'端與蜂素信號肽編碼基因有15bp的互補，下游在終止密碼子前加入了編
碼6個組氨酸的堿基序列和Kpn I酶切位點。以克隆載體pGEM-PoINF y為模板，用Pfu DNA
Polymerase擴增表達片段基因。循環(huán)參數(shù)為94。C預變性lOmin ;94。C變性45s，55。C退火
lmin，72t:延伸lmin，共32個循環(huán)；72。C延伸10min。預計PCR擴增片段長度為481bp，命
名為PoINF-y 。 (c)蜂素信號肽編碼序列和PoINF- a 、 PoINF- Y表達片段的PCR連接
8
將編碼信號肽基因片段PoINFa-S和編碼豬干擾素a成熟蛋白的基因表達片段 PoINF- a進行10g/L低溶點瓊脂糖凝膠純化回收，將經純化的PoINF-Sl片段和PoINF- a 各取liiL，用Pfu DNA Polymerase進行PCR五個循環(huán)預擴增，然后加入引物PI和P5，繼 續(xù)進行PCR擴增，循環(huán)參數(shù)為94t:預變性10min ;94。C變性45s，55t:退火lmin，72t:延伸 lmin，共32個循環(huán)；72。C延伸10min。預計擴增片段長度為605bp，前端帶有EcoR I酶切位 點，后端帶有Hind III酶切位點，命名為Mels-PoIFNa-6His。 同樣，將編碼信號肽基因片段PoINFY-S和編碼豬干擾素Y成熟蛋白的基因表 達片段PoINF- y ，進行10g/L低溶點瓊脂糖凝膠純化回收。將經純化的PoINF y -S片段和 PoINF-y各取liiL，用Pfu DNA Polymerase進行PCR五個循環(huán)預擴增，然后加入引物P2和 P7，繼續(xù)進行PCR擴增，循環(huán)參數(shù)為94t:預變性10min ;94"變性45s， 55。C退火lmin，72°C 延伸lmin，共32個循環(huán)；72。C延伸10min。預計擴增片段長度為542bp，前端帶有Xho I酶 切位點，后端帶有Kpn I酶切位點，命名為Mels-PoIFNy-6His。
(d)pFastBacDual轉移載體的構建 將經電泳鑒定過的擴增片段Mels-PoIFNa -6His進行膠純化，然后用限制性 內切酶EcoR I和Hind 111進行消化。連接到經同樣酶消化的pFastBacDual載體質 粒上。轉化JM109感受態(tài)細胞，進行氨芐抗性平板篩選，挑取5-8個克隆進行擴增， 小量提取質粒，進行EcoR I和Hind III酶切鑒定，篩選得到2個陽性質粒，命名為 pFastBac-Mels-PoIFNa -6His。進行序列測定以驗證插入序列的正確性。
將經電泳鑒定過的擴增片段Mels-PoIFN y _6His進行膠純化，然后用限制性內切 酶Xho I和Kpn I進行消化。連接到同樣酶消化的陽性質粒pFastBac-Mels-PoIFNa-6His 上。轉化JM109感受態(tài)細胞，氨芐抗性平板篩選，挑取5-10個克隆進行擴增，小量提取質粒， 進行Xho I和Kpn I酶切鑒定，篩選得到3個陽性質粒。陽性質粒進行序列測定，以驗證插 入序列的正確性。命名為pFastBac-Mels-PoIFNa &Y-6His (B)在包含CMV-IE表達盒的另一載體pAcGFPl-Cl輔助質粒通過PCR擴增出表達 盒，并在兩端引入Bstll07I酶切位點，在輔助質粒CMV-IE表達盒中具有綠色熒光蛋白指示 基因，在其MCS內可插入在動物細胞中表達的目的外源基因序列；
設計二條引物 P8 :5' _gatcgtatacttctttcctgcgttatcc_3' P9 :5' -cgtagtatactttcggccta ttggttaa-3' 以pAcGFPl-Cl質粒為模板，PCR擴增出包含CMV-IE啟動子，綠色熒光蛋白(GFP) 和多克隆位點(MCS)及SV40 polyA的核苷酸片段，其中GFP可作為指示基因用于鑒定外源
基因的表達。pAcGFPl-Cl質粒DNA1 ii "100ng)10XPCR Buffer5 ii L2. 5mM d證Mix5 ii L引物P81 ii L引物P91 ii LEx T叫polymerase1 ii LSterile Water36ii L
_ 總反應體系 50iiL 瞬時離心混勻后，進行PCR，運行程序如下95。C預變性，3min， 95。C變性50s， 56。C退火50s， 72。C延伸2min， 30個Cycles，最后
72t:延伸10min。預計擴增片段長度為1801bp，將擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳純化回收，
然后進行酶切，體系如下 PCR純化產物 16iiL 10 XK Buffer 2 ii L Bstl1071 2iiL _ 總反應體系 20iiL
瞬時離心混勻，37。C酶切3-4h。 (C)將CMV-IE啟動子控制下已插入綠色熒光蛋白基因序列的PCR擴增片段酶切 后，回收目的片段，連接到經同樣酶切的在Polyhedrin啟動子和p10啟動子控制下已分別 插入豬IFN- a和IFN- Y的pFastBacDiml轉移載體質粒上，構建在昆蟲細胞和動物細胞中 均可以表達外源基因的重組桿狀病毒轉移載體，稱之為雙宿主轉移載體。連接體系如下
酶切PCR片段純化產物 5 ii L 酶切轉移載體質粒pFastBac-Mels-PoIFNa&y-6His 4 ii L
2XK Buffer 10 ii L T4DNA連接酶 liiL
瞬時離心混勻，在水浴連接箱中16t:連接反應18h。
雙宿主轉移載體結構示意圖見圖4。 (2)雙宿主重組Bacmid穿梭載體的構建將包含外源基因的雙宿主轉移載體 質粒轉化DH10Bac感受態(tài)細胞，經同源重組和涂布在含卡那霉素(50 y g. mL—0 、四環(huán)霉素 (lOyg.mL—"、硫酸慶大霉素(7yg.mL—0的選擇性平板上，在37"條件下培養(yǎng)48小時，篩 選，挑取純白色菌落進行搖菌擴增，傳統(tǒng)堿裂解法提取質粒并進行PCR鑒定，即為重組雙宿 主Bacmid穿梭載體。 (3)雙宿主重組桿狀病毒的制備將構建的重組雙宿主Bacmid穿梭載體質粒脂質 體轉染法轉染對數(shù)生長期的昆蟲細胞，即可獲得雙宿主重組桿狀病毒表達載體。轉染步驟 和雙宿主重組桿狀病毒的制備方法同實施例1。 (4)間接免疫熒光檢測雙宿主重組桿狀病毒外源蛋白在昆蟲細胞中的表達P3代 重組桿狀病毒感染72h的Sf9昆蟲細胞混懸液，滴加在二個載玻片上數(shù)滴，27t:吸附lh，用 濾紙沿邊緣小心吸除上清，細胞用-2(TC預冷的丙酮-乙醇(3 : 2)固定5min，用含l^BSA 的PBS洗3次，自然風干；一個載玻片加上入1 : 2500稀釋的鼠抗豬IFN-Y抗體，另一個 載玻片加上入l : 2500稀釋的鼠抗豬IFN-a抗體，37t:作用30min;用含l^BSA的PBS 洗3-5次，自然風干；分別加入1 : 50稀釋的FITC標記的羊抗鼠二抗，37t:作用30min ;用 含1% BSA的PBS洗3 5次，自然風干；熒光顯微鏡下觀察重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲 細胞均顯示強熒光信號，其熒光信號主要分布在細胞膜上，證明Polyhedrin啟動子和P10 啟動子控制下的外源基因豬IFN-a (見圖5)和IFN-Y (見圖6)已在昆蟲細胞中獲得了表達，并且由于均引入蜂素信號肽基因，在昆蟲細胞中實現(xiàn)分泌型表達 (5)熒光顯微鏡檢測雙宿主重組桿狀病毒綠色熒光蛋白在哺乳動物細胞中的表 達。方法同實施例1。 最后應說明的是本文中應用實施例對本發(fā)明的原理及實施方案進行了闡述，以 上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方案和核心思想；同時，對于本領域的一般技 術人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實施方式
及應用范圍上均會有改變之處或者更為具體 化，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發(fā)明的限制。
權利要求
一種雙宿主重組桿狀病毒表達載體，其特征在于該重組桿狀病毒表達載體同時含有昆蟲細胞可識別的Polyhedrin啟動子和動物細胞可識別的CMV-IE啟動子。
2. 根據(jù)權利要求1所述的雙宿主重組桿狀病毒表達載體，其特征在于它還含有昆蟲 細胞可識別的plO啟動子。
3. 權利要求1或2所述的雙宿主重組桿狀病毒表達載體的構建方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1) 重組桿狀病毒轉移載體的構建(A) 以桿狀病毒Bac-to-Bac表達系統(tǒng)中轉移載體pFastBac系列為基礎，在 Polyhedrin啟動子上游或Polyhedrin啟動子與p10啟動子之間選擇或引入酶切位點，在 Polyhedrin啟動子和p10啟動子控制下分別插入在昆蟲細胞中表達的目的外源基因序列；(B) 在包含CMV-IE表達盒的另一載體質粒上，在其兩端分別選擇或引入與步驟(A)中 相同的酶切位點，構建配套的輔助質粒，在輔助質粒CMV-IE表達盒中插入在動物細胞中表 達的目的外源基因序列；(C) 將CMV-IE啟動子控制下已插入外源基因序列的輔助質?；驍U增片段進行酶切，回 收目的片段，連接到經酶切的在Polyhedrin啟動子和p10啟動子控制下已分別插入外源基 因序列的Bac-to-Bac表達系統(tǒng)轉移載體質粒上，構建在昆蟲細胞和動物細胞中均可以表 達外源基因的重組桿狀病毒轉移載體，稱之為雙宿主轉移載體；(2) 構建重組雙宿主Bacmid穿梭載體將包含外源基因的雙宿主轉移載體質粒轉化 DH10Bac感受態(tài)細胞，經同源重組和選擇性平板在37t:條件下培養(yǎng)48小時，篩選，挑取純白 色菌落進行搖菌擴增，提取質粒并進行鑒定，即為重組雙宿主Bacmid穿梭載體；(3) 重組桿狀病毒的制備將構建的重組雙宿主Bacmid穿梭載體質粒轉染對數(shù)生長期 的昆蟲細胞，即可獲得雙宿主重組桿狀病毒表達載體。
4. 權利要求1或2所述的雙宿主重組桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞上生產外源蛋白中 的應用。
5. 權利要求1或2所述的雙宿主重組桿狀病毒表達載體在基因治療和非復制型載體疫 苗中的應用。
全文摘要
一種雙宿主重組桿狀病毒表達載體及其構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。該雙宿主重組桿狀病毒表達載體具有昆蟲細胞可識別的Polyhedrin啟動子和動物細胞可識別的CMV-IE啟動子。該雙宿主重組桿狀病毒可在昆蟲細胞上用于制備功能蛋白，又可在動物細胞上表達目的外源蛋白，可作為基因治療和非復制型載體疫苗應用。該雙宿主重組桿狀病毒表達載體的構建方法是以Bac-to-Bac表達系統(tǒng)中轉移載體pFastBac系列為基礎，在Polyhedrin啟動子上游引入CMV-IE啟動子表達盒，構建轉移載體，轉化DH10Bac感受態(tài)細胞，重組雙宿主Bacmid穿梭載體，然后轉染對數(shù)生長期的昆蟲細胞即可獲得雙宿主重組桿狀病毒表達載體。
文檔編號A61K48/00GK101724651SQ20081023045
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月16日 優(yōu)先權日2008年10月16日
發(fā)明者崔保安, 張紅英, 李新生, 王亞賓, 王彥彬, 胡慧, 陳紅英, 魏占勇 申請人:河南農業(yè)大學