專利名稱：一種內酯單體化合物及其在制備治療抗癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗癌藥物，具體地說是以番荔枝種子為原料提取的一種番荔枝內酯單體化合物及其在制備治療抗癌藥物中的應用。
背景技術：
癌癥是危害人類健康的大敵。我國每年新發(fā)癌癥病例約有160萬人，每年死于癌癥的約有130萬人，全國因癌癥而死亡的人數逐年上升，我國為肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌癥的高發(fā)區(qū)域，癌癥死亡率居高不下。
目前尚無有效的藥物治愈大多數癌癥患者。化療藥物對癌癥雖有一定療效，但毒副作用大，中成藥對癌癥的療效普遍較低，如參蓮膠曩對肺、胃癌的癌灶緩解率僅為3.5％，療效均不理想。
本發(fā)明人研究了番荔枝(Annona squamosa Linn)的樹皮、枝葉、種子的抗癌有效物質和化學成分，從中提取出多種抗癌單體化合物(活性成分)，經抗癌實驗研究表明，對人肝癌細胞、人胃癌細胞、人食管癌細胞和動物移植性腫瘤(如S180、H22和Heps)均有顯著的體外和體內抗癌治療效果，并已申請獲得3項抗癌產品發(fā)明專利證書(專利號分別為ZL02148474.0、ZL02148475.9、ZL03112707.X)。在上述研究的基礎上，本發(fā)明人繼續(xù)提取分離、篩選番荔枝(Annona squamosa Linn)種子的抗癌有效化學成分，從中又發(fā)明了4種內酯單體成分具有特別顯著抗癌活性的抗癌用途(其抗癌活性數倍高于化療藥5-氟脲嘧啶)。

發(fā)明內容
1、發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種抗癌活性高、抗癌譜廣的抗癌單體化合物，具體地說是以番荔枝種子為原料提取的一種番荔枝內酯單體化合物(annonareticin)在制備抗癌藥物方面的應用。
2、技術方案本發(fā)明從番荔枝(Annona squamosa Linn)種子提取分離到一種抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物(經資料查閱目前還沒有文獻報道該化合物有抗癌活性)，其特征是白色粉末狀物質，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿等有機溶劑。其鑒定為annonareticin，化學結構式如下
一種抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物。其制備方法是番荔枝種子風干后，粉碎成粗粉，先用10倍量石油醚冷浸提取3次(室溫)，每次2天；回收石油醚得紅色油狀液體，室溫放置，底部有大量白色沉淀析出，過濾出白色沉淀，白色沉淀經多次硅膠柱層析；用石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，得到一種番荔枝內酯單體化合物(annonareticin)。經體內外抗癌藥理實驗，其對人肝癌細胞、小鼠移植性肝癌的生長有明顯的抑制作用，其抗癌活性數倍高于化療藥5-氟脲嘧啶。
本發(fā)明涉及一種抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物(annonareticin)在制備抗癌藥物中的應用。
采用MTT顯色法，取2×104/ml活細胞(人肝癌細胞SMMC-7721或HepG2)接種于96孔板，每孔90ul，設四復孔。待細胞貼壁后分別加入不同濃度的藥物10ul，對照孔加入10ulPBS，置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)至預定時間，每孔加濃度為1mg/ml的MTT50ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，去全部上清，加DMSO100ul/孔，微型振蕩器振蕩5min使結晶完全溶解，用酶聯儀，于570nm波長處測定吸光度值(OD)，調零孔只含有培養(yǎng)液。細胞活力用加藥細胞平均吸光度值/對照細胞平均吸光度值×100％，抑制率(％)＝(1-加藥細胞平均吸光度值/對照細胞平均吸光度值)×100％。
結果顯示，抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物(annonareticin)對人肝癌細胞的抑制活性非常高，其對人肝癌細胞的抑制活性數倍高于化療藥5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
3、有益效果本發(fā)明的一種抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物?？拱嶒灲Y果顯示，抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物(annonareticin)對癌中之王——肝癌的抑制活性非常高，其對肝癌的體內抑制活性數倍高于化療藥5-氟脲嘧啶(5-Fu)。這為提高抗癌臨床療效提供了非常有前景的高效預選藥物。
具體實施例方式
實施例1一種抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物(annonareticin)提取方法一種抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物。其制備方法是番荔枝種子風干后，粉碎成粗粉，先用10倍量石油醚冷浸提取3次(室溫)，每次2天；回收石油醚得紅色油狀液體，室溫放置，底部有大量白色沉淀析出，過濾出白色沉淀，白色沉淀經多次硅膠柱層析；用石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，得到一種番荔枝內酯單體化合物(annonareticin)。
實施例2一種抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物，其特征是白色粉末狀物質，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿等有機溶劑。其鑒定為annonareticin，分子式為C37H66O7，化學結構式如下 實施例3一種番荔枝內酯單體化合物(annonareticin)對人肝癌細胞的抑制作用1、細胞培養(yǎng)SMMC-7721或HepG2細胞株接種于培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含10％小牛血清、青霉素100u/ml、鏈霉素100ug/ml)，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈單層貼壁生長，每3～5天傳代一次，傳代時用0.25％胰酶消化3min，以培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液后接種。
2、藥物處理取對數生長期的細胞按2×105/ml接種于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞完全貼壁(約4小時)后，再換加含藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至預定時間。實驗藥物是經化學結構鑒定的一種番荔枝內酯單體化合物(annonareticin)；對照藥物是5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
2、實驗方法采用MTT顯色法，取2×104/ml活細胞接種于96孔板，每孔90ul，設四復孔。待細胞貼壁后分別加入不同濃度的藥物10ul，對照孔加入10ulPBS，置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)至預定時間，每孔加濃度為1mg/ml的MTT 50ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，去全部上清，加DMSO100ul/孔，微型振蕩器振蕩5min使結晶完全溶解，用酶聯儀，于570nm波長處測定吸光度值(OD)，調零孔只含有培養(yǎng)液。細胞活力用加藥細胞平均吸光度值/對照細胞平均吸光度值×100％，抑制率(％)＝(1-加藥細胞平均吸光度值/對照細胞平均吸光度值)×100％。
3、實驗結果結果如表1、表2顯示，隨著內酯單體化合物(annonareticin)濃度的升高，對人肝癌細胞的抑制率也升高，其對人肝癌細胞的抑制活性數倍高于化療藥5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
表1 annonareticin對SMMC-7721肝癌細胞生長的抑制作用(n＝9)

*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較表2 annonareticin對HepG2肝癌細胞生長的抑制作用(n＝9)

*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較實施例4一種番荔枝內酯單體化合物(annonareticin)對移植性肝癌的抑制作用1、實驗動物和瘤株雄性健康昆明種小鼠體重，18-22g，鼠齡6-8周，來自本校動物實驗中心，昆明鼠傳代腹水型鼠肝癌Heps瘤株均購自江蘇省腫瘤研究所動物實驗中心。小鼠在南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心的動物實驗房飼養(yǎng)，溫度21～25℃，濕度為45％～55％。
2、造模(移植性肝癌Heps)昆明種雄性小白鼠60只，按比例隨機留10只為陰性對照組，其余50只進行造模。無菌抽取接種Heps瘤種8天的小鼠的腹水，以生理鹽水稀釋10倍，0.02％伊紅染色，滴加到細胞計數板上計數后，調細胞濃度至1×107/ml，迅速地分別將50只小鼠右腋皮膚消毒，

鹽酸水溶液濃度氨水溶液pH值裝柱比例1、0.15％ 1、pH＝81、1∶152、0.20％ 2、pH＝92、1∶203、0.25％ 3、pH＝10 3、1∶25由以上實驗方案得出植物福建馬尾杉中含有一定量的石杉堿甲成份，該工藝符合中藥標準提取物石杉堿甲的提取工藝路線。因此從福建馬尾杉中分離石杉堿甲的收率在4/10萬到11/10萬之間。因此福建馬尾杉也可以作為提取石杉堿甲成份的原料。
因此本發(fā)明采用伸筋草、柳杉、福建馬尾杉三種植物作為提取來源的優(yōu)點在于保護了石杉堿甲的原有提取物千層塔的有限資源；可節(jié)約資金和成本，降低藥品價格，能產生較大的社會效益和經濟效益；
權利要求
1.一種抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物，其特征在于該內酯單體化合物鑒定為annonareticin，分子式為C37H66O7，化學結構式如下
2.根據權利要求1所述的番荔枝內酯單體化合物，其特征在于該化合物是白色粉末狀物質，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿。
3.權利要求1所述的番荔枝內酯單體化合物annonareticin在制備治療抗癌藥物中的應用。
全文摘要
一種抗癌藥物番荔枝內酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物。其制備方法是番荔枝種子風干后，粉碎成粗粉，先用石油醚冷浸提取；回收石油醚得紅色油狀液體，室溫放置，底部有大量白色沉淀析出，過濾出白色沉淀，白色沉淀經多次硅膠柱層析；用石油醚，石油醚－乙酸乙酯，乙酸乙酯－甲醇梯度洗脫，得到一種番荔枝內酯單體化合物annonareticin。經體內外抗癌藥理實驗，其對人肝癌細胞、小鼠移植性肝癌的生長有明顯的抑制作用，其抗癌活性數倍高于化療藥5－氟脲嘧啶。
文檔編號A61P35/00GK1861588SQ200610085998
公開日2006年11月15日 申請日期2006年6月16日 優(yōu)先權日2006年6月16日
發(fā)明者章永紅 申請人:南京中醫(yī)藥大學