專利名稱：源自膠原蛋白的抗氧化肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一系列源自膠原蛋白的抗氧化肽，和其作為抗氧化劑的用途。
背景技術(shù)：
丁基羥基茴香醚(BHA)和2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)等化學(xué)合成的抗氧化劑通常作為食品添加劑用在食品工業(yè)上，用于防止食品的氧化變色或者因氧導(dǎo)致的品質(zhì)劣變。然而這些合成抗氧化劑由于對健康的潛在危害，在食品上的應(yīng)用越來越受到限制。在最近的二十年里，人們把目光轉(zhuǎn)向來自于動植物的天然的、安全的抗氧化劑。天然抗氧化劑不僅能夠防止食品中油脂體系的氧化，而且可以防止人體內(nèi)自由基的危害，延緩衰老導(dǎo)致的各種退化性疾病，如癌癥、冠心病、糖尿病等等。已有一些報道發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的水解物具有一定的抗氧化性。例如，在中國專利CN200510009423.0中公開了一系列源自蜂王漿的抗氧化肽，其為通過將蜂王漿用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶進行酶處理，可以獲得具有和維生素E同等程度的強抗氧化能力的抗氧化肽。但是這類天然抗氧化劑的原料來源非常有限，不利于它的廣泛使用。
在文獻1《生物化學(xué)和分子生物學(xué)雜志》(2001)中，描述了采用系列酶解法，順序添加堿性蛋白酶(Alcalase)、鏈霉蛋白酶E(pronase E)和膠原酶(collagenase)，在一個三步法循環(huán)膜反應(yīng)器中進行水解，從牛皮中分離出三個含有9或10個氨基酸殘基的抗氧化肽PI(Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Hyp)，PII(Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly)和PIII(Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp)。在文獻2J.Agric.Food Chem.2001，49，1984～1989中，公開了采用同樣的系列酶解法，從阿拉斯加鱈魚魚皮中水解、分離出兩個含有16和13個氨基酸殘基的抗氧化肽P1(Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly)和P2(Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly)。但是這些分離出的抗氧化肽的氨基酸殘基的分子量比較大，在胃腸道中容易被消化系統(tǒng)的胃蛋白酶、胰蛋白酶及小腸蛋白酶進一步水解，失去抗氧化活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)分離的天然抗氧化劑(抗氧化肽)的氨基酸殘基的分子量比較大，在胃腸道中容易被消化系統(tǒng)的胃蛋白酶、胰蛋白酶及小腸蛋白酶進一步水解，失去抗氧化活性的缺陷，從而提供一系列分子量小、抗氧化性活性較高的源自膠原蛋白的抗氧化肽，和其作為抗氧化劑的用途。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一系列源自膠原蛋白的抗氧化肽，其具有如下之一的氨基酸序列(1)Hyl-Cys(2)Gln-Gly-Ala-Arg(3)Leu-Gln-Gly-Met(4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp本發(fā)明提供的上述源自膠原蛋白的抗氧化肽可以通過多肽儀化學(xué)方法合成，也可以通過將膠原蛋白水解，然后將獲得的水解產(chǎn)物分離純化而得。
本發(fā)明提供的上述源自膠原蛋白的抗氧化肽可通過如下的方法水解得到1)使用蛋白酶對膠原蛋白進行一次或連續(xù)幾次的水解，得到含有多種抗氧化肽的混合物的前制品；使用蛋白酶對膠原蛋白進行水解的條件視蛋白酶的活力和種類而定，以便生成足夠量的抗氧化肽，具體步驟為在20～45℃(優(yōu)選25～37℃)，將膠原蛋白與水混合，使得膠原蛋白在混合液中的重量百分比為2～8wt％，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)膠原蛋白水溶液的pH值至2.0～8.0，然后加入蛋白酶，進行水解反應(yīng)24～72小時(優(yōu)選36～48小時)，最后對混合液進行預(yù)處理以停止酶解反應(yīng)；所述的水優(yōu)選純凈水、去離子水、或蒸餾水；所述的膠原蛋白和蛋白酶的重量比為50～2500∶1；所述的膠原蛋白可以是任何來源的膠原蛋白，優(yōu)選使用豬、牛、雞、魚的膠原蛋白的提取物、粗制品、明膠等各種形式的制品；所述的蛋白酶可以采用任何能從底物產(chǎn)生抗氧化肽的蛋白酶；所述的蛋白酶為來自動物、植物、微生物等任意的生物的肽鍵水解酶，例如胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)、牛胰腺蛋白酶(protease from bovine pancreas)、堿性蛋白酶(Alcalase)、膠原酶(collagenase)、木瓜蛋白酶(papain)，以及來源于微生物的蛋白酶類，如鏈霉蛋白酶E(pronase E)、來自鏈霉菌的蛋白酶(protease from Streptomyces)，以及來自多黏芽胞桿菌的蛋白酶(protease from Bacillus polymyxa)等；其中優(yōu)選胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶；這些蛋白酶可以單獨地或混合使用，以便縮短水解時間，或在終產(chǎn)品中得到較好的口感；所述的預(yù)處理為采用加熱或調(diào)節(jié)pH的方法來鈍化蛋白酶，例如，在90℃加熱5分鐘，然后煮沸后再保持3分鐘；2)將步驟1)得到的含有多種抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品進行沉淀或過濾，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和雜質(zhì)等的水解液；例如調(diào)節(jié)前制品混合液的pH至中性，然后高速離心(例如20,000×g，10分鐘)，棄去下部的沉淀，分出上清液；或是采用醇沉法，加入4～6倍于前制品體積的乙醇，然后采用離心和過濾方法，濾去沉淀的蛋白，分出濾液；或是采用超濾法，選擇截流分子量為1000的超濾膜，將所有分子量大于超濾膜截流分子量的肽留在膜上，分離出下層的清液；3)將步驟2)得到的抗氧化肽的混合物進行分離純化和鑒定；將水解液進行微過濾，濾去分子量小于200的分子，得到干物質(zhì)含量為20～40wt％的混合液；然后使用凝膠過濾色譜柱(如Sephadex LH-20，Sephadex G-25)進行分離純化，采用去離子水或是20～50mM磷酸鈉緩沖溶液作為流動相，混合物中的肽依次洗脫出來，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的抗氧化活性，分別收集抗氧化活性高于50％的組分，然后用凍干機凍干成粉狀；將上述活性組分的凍干粉用0.5M tris-HCl緩沖液(pH 8.3)溶解，上樣到用該緩沖液平衡后的DEAE-Sephadex A-25(Cl-型，Sigma)色譜柱上進行分離純化(緩沖液還可采用磷酸鈉或醋酸銨緩沖液)，用緩沖液平衡和洗滌色譜柱，首先分離出來的將是未被吸附的肽；然后用NaCl溶液(0.5～1.0M)從0至0.5～1.0M進行梯度洗脫；混合物中的肽按酸堿性的強弱被流動相依次洗脫下來，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的抗氧化活性，如圖2所示，分別收集抗氧化活性最高的組分D和次高的組分A，然后凍干；
4)將步驟3)得到的組分用高效液相色譜(HPLC)進一步提純；將步驟3)得到的抗氧化活性高的2種組分合并后進一步用反相HPLC分離，用HPLC分離時，使用ODS柱(YMC ODS-AQ S-5120，4.6×250mm，USA)，上樣量為20μL，采用含0.1％三氟酸(TFA)的乙腈溶液線性洗脫，215nm下檢測肽的出峰位置，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的抗氧化活性，收集含抗氧化活性最高的組分，凍干，用含0.05％三氟酸溶解，再次用HPLC進行分離，分離得到純的活性組分；使用液相色譜-質(zhì)譜連用法(HPLC-MS)測定肽的分子量，用一前一后色譜(MS/MS)和氨基酸序列分析儀鑒定肽的氨基酸序列，查找已發(fā)表的有關(guān)膠原蛋白的氨基酸序列，進一步驗證此抗氧化肽的氨基酸序列。
按照以上分離/鑒定方法，本發(fā)明共得到了四個抗氧化肽序列，如表1所示。
表1、本發(fā)明鑒定的四個抗氧化肽序列

a，膠原蛋白的α1鏈上的氨基酸序列，數(shù)據(jù)來自于老鼠皮(氨基酸殘基1-402)和牛皮(氨基酸殘基403-1011)(Hulmes et al.，1973)。
b，Hyl-Cys在膠原蛋白的數(shù)據(jù)庫中沒有找到。
分別采用DPPH法測定本發(fā)明的源自膠原蛋白的4個抗氧化肽的自由基清除能力，采用鐵離子絡(luò)合法測定4個抗氧化肽金屬絡(luò)合能力，以及測定4個抗氧化肽在亞油酸脂質(zhì)過氧化體系中的抗氧化能力，這些方法都是常規(guī)的檢測方法，具體步驟如下1.用DPPH測定抗氧化肽的自由基清除能力(Bersuder et al.，1998)取待測樣品500μL，加入500μL 99.5wt％乙醇，和125μL含0.02wt％DPPH(1，1-二苯基三硝基苯肼)的乙醇溶液?；靹蚝笤谑覝叵卤芄忪o置60min，測定517nm下的吸光值。根據(jù)以下公式計算自由基清除能力，其中，以去離子水替代試樣，所測的吸光度作為對照，以99.5wt％的乙醇替代DPPH溶液，所測吸光度作為空白。
2.金屬絡(luò)合能力的測定采用鐵離子絡(luò)合法測定抗氧化肽的金屬絡(luò)合能力(Chung et al.，2002)。取待測樣品800μL，加入10μL 2mM FeCl2溶液和20μL 5mM顯色劑ferrozine，混勻后在室溫下靜置10分鐘，測定562nm下的吸光度。以去離子水替代試樣，所測的吸光度作為對照，按下式計算金屬絡(luò)合能力。
3.測定亞油酸脂質(zhì)過氧化體系中的抗氧化能力(Mendis et al.，2005)在玻璃管中加入1.5mL 0.1M磷酸鈉緩沖溶液(pH 7.0)和1.5mL 50mM亞麻酸的乙醇溶液，混合均勻后，加入2.0mL待測樣品(pH 7.0)。2.0mM BHT(2.6-二叔丁基對甲酚)的甲醇溶液作為參照替代試樣測定抗氧化能力。為促進油脂體系的氧化，將整個體系放在60℃的恒溫箱中48小時(避光)。對于加熱前和加熱后的反應(yīng)液的過氧化脂質(zhì)通過硫氰化鐵法進行測定(Osawa and Namiki，1981)。向100μL混合液中加入75wt％乙醇4.5mL，然后添加30％硫氰酸銨水溶液100μL，1.0N鹽酸200μL和20mM氯化亞鐵溶液(溶解在3.5％鹽酸中)100μL。5分鐘后測定500nm下的吸光度。
由上述方法的結(jié)果可知，本發(fā)明的源自膠原蛋白的4個抗氧化肽在這三種體系中都具有很高的抗氧化性。
本發(fā)明提供的上述源自膠原蛋白的抗氧化肽具有抗氧化作用，可以作為抗氧化劑，用于保健品、食品添加劑、營養(yǎng)強化劑、動物用添加劑、化妝品、日化用品等。
用于保健品時，該抗氧化肽可以添加到由活性氧引起的各種疾病的預(yù)防及治療用的食品中，可以以口服的形式，也可以使用針劑的形式。還可以作為功能性配料添加到飲料、調(diào)味品(如醬油)及其他動植物類食品中。
用作營養(yǎng)強化劑時，例如作為配料添加，以口服液、片劑或顆粒狀等形式攝取。
用作食品添加劑時可以添加到對氧、光不穩(wěn)定的食品中，作為抗氧化劑或穩(wěn)定劑使用。
用作動物用添加劑時，例如添加到飼料中或?qū)櫸锸称放浞街?，既可以作為抗氧化劑或穩(wěn)定劑使用，也可以作為動物的營養(yǎng)強化劑使用。
用作化妝品時，例如適用于洗劑、化妝水、乳狀液、口紅、霜劑、凝膠、面膜、粉底霜等主要用于皮膚或粘膜等物質(zhì)。
用作日化用品時，例如用于護齒、護膚、護發(fā)、洗滌用劑等。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于1)本發(fā)明提供的源自膠原蛋白的抗氧化肽的抗氧化作用很強，不僅可以替代BHT等用作食品的添加劑，而且可以作為活性功能性成分。該產(chǎn)品可以用于食品、保健品、化妝品、甚至動物食品和飼料等，應(yīng)用范圍極其廣泛，社會效益和經(jīng)濟效益都很顯著。
2)本發(fā)明提供的源自膠原蛋白的抗氧化肽是2～5個氨基酸的抗氧化肽，分子量小，更易被消化道直接吸收。


圖1為實施例2中采用Sephadex LH-20色譜層析柱分離抗氧化肽洗脫液的紫外吸收譜圖(A)及各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的自由基清除能力譜圖(B)；圖2為實施例2中采用DEAE-Sephadex A-25色譜層析柱繼續(xù)分離純化圖1中組分P4的紫外吸收譜圖(A)及各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的自由基清除能力譜圖(B)；圖3為實施例2中用反相HPLC進一步分離圖2中的組分A得到的紫外吸收譜圖(A)及各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的自由基清除能力譜圖(B)，標記為RSP的色譜峰抗氧化活性最強；圖4為圖3中組分RSP的質(zhì)譜圖，其分子量M+1為430.9098；圖5為圖4中的抗氧化肽(M+1＝430.9098)的質(zhì)譜/質(zhì)譜圖；圖6為圖3中所示含抗氧化活性次高的組分的質(zhì)譜/質(zhì)譜圖，其分子量為265.2。
具體實施例方式
實施例1、用蛋白酶將膠原蛋白水解得到的抗氧化肽混合物的抗氧化能力的測試在37℃，將豬皮的膠原蛋白粉與純凈水混合，使得膠原蛋白在混合液中的重量百分比為5wt％，用6N的鹽酸調(diào)節(jié)膠原蛋白的pH值至2.0，然后加入胃蛋白酶(pepsin)(膠原蛋白和蛋白酶的重量比為2500∶1，進行水解反應(yīng)24小時；水解結(jié)束時，將水解產(chǎn)物在90℃加熱5分鐘，然后煮沸后再保持3分鐘，停止酶解反應(yīng)。
然后，在此基礎(chǔ)上用鏈霉蛋白酶和牛胰蛋白酶繼續(xù)進行混合酶解調(diào)節(jié)上述胃蛋白酶水解產(chǎn)物的pH值為7.5，酶(鏈霉蛋白酶和牛胰蛋白酶的重量比為1∶1)與底物的比為2/125，水解溫度37℃，水解時間24小時，水解結(jié)束時，將水解產(chǎn)物煮沸3分鐘滅酶，得到含有多種抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品。
采用超濾法，將上述含有多種抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品進行過濾，選擇截流分子量為1000的超濾膜，將所有分子量大于超濾膜截流分子量的肽留在膜上，分出下層的清液，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和雜質(zhì)等的水解液，然后凍干。經(jīng)前述方法鑒定，該凍干粉的主要成分為含有上述四個抗氧化肽的2～6個氨基酸抗氧化肽混合物。
將該凍干粉配制成1％的水溶液，測定其抗氧化性。自由基清除能力高達90％，超過20mM BHT的自由基清除能力(84％)。金屬絡(luò)合能力達60％，(參照1.0mMEDTA為91％)。在亞油酸脂質(zhì)過氧化體系中的抗氧化能力為77％，高于同樣條件下20mM BHT的抗氧化性(60％)。
實施例2、進一步分離鑒定本發(fā)明的4個抗氧化肽將實施例1中得到的凍干粉用少量去離子水溶解，用凝膠過濾色譜柱SephadexLH-20(2.5×80cm)進行分離，以去離子水作為流動相，混合物中的肽依次洗脫出來，在254nm下檢測肽的濃度，如圖1(A)所示，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的抗氧化活性，如圖1(B)所示，收集抗氧化活性高于50％的組分P4，然后用凍干機凍干成粉狀將組分P4的凍干粉用0.5M tris-HCl緩沖液(pH 8.3)溶解，上樣到用該緩沖液平衡后的DEAE-Sephadex A-25(Cl-型，Sigma，2.0×35cm)色譜柱上進行分離純化。用0.5M tris-HCl緩沖液平衡和洗滌色譜柱，首先分離出來的將是未被吸附的肽；然后用NaCl溶液(0.5～1.0M)從0至0.5M進行梯度洗脫；混合物中的肽按酸堿性的強弱被流動相依次洗脫下來，在254nm下檢測肽的濃度，如圖2(A)所示，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的抗氧化活性如圖2(B)所示，分別收集抗氧化活性最高的組分D和次高的組分A，然后凍干。
將組分A進一步用反相高效液相色譜HPLC分離純化。用HPLC分離時，使用ODS柱(YMC ODS-AQ S-5 120，4.6×250mm，USA)。上樣量為20μL，采用含0.1％三氟酸(TFA)的乙腈溶液線性洗脫(乙腈從0 to 60％)，流速為0.9mL/min，洗脫時間30分鐘，215nm下檢測肽的出峰位置，如圖3(A)所示，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的抗氧化活性，如圖3(B)所示，收集含抗氧化活性最高的組分，即圖3(B)中標記為RSP的組分，凍干，用含0.05％三氟酸溶解，再次用HPLC進行分離，采用含0.05％三氟酸(TFA)的乙腈溶液線性洗脫(乙腈從0 to 30％)，流速為0.8mL/min，洗脫時間30分鐘。分離得到純的抗氧化活性組分后，使用液相色譜-質(zhì)譜連用法(HPLC-MS)測定肽的分子量為429.91(M+1為430.9098，如圖4所示)。用一前一后色譜(MS/MS)和氨基酸序列分析儀鑒定肽的氨基酸序列，鑒定出抗氧化肽的氨基酸序列為Gln-Gly-Ala-Arg(如圖5所示)。查找已發(fā)表的有關(guān)膠原蛋白的氨基酸序列，膠原蛋白的α1鏈上72-75或180-183片斷，從而進一步驗證了此抗氧化肽來源于膠原蛋白。
收集圖3(A)所示含抗氧化活性次高的組分。凍干，用含0.05％三氟酸溶解，再次用HPLC進行分離。使用液相色譜-質(zhì)譜連用法(HPLC-MS)測定肽的分子量為265.1，用一前一后色譜(MS/MS)和氨基酸序列分析儀鑒定肽的氨基酸序列，鑒定出抗氧化肽的氨基酸序列為Hyl-Cys，如圖6所示。
采用同樣的方法將組分D分離純化。分離得到2個抗氧化活性組分。用一前一后色譜(MS/MS)和氨基酸序列分析儀鑒定肽的氨基酸序列，鑒定出抗氧化肽的氨基酸序列為Leu-Gln-Gly-Met(分子量447.2)和Leu-Gln-Gly-Met-Hyp(分子量560.3)。實施例3、使用本發(fā)明的抗氧化肽作為抗氧化劑添加到醬油中醬油生產(chǎn)配方(重量比)如下A生醬油，5％，主料；B焦糖色素，按生產(chǎn)需要(0.05％左右)；C味精及[I+G]，兩者按重量比35～45∶1混合，0.6％～0.7％；D膠原蛋白源抗氧化肽，添加0.5％，可同時作營養(yǎng)強化劑和助鮮劑，提高產(chǎn)品氨基酸含量，增加鮮味；E乳酸，0.05％，風味劑，增加口感，提高營養(yǎng)；F甘草，0.008％，甜味劑，甜度為蔗糖200倍；I氯化鈉和氯化鉀，按生產(chǎn)需要(2-3％)，咸味劑；K尼泊金乙酯或丙酯，0.01～0.03％，防腐劑，延長產(chǎn)品保質(zhì)期。
膠原蛋白源抗氧化肽，可同時作營養(yǎng)強化劑和助鮮劑，既增加了常用調(diào)味料醬油的抗氧化功能，又提高產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量，此外還可以增加鮮味。可作為綠色、安全、健康的多功能食品配料。
實施例4、使用本發(fā)明的抗氧化肽作為抗氧化劑添加到化妝水中化妝水(按重量份百分比)配方如下甘油4％1，3-丁二醇 3.0％聚乙二醇400 5.0％抗氧化肽(可混合，也可使用單一成分)0.5-1％香精，防腐劑，適量余量為去離子水抗氧化肽可被皮膚迅速吸收，主要起清除自由基、防止黃褐斑等作用。
實施例5、使用本發(fā)明的抗氧化肽作為抗氧化劑添加到狗食中狗食配方如下以雞胸肉(49wt％)、大豆粉(27wt％)、精制面粉(24wt％)組成的混合物為基料，添加占基料重量6wt％的白砂糖，1-2wt％的膠原蛋白抗氧化肽溶液，添加0.5wt％的食鹽以突出風味，再加入2wt％的復(fù)合膨松劑(小蘇打40wt％，燒明礬52wt％，輕質(zhì)碳酸鈣3wt％，淀粉5wt％)進行擠壓膨化。
膠原蛋白抗氧化肽溶液作為新一代飼料用營養(yǎng)補充劑既能作為運輸鈣、鐵、鋅等微量元素的載體，提高微量元素的腸吸收效率和生物利用度，又能作為天然抗氧化劑起到清除體內(nèi)自由基的作用。活性肽溶液本身還可迅速補充動物蛋白營養(yǎng)，促進生長以及增強動物的免疫力等。
實施例6、使用本發(fā)明的抗氧化肽作為抗氧化劑添加到沐浴露中沐浴露(按重量份百分比)配方如下單十二烷基磷酸酯鉀鹽(Map-K) 12甜菜堿5’烷基葡糖苷A PG-20003.5烷基醇酰胺，2.0棕櫚酸異丙酯， 4.5十八醇 0.8
膠原蛋白抗氧化肽液(20％)10檸檬酸 適量硬脂酸乙二醇雙酯1.2CY-1防腐劑 適量香精適量去離子水余量抗氧化肽可被皮膚迅速吸收，主要起清除自由基、補充膠原蛋白等作用。
權(quán)利要求
1.一系列源自膠原蛋白的抗氧化肽，其具有如下之一的氨基酸序列(1)Hyl-Cys(2)Gln-Gly-Ala-Arg(3)Leu-Gln-Gly-Met(4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp
2.如權(quán)利要求1所述的源自膠原蛋白的抗氧化肽，其為通過多肽儀化學(xué)方法合成，或是通過將膠原蛋白水解，然后將獲得的水解產(chǎn)物分離純化而得。
3.如權(quán)利要求1所述的源自膠原蛋白的抗氧化肽，其特征在于所述的抗氧化肽是通過如下的方法水解得到1)使用蛋白酶對膠原蛋白進行一次或連續(xù)幾次的水解，得到含有多種抗氧化肽的混合物的前制品；2)將步驟1)得到的含有多種抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品進行沉淀或過濾，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和雜質(zhì)等的水解液；3)將步驟2)得到的抗氧化肽的混合物進行分離純化和鑒定；將水解液進行微過濾，濾去分子量小于200的分子，得到干物質(zhì)含量為20～40wt％的混合液；然后使用凝膠過濾色譜柱進行分離純化，采用去離子水或是20～50mM磷酸鈉緩沖溶液作為流動相，混合物中的肽依次洗脫出來，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的抗氧化活性，分別收集抗氧化活性高于50％的組分，然后用凍干機凍干成粉狀；將上述活性組分的凍干粉用0.5M tris-HCl緩沖液溶解，上樣到用該緩沖液平衡后的DEAE-Sephadex A-25色譜柱上進行分離純化，用緩沖液平衡和洗滌色譜柱，首先分離出來的將是未被吸附的肽；然后用NaCl溶液從0至0.5～1.0M進行梯度洗脫；混合物中的肽按酸堿性的強弱被流動相依次洗脫下來，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的抗氧化活性，分別收集抗氧化活性最高的組分和次高的組分，然后凍干；4)將步驟3)得到的組分用高效液相色譜進一步提純；將步驟3)得到的抗氧化活性高的2種組分合并后進一步用反相HPLC分離，用HPLC分離時，使用ODS柱，上樣量為20μL，采用含0.1％三氟酸的乙腈溶液線性洗脫，215nm下檢測肽的出峰位置，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫液的抗氧化活性，收集含抗氧化活性最高的組分，凍干，用含0.05％三氟酸溶解，再次用HPLC進行分離，分離得到純的活性組分；使用液相色譜-質(zhì)譜連用法測定肽的分子量，用一前一后色譜和氨基酸序列分析儀鑒定肽的氨基酸序列，查找已發(fā)表的有關(guān)膠原蛋白的氨基酸序列，進一步驗證此抗氧化肽的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的源自膠原蛋白的抗氧化肽作為抗氧化劑，用于保健品、食品添加劑、營養(yǎng)強化劑、動物用添加劑、化妝品、或日化用品。
5.一種權(quán)利要求1所述的源自膠原蛋白的抗氧化肽在保健品中的應(yīng)用，該抗氧化肽以口服或針劑的形式添加到由活性氧引起的各種疾病的預(yù)防及治療用的食品中，或是作為功能性配料添加到飲料、調(diào)味品及其他動植物類食品中。
6.一種權(quán)利要求1所述的源自膠原蛋白的抗氧化肽在用作營養(yǎng)強化劑中的應(yīng)用。
7.一種權(quán)利要求1所述的源自膠原蛋白的抗氧化肽在用作食品添加劑中的應(yīng)用。
8.一種權(quán)利要求1所述的源自膠原蛋白的抗氧化肽在動物用添加劑中的應(yīng)用，該抗氧化肽添加到飼料中或?qū)櫸锸称放浞街?，作為抗氧化劑或穩(wěn)定劑使用或是作為動物的營養(yǎng)強化劑使用。
9.一種權(quán)利要求1所述的源自膠原蛋白的抗氧化肽在化妝品中的應(yīng)用。
10.一種權(quán)利要求1所述的源自膠原蛋白的抗氧化肽在日化用品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一系列源自膠原蛋白的抗氧化肽，其具有如下之一的氨基酸序列(1)Hyl－Cys；(2)Gln－Gly－Ala－Arg；(3)Leu－Gln－Gly－Met；(4)Leu－Gln－Gly－Met－Hyp。該抗氧化肽可以通過多肽儀化學(xué)方法合成，也可以通過將膠原蛋白水解，然后將獲得的水解產(chǎn)物分離純化而得。本發(fā)明的抗氧化肽的抗氧化作用很強，不僅可以替代BHT等用作食品的添加劑，而且可以作為活性功能性成分。該產(chǎn)品可以用于食品、保健品、化妝品、甚至動物食品和飼料等，應(yīng)用范圍極其廣泛，社會效益和經(jīng)濟效益都很顯著。本發(fā)明的抗氧化肽是2～5個氨基酸的抗氧化肽，分子量小，更易被消化道直接吸收。
文檔編號A61K38/05GK101045744SQ20061006689
公開日2007年10月3日 申請日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者李博, 籍保平, 陳 峰 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)