專利名稱：紫草素的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫草素的新用途。
背景技術(shù)：
紫草性味苦寒，具有涼血活血、清熱解毒之功?！侗静萁?jīng)疏》載紫草能“祛濕熱利竅”，又言“苦寒性滑，故利九竅而通利水道也”；早在《千金翼方》中就記載用紫草一兩，為散，治小便卒淋；《證治準(zhǔn)繩》中用紫草治血淋；《證類本草》也記載紫草主心腹邪氣、五疸，補(bǔ)中益氣，利九竅，通水道。
在我國(guó)，新疆紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst.、紫草(Lithospermumerythrorhizon sieb.et Zucc.)或內(nèi)蒙紫草(Arnebia guttata Bunge)等幾種紫草分布較廣。紫草素可以從紫草的干燥根中提取得到，分子式為C16H16O5，分子量288，其結(jié)構(gòu)式如式I所示。紫草素為紫色粉末，味特異微苦，沒有引濕性，熔點(diǎn)為148～149℃(國(guó)家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站，植物藥有效成分手冊(cè)，1986，956頁)。
(式I)在現(xiàn)有技術(shù)中，醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的多是紫草中油溶性的紫草萘醌類成分，稱為紫草油。紫草油有清熱、消腫、止痛、消炎之功。張興鎮(zhèn)等采用紫草外涂并中醫(yī)結(jié)合治療燒傷(張興鎮(zhèn)，王秀萍。中西醫(yī)結(jié)合以紫草油外涂治療燒燙傷285例臨床觀察。中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986；6(11)695)；陳曉秋等采用紫草油紗條治療骨髓炎(陳曉秋等。紫草油骨外科應(yīng)用之妙。中醫(yī)藥信息，1994；243)；楊葆雅、周青梅等用紫草油治療宮頸糜爛(紫草油治療宮頸糜爛臨床療效觀察中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986；6(4)237)；高秀云等報(bào)道，應(yīng)用紫草油外用治療灼傷、外傷等(高秀云等，紫草油外用3則，中醫(yī)藥信息，1995；221)；中村恭政等采用紫草軟膏治療口腔粘膜病，有效率89.7％(中村恭政等，齒界展望。57(7)1351，1981)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供紫草素的新用途。
本發(fā)明發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紫草素具有治療前列腺炎的功效，能用于制備治療前列腺炎的藥物。本發(fā)明所說的紫草素既包括左旋紫草素，又包括右旋紫草素。
需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑等。
該藥物的劑型可以是多種多樣的，可以是栓劑、片劑、膠囊劑等多種劑型，但主要以栓劑為優(yōu)選，各種劑型均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
當(dāng)本發(fā)明的藥物為栓劑時(shí)，其基本由紫草素和栓劑基質(zhì)組成，一般情況下，所述紫草素占所述栓劑重量的0.5-1.5％，余量為栓劑基質(zhì)；所述栓劑基質(zhì)由50-70％重量的半合成脂肪酸甘油酯，10-30％重量的液體石蠟和15-25％重量的凡士林組成。
其中，紫草素優(yōu)選占栓劑重量的1％，栓劑基質(zhì)優(yōu)選由70％重量的半合成脂肪酸甘油酯，10％重量的液體石蠟和20％重量的凡士林組成。
栓劑采用肛門外用給藥方式，用藥前將肛門周圍洗凈，然后將栓塞入肛門深部即可，一般情況下其每粒栓劑為0.9g，一次一粒，一日兩次，以一個(gè)月為一個(gè)療程。
本發(fā)明的發(fā)明人創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)了作為中藥紫草的提取物紫草素，具有治療前列腺炎的活性，以之為主要成分的藥物，有抗菌、抗炎、解熱、利尿作用，治療前列腺炎的效果明顯，并且毒性小，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為紫草素的提取工藝流程圖；圖2為紫草素的薄層鑒定色譜圖；圖3為本發(fā)明栓劑的制備工藝流程圖；圖4為本發(fā)明栓劑的薄層鑒定色譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、紫草素的提取以及栓劑的制備一、紫草素的提取與鑒定從紫草中提取紫草素的工藝流程圖如圖1所示，具體可以按照如下過程進(jìn)行稱取紫草100g(北京同仁堂長(zhǎng)春分店，紫草素含量為2.096％)，加石油醚800ml，冷浸24小時(shí)，加0.25mol/L氫氧化鈉800ml萃取1次，分取堿液層，放置24小時(shí)，加入0.5mol/L硫酸1600ml，沉淀抽濾，水洗至中性，置于90℃干燥，即得含量為90％左右的紫草素。
取上述樣品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為供試品溶液。另取左旋紫草素對(duì)照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層層析法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(5∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，其結(jié)果如圖2所示，圖中1為左旋紫草素對(duì)照品，2為所得紫草素，3為陰性對(duì)照。由圖可見，所得到的紫草素樣品在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，表明采用上述方法提取得到的是紫草素。
二、本發(fā)明栓劑的制備以紫草素為主要藥物成分的治療前列腺炎的藥物栓劑，其制備工藝如圖3所示，具體可按照如下過程進(jìn)行操作稱取所提取得到的紫草素9.0g，置于乳缽中研磨，過80目篩。取半合成脂肪酸甘油酯630g、液體石蠟90g、凡士林180g置于水浴(60℃)上加熱熔化，將藥粉撒于已熔融的基質(zhì)中，充分?jǐn)噭颍厰嚢柽厓A入涂有脫模劑(液體石蠟)的栓模中，至略溢出?？跒橹埂＠鋮s后取出，可制成1000粒本發(fā)明栓劑。
取上述本發(fā)明栓劑1粒，置于離心管中，加入乙醇10ml，50℃水浴加熱溶解，自然冷卻，離心，濾過，置10ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度。另取左旋紫草素對(duì)照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層層析法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(5∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，結(jié)果如圖4所示，圖中1為左旋紫草素對(duì)照品，2為本發(fā)明栓劑，3為陰性對(duì)照。該栓劑在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)。
實(shí)施例2、本發(fā)明栓劑的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料1、藥物本發(fā)明栓劑實(shí)施例1所述制備，0.9g/枚(含紫草素9mg/枚栓劑)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定小鼠劑量為0.48、0.24、0.12g/Kg，含紫草素分別為4.8、2.4、1.2mg/Kg(約相當(dāng)于小鼠LD50的1/160、1/320、1/640、)；大鼠劑量為0.32、0.16、0.08g/Kg，含紫草素分別為3.2、1.6、0.8mg/Kg。實(shí)驗(yàn)前用基質(zhì)在37℃水浴配制成適宜濃度供實(shí)驗(yàn)用；
前列安栓2g/枚，衛(wèi)藥準(zhǔn)字Z-056號(hào)，由麗珠集團(tuán)麗珠中藥廠出品，生產(chǎn)批號(hào)020522，實(shí)驗(yàn)前用溫水在37℃配制成適宜濃度供實(shí)驗(yàn)用；消炎痛栓(吲哚美辛栓)0.1g/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字H42021462，湖北東信藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)030601，試驗(yàn)前用基質(zhì)配制成適宜濃度備用；對(duì)乙酰氨基酚栓0.15g/枚，國(guó)藥準(zhǔn)字H44024867，廣州敬修堂(藥業(yè))股份有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)030107，試驗(yàn)前用基質(zhì)配制成適宜濃度備用；呋塞米片，20mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020163，天津力生制藥股份有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)0303004，試驗(yàn)前用生理鹽水配制成適宜濃度備用；消痔靈注射液，10ml/支，中國(guó)吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)011027；前列康舒膠囊，國(guó)藥準(zhǔn)字B200020078，吉林省鎮(zhèn)賚銀諾克藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20041005；角叉菜膠，沈陽藥學(xué)院提供，批號(hào)020215；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，批號(hào)011004。
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，體重140-160g，180-200g，280-320g雄性，吉林省藥品檢驗(yàn)所動(dòng)物室提供，合格證編號(hào)10-1009。
昆明種小鼠，18-22g，25-28g，雄性，長(zhǎng)春生物制品所動(dòng)物室提供，合格證編號(hào)10-1001。
3、實(shí)驗(yàn)菌種國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株金黃色葡萄球菌ATCC25925，大腸埃希菌ATCC25922。
臨床分離普通株金黃色葡萄菌15株，人腸埃希菌17株，肺炎克雷伯桿菌18株，銅綠假單胞菌14株，普通變星桿菌9株，淋病奈瑟菌6株，乙型溶血鏈球菌8株，變形鏈球菌6株。
二、本發(fā)明栓劑的抗炎作用1、對(duì)角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的影響該實(shí)驗(yàn)的具體方法可參照文獻(xiàn)(李儀奎，中藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]，上?？茖W(xué)技出版社，1991353，312289-292)進(jìn)行。
大鼠50只，體重120-140g，雄性，均分為5組，每組10只，按表1所示劑量直腸給藥(灌胃器進(jìn)入直腸1.5cm)，給藥前禁食12h，0.2ml/只，對(duì)照組給相同體積基質(zhì)，給藥后即刻以海綿栓塞入肛門固定(海綿球包裹聚乙烯薄膜，用鑷子夾緊放入肛門內(nèi))，4h后取出，每天一次，共7d，末次給藥后1h，于大鼠右后足跖底部腱膜下注射1％角叉菜膠0.1ml/只致炎，測(cè)量致炎前及致炎后1、2、3、4、5h右后足跖厚度，以致炎前后足跖差值作為腫脹程度。結(jié)果見表1。
表1對(duì)角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的影響 (x±s，n＝10)

注與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表1可見，本發(fā)明栓劑各組分別在致炎后2-4小時(shí)作用明顯，與對(duì)照組比較具有顯著差異性。
2、對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響該實(shí)驗(yàn)的具體方法可參照文獻(xiàn)(李儀奎，中藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]，上?？茖W(xué)技出版社，1991353，312289-292)進(jìn)行。
小鼠50只，體重25-28g，雄性，均分為5組，每組10只，按表2所示劑量直腸給藥，給藥前禁食12h，0.05ml/只，對(duì)照組給相同體積基質(zhì)，給藥后即刻以海綿栓塞入肛門固定，4h后取出，每日一次，共7d，末次給藥后1h，每鼠左耳前后兩面涂二甲苯0.05ml，4h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下雙耳，用9mm直徑打孔器，打下耳片稱重，計(jì)算每組小鼠腫脹程度(左耳片重-右耳片重)，及腫脹率((左耳片重-右耳片重)/右耳片重)。結(jié)果見2表。
表2對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 (x±s，n＝10)


注與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表2可見，本發(fā)明栓劑各給藥組對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹程度和腫脹率有明顯抑制作用，與對(duì)照組比較有顯著差異。
3、對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響該實(shí)驗(yàn)的具體方法可參照文獻(xiàn)(李儀奎，中藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]，上海科學(xué)技出版社，1991353，312289-292)進(jìn)行。
大鼠50只，體重140-160g，雄性，用乙醚麻醉，在無菌條件下腹部切口，將兩個(gè)滅菌棉球(每個(gè)重10mg，經(jīng)高壓滅菌，每個(gè)棉球再加氨芐青霉素1mg/0.1ml，50℃烘箱烤干)分別植入大鼠兩側(cè)腋窩皮下，術(shù)后當(dāng)天開始按表3所示劑量分組直腸給藥，給藥前禁食12h，0.2ml/只，對(duì)照組給相同體積基質(zhì)，給藥后即刻以海綿栓塞入肛門固定，4h后取出，每天一次，共7d，第8天頸椎脫臼處死，取出棉球，60℃烘12h，稱重，減去原棉球重量，即為肉芽腫重量，并計(jì)算抑制率。結(jié)果見表3。
表3對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響(x±s，n＝10)

注與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01由表3可見，本發(fā)明栓劑各劑量組對(duì)大鼠棉球肉芽腫均有明顯抑制作用，與對(duì)照組比較具有顯著差異。
二、本發(fā)明栓劑鎮(zhèn)痛作用對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)的影響，該實(shí)驗(yàn)的具體方法可參照文獻(xiàn)(李儀奎，中藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]，上海科學(xué)技出版社，1991353，312289-292)進(jìn)行。
小鼠50只，體重20-22g，雄性，隨機(jī)均分5組，按表4所示劑量分別直腸給藥，給藥前禁食12h，0.05ml/只，對(duì)照組給相同體積基質(zhì)，給藥后即刻以海綿栓塞入肛門固定，4h后取出，每日一次，連續(xù)7日，末次給藥后1h，每鼠腹腔注射0.7％冰醋酸0.1ml/10g，記錄注射致痛劑后5-15min內(nèi)的扭體反應(yīng)次數(shù)。結(jié)果見表4。
表4 對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)的影響(x±s，n＝10)

注與對(duì)照組比較P＜0.05，***P＜0.001由表4可見，本發(fā)明栓劑0.48g/Kg組對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)有明顯抑制作用，抑制率為20.3％，與對(duì)照組比較具有顯著差異性。
三、對(duì)酵母所致大鼠發(fā)熱的影響該實(shí)驗(yàn)的具體方法可參照文獻(xiàn)(李儀奎，中藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]，上海科學(xué)技出版社，1991353，312289-292)進(jìn)行。
大鼠體重150-180g，雄性，選取連續(xù)測(cè)三日體溫，變化不超過0.3℃的大鼠50只，隨機(jī)均分5組，實(shí)驗(yàn)前禁食14h，將栓劑置37℃水浴融化，分別直腸給予對(duì)乙酰基氨基酚栓0.03g/Kg，本發(fā)明栓劑0.32、0.16、0.08g/Kg，0.2ml/只，對(duì)照組給同體積基質(zhì)。給藥后立刻于大鼠背部皮下注射25％干酵母混懸液10ml/kg，致熱后3h給藥一次，然后于4、6、8、10h各測(cè)體溫一次，結(jié)果見表5。
表5.對(duì)酵母所致大鼠發(fā)熱的影響(x±s，n＝10)


注與對(duì)照組比較*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001由表5可見，本發(fā)明栓劑高、中、低劑量組對(duì)酵母所致大鼠體溫升高有明顯的抑制作用。
四、對(duì)水負(fù)荷大鼠排尿量的影響大鼠50只，體重170-200g，雄性，均分5組，預(yù)先在代謝籠中適應(yīng)1天，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水18h。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)輕壓下腹，排盡余尿，陽性藥組(因未選到適合直腸給藥的陽性藥，而選用口服制劑)ig生理鹽水配制的呋塞米0.01g/Kg，5.0ml/100g，其它各組ig生理鹽水5.0ml/100g體重，本發(fā)明栓劑直腸給藥0.2ml/只，給藥劑量如表6所示，給藥后即刻以海綿栓塞入肛門固定，并立刻將大鼠放入代謝籠中，分別收集記錄2h和5h尿液量。結(jié)果見表6。
表6.對(duì)水負(fù)荷大鼠排尿的影響(x±s，n＝10)

注與對(duì)照組比較*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001由表6可見，本發(fā)明栓劑各劑量組，對(duì)水負(fù)荷大鼠排尿量均有明顯的促進(jìn)作用，與對(duì)照組比較具有較顯著的差異性。
五、大鼠非細(xì)菌性前列腺炎的影響該實(shí)驗(yàn)的具體方法可參照文獻(xiàn)(張亞強(qiáng)，劉猷枋，于靈惠等。中藥前列腺湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性前列腺炎病理模型的影響[J]。中西醫(yī)結(jié)合雜志，1991，(8)480-481.；雷久士，郭子華，朱曉明等。前炎清對(duì)大鼠前列腺炎模型病理改變的影響[J]。湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，48(2)22-23.)進(jìn)行。
大鼠60只，體重280-320g，雄性。按文獻(xiàn)方法，乙醚麻醉，無菌手術(shù)操作，動(dòng)物下腹正中切口約2-3cm，直達(dá)腹腔，提出膀胱及兩側(cè)儲(chǔ)精囊，暴露附于精囊內(nèi)側(cè)的前列腺背葉，除對(duì)照組10只注射0.2ml滅菌生理鹽水外，其余均雙側(cè)分別注射25％消痔靈注射液0.2ml，隨即送復(fù)腹腔，縫合。于造型后第3天，開始分組直腸給藥，0.2ml/只，給藥前禁食不禁水12小時(shí)，對(duì)照組給相同體積基質(zhì)，給藥后即刻以海綿栓塞入肛門固定，4h后取出，每日一次，連續(xù)30天，末次給藥后24h，稱量體重，處死大鼠。摘取前列腺，進(jìn)行解剖觀察，稱取前列腺濕重，計(jì)算前列腺指數(shù)，并用10％福爾馬林溶液固定，進(jìn)行組織學(xué)觀察，按半定量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果進(jìn)行Ridit分析。結(jié)果見表7、表8。
表7.對(duì)大鼠非細(xì)菌性前列腺炎前列腺指數(shù)的影響 (x±s，n＝10)

注與對(duì)照組比較△P＜0.05△△△P＜0.001與模型組比較*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001由表7可見，本發(fā)明栓劑各劑量組及前列安栓組對(duì)消痔靈引起的前列腺炎模型的前列腺指數(shù)均具有非常顯著的抑制作用。
解剖觀察對(duì)照組大鼠前列腺腺體組織柔軟，淺紅色，有光澤，有彈性，與周圍組織無粘連。模型組前列腺腺體明顯增大，與周圍組織粘連較重，部分組織表面可見暗紅色或灰白色結(jié)節(jié)。前列安栓組腺體中度增大，與周圍組織有粘連，彈性差，部分組織表面暗紅，其程度較模型組明顯減輕。本發(fā)明栓劑高劑量組腺體腫脹減輕與周圍組織粘連較輕，腺體較柔軟且表面有光澤。本發(fā)明栓劑中、低劑量組腺體腫脹、彈性及粘連程度隨劑量降低而加重。
病理組織學(xué)觀察對(duì)照組大鼠前列腺腺腔大小不一，腺上皮表面形成很多皺襞，使腺腔很不規(guī)則，腺泡上皮多為單層柱狀或立方，個(gè)別呈假?gòu)?fù)層，腺腔中可見大量深粉染之分泌物，有的形成前列腺凝結(jié)物，為正常組織學(xué)結(jié)構(gòu)；除對(duì)照組外其它各組出現(xiàn)不同程度的病變，前列腺間質(zhì)內(nèi)可見不同數(shù)量的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)；甚至由于炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織增生，使間質(zhì)明顯增寬。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下切片中無明顯的病理改變，為“-”；病理改變范圍占全視野的1/4以下，為“+”；病理改變明顯，范圍占全視野的1/4-1/2以上，為“++”；病理改變程度嚴(yán)重，范圍占全視野的1/2以上，為“+++”。
本發(fā)明栓劑及前列安栓對(duì)大鼠前列腺組織發(fā)生的炎細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維結(jié)締組織增生、腺體分泌物減少有顯著的改善作用，結(jié)果見表8。
表8對(duì)非細(xì)菌性前列腺炎大鼠病理組織學(xué)改變的影響

注與對(duì)照組比較△△△P＜0.001與模型組比較**P＜0.01***P＜0.001可見，本發(fā)明栓劑各給藥組及前列安栓組與模型組比較，對(duì)注射消痔靈大鼠的前列腺組織發(fā)生的炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體分泌不良、纖維組織增生均有不同程度的改善。
六、對(duì)大鼠細(xì)菌性前列腺炎的影響大鼠60只，體重280-320g，雄性，均分6組，每組10只，按表8所示劑量直腸給藥，0.2ml/只，方法同上，每天1次，連續(xù)7日，第4日按文獻(xiàn)方法，乙醚麻醉，無菌手術(shù)操作，動(dòng)物下腹正中切口約2-3cm，直達(dá)腹腔，提出膀胱及兩側(cè)儲(chǔ)精囊，暴露附于精囊內(nèi)側(cè)的前列腺背葉，除對(duì)照組注射0.2ml/只滅菌生理鹽水外，其余均注射1.4×107個(gè)/ml大腸桿菌(臨床分離株)，0.2ml/只，隨即送復(fù)腹腔，縫合。48h后處死動(dòng)物，打開腹腔，摘取前列腺，取10μl前列腺按摩液，用白細(xì)胞稀釋液稀釋20倍，于顯微鏡下數(shù)白細(xì)胞數(shù)。另取10μl于顯微鏡下數(shù)卵磷脂小體數(shù)。同時(shí)置電子天平稱濕重，計(jì)算前列腺指數(shù)，并用10％福爾馬林溶液固定，進(jìn)行組織學(xué)觀察，按半定量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果進(jìn)行Ridit分析，結(jié)果見表9、表10、表11。
表9.對(duì)大鼠細(xì)菌性前列腺炎的影響(x±s，n＝10)

注與對(duì)照組比較△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001與模型組比較*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001由表9可見，本發(fā)明栓劑0.32、0.16g/Kg組及前列安栓0.18g/Kg組與大腸桿菌所致前列腺炎癥模型組比較可增加前列腺中卵磷脂小體的含量，減少白細(xì)胞數(shù)。
表10.對(duì)大鼠細(xì)菌性前列腺炎前列腺指數(shù)的影響(x±s，n＝10)


注與對(duì)照組比較ΔP＜0.05 △△△P＜0.001與模型組比較*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001由表10可見，本發(fā)明栓劑高劑量組及前列安栓組對(duì)細(xì)菌性前列腺炎模型腺體增加有明顯抑制作用。
病理組織學(xué)觀察大鼠前列腺腺腔大小不一，腺上皮表面形成很多皺襞，使腺腔很不規(guī)則，腺泡上皮多為單層柱狀或立方，個(gè)別呈假?gòu)?fù)層，腺腔中可見大量深粉染之分泌物，有的形成前列腺凝結(jié)物，為正常組織學(xué)結(jié)構(gòu)；除正常對(duì)照組外，其它各組前列腺及數(shù)囊間質(zhì)有不同數(shù)量的中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞，少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，甚至前列腺精囊腔內(nèi)可見少量膿細(xì)胞，有處可見慢性炎性肉芽組織形成。腺腔分泌物不同程度的減少，呈淡紅色染色，有的腺腔內(nèi)無分泌物。判定分標(biāo)準(zhǔn)同前，結(jié)果見表11。
表11.對(duì)細(xì)菌性前列腺炎大鼠病理組織學(xué)改變的影響

注與模型組比較*P＜0.05**P＜0.01與對(duì)照組比較△△P＜0.05△△△P＜0.001可見，本發(fā)明栓劑各劑量組及前列安栓組與模型組比較，可明顯減輕前列腺病變程度。
七、對(duì)其他大鼠前列腺模型的影響1、對(duì)角叉菜膠所致非細(xì)菌性前列腺炎的影響取大鼠70只(250-300g)隨機(jī)分成7組，分別為空白對(duì)照組(A組)，模型對(duì)照組(B組)，前列康舒1.6g/kg(C組)，本發(fā)明栓劑(ig)30mg/kg、15mg/kg組(D、E組)，本發(fā)明栓劑(ip)5mg/kg、2.5mg/kg組(F、G組)。C、D、E組動(dòng)物ig給藥，A、B組給同體積水(20ml/Kg)；F、G組ip給藥(5ml/kg)。動(dòng)物連續(xù)給藥8天，末次給藥后1小時(shí)按文獻(xiàn)方法(戴蘇林，等.中成藥，1990；12(8)27)，動(dòng)物以乙醚麻醉，無菌條件下剖開腹腔，通過儲(chǔ)精囊向前列腺內(nèi)注入滅菌1％角叉菜膠0.1ml(A組注射無菌生理鹽水)，縫合。于手術(shù)24小時(shí)后斷頭處死大鼠，取致炎前列腺50mg加入200ul白細(xì)胞稀釋液和200ul生理鹽水中，充分混勻，鏡下記錄白細(xì)胞數(shù)及卵磷質(zhì)小體密度，并取前列腺作病理檢查。結(jié)果見表12。
表12對(duì)交叉菜膠所致大鼠非細(xì)菌前列腺炎的影響(n＝10，X±S)

注與空白對(duì)照組比較#P＜0.05##P＜0.01###P＜0.001與模型對(duì)照組比較*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001結(jié)果表明，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，前列腺內(nèi)白細(xì)胞明顯增多，卵磷質(zhì)小體明顯減少，模型對(duì)照組出現(xiàn)大量白細(xì)胞浸潤(rùn)，空白對(duì)照組無白細(xì)胞浸潤(rùn)；同模型對(duì)照組比較，前列康舒及本發(fā)明栓劑各組均可明顯減少白細(xì)胞數(shù)，增加卵磷質(zhì)小體密度，有顯著差異。
病理檢查發(fā)現(xiàn)前列康舒及本發(fā)明栓劑各組，細(xì)胞浸潤(rùn)與模型對(duì)照組比較明顯減少。
2、對(duì)大腸桿菌所致大鼠細(xì)菌性前列腺炎的影響取250-300g大鼠70只，隨機(jī)分成7組同上，動(dòng)物連續(xù)灌胃給藥8天。第5天給藥后1小時(shí)，按文獻(xiàn)方法(戴蘇林，等。中國(guó)中藥雜志，1991；16(9)562)以0.1ml大腸桿菌(1.4×107/ml)致炎(方法同上)，致炎72小時(shí)后斷髓處死大鼠，分別無菌取前列腺50mg加入200ul白細(xì)胞稀釋液和200ul生理鹽水中，鏡檢，記錄白細(xì)胞數(shù)及卵磷質(zhì)小體密度，同時(shí)取前列腺作病理檢查，結(jié)果見表13。
表2對(duì)交叉菜膠所致大鼠細(xì)菌前列腺炎的影響(n＝10，X±S)

注與空白對(duì)照組比較#P＜0.05##P＜0.01###P＜0.001與模型對(duì)照組比較*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001結(jié)果表明，前列康舒及本發(fā)明栓劑各組，對(duì)大腸桿菌所致大鼠細(xì)菌性前列腺炎有明顯抑制作用，本發(fā)明栓劑ig30mg/kg組及ip5mg/kg組均可明顯減少白細(xì)胞數(shù)，增加卵磷質(zhì)小體密度，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異。
上述結(jié)果表明，紫草素對(duì)角叉菜膠、大腸桿菌所致大鼠非細(xì)菌性和細(xì)菌性前列腺炎具有明顯的抑制作用，能明顯提高卵磷脂小體密度，明顯降低前列腺白細(xì)胞數(shù)，具有良好的治療前列腺炎活性。
八、抗菌實(shí)驗(yàn)1、體內(nèi)抗菌試驗(yàn)該實(shí)驗(yàn)的具體方法可參照文獻(xiàn)(李儀奎，中藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]，上?？茖W(xué)技出版社，1991353，312 289-292)進(jìn)行。
小鼠200只，體重20-22g，雄性，隨機(jī)均分10組，每組20只，按表12所示劑量直腸給藥2次間隔6h，第一次給藥后1h，將預(yù)試驗(yàn)已測(cè)得最小致死量(100％MLD)的金黃色葡萄球菌(ATCC25925)、大腸埃希菌(ATCC25922)菌液以最小致死量(100％MLD)感染各鼠，腹腔注射0.5ml/只，觀察5日內(nèi)動(dòng)物死率和存活時(shí)間，結(jié)果見表14。
表14.體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)(x±s，n＝20)


注與對(duì)照組比較*P＜0.05由表14可見，本發(fā)明栓劑高劑量組及前列安栓組可延長(zhǎng)感染大腸埃希菌的生存時(shí)間，對(duì)大腸埃希菌在體內(nèi)有一定的抑制作用，但對(duì)金黃色葡萄球菌生存時(shí)間及死亡率無明顯影響。
2、體外抗菌實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基用于培養(yǎng)乙型溶血性鏈球菌；巧克力瓊脂培養(yǎng)基用于培養(yǎng)淋病奈瑟菌和變形鏈球菌；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于培養(yǎng)其他細(xì)菌。
將藥物在無菌條件下，研磨成粉狀，用少量助溶劑溶解后，采用無菌蒸餾水制成溶液，將該溶液與培養(yǎng)基按倍比稀釋進(jìn)行混合，使培養(yǎng)基中的藥物濃度分別為64，32，16，8，4，2，1，0.5mg/ml。將固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的細(xì)菌，用無菌生理鹽水將細(xì)菌洗脫，校正菌液濃度，使其相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)瞎艿幕鞚岫?，再稀?∶100倍備用。用接種環(huán)取已校正濃度的待檢菌液接種于培養(yǎng)基表面，置孵箱37℃，18-24小時(shí)(淋病奈瑟菌，乙型溶血性鏈球菌和變形鏈球菌和變形鏈球菌置CO2孵箱24-48小時(shí))觀察結(jié)果。對(duì)所試菌株的MIC見表15。
表15本發(fā)明栓劑劑對(duì)所試菌株的MIC測(cè)定結(jié)果


由表15可見，本發(fā)明栓劑劑對(duì)金黃色葡萄球菌(ATCC25925)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、淋病奈瑟菌及乙型溶血性鏈球菌有不同的抑制作用，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的抑制效果較明顯。
由如上實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明栓劑高、中、低劑量直腸給藥，能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足腫脹和大鼠棉球肉芽腫。本發(fā)明栓劑高劑量組能明顯減少醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)；本發(fā)明栓劑高、中、低劑量組，均能明顯降低酵母所致大鼠體溫的升高；本發(fā)明栓劑各劑量組，對(duì)水負(fù)荷大鼠排尿量均有明顯的促進(jìn)作用。本發(fā)明栓劑各劑量組對(duì)消痔靈所致大鼠前列腺炎模型有明顯抑制作用，可降低前列腺指數(shù)，減輕病變程度；與大鼠細(xì)菌性前列腺炎癥模型組比較，本發(fā)明栓劑各給藥劑量組可增加前列腺中卵磷脂小體含量，減少白細(xì)胞數(shù)，降低前列腺指數(shù)，減輕前列腺病變程度；體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)可明顯延長(zhǎng)感染大腸桿菌小鼠的生存時(shí)間；體外可對(duì)金黃色葡萄球菌(ATCC25925)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、淋病奈瑟菌及乙型溶血性鏈球菌有不同的抑制作用。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的本發(fā)明栓劑有抗菌、抗炎，解熱、利尿作用，可改善動(dòng)物前列腺炎模型病變程度，是臨床用于清熱解毒、利尿通淋，治療急慢性前列腺炎的藥理學(xué)基礎(chǔ)。
實(shí)施例3、紫草素的急性毒性試驗(yàn)藥物實(shí)施例1所得紫草素；實(shí)驗(yàn)前在37℃水浴下用基質(zhì)配制成所需濃度供直腸給藥，或用1％CMC及注射溶媒配制成所需濃度供灌胃及注射給藥。
動(dòng)物昆明種小白鼠6周齡，體重19-21g，雌雄各半，購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所動(dòng)物室，小鼠合格證號(hào)10-1001。Wistar大鼠，體重120-130g，雌雄各半，購(gòu)自吉林省藥品檢驗(yàn)所動(dòng)物室，大鼠合格證號(hào)10-1009。
一、直腸給藥LD50的測(cè)定選取健康小鼠60只，雌雄各半，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，隨機(jī)等分為6組，劑量見表16。小鼠禁食(不禁水)16小時(shí)，直腸給藥0.05ml/20g，灌胃器進(jìn)入直腸1.5cm，給完藥后立即用海綿栓(海綿球包裹聚乙烯薄膜，用鑷子夾緊放入肛門內(nèi))固定，4小后取出。觀察7日內(nèi)，小鼠外觀行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、飲食、大小便及其顏色、皮毛、膚色、呼吸、鼻、耳、眼、口腔有無異常分泌物，體重變化及死亡等情況。結(jié)果見表16。
表16.紫草素小鼠直腸給藥LD50測(cè)定

在給藥后，動(dòng)物表現(xiàn)安靜、少動(dòng)、豎毛、死亡前呼吸徐緩，糞便為黑色，鼻、眼、口腔無異常分泌物。6小時(shí)后動(dòng)物出現(xiàn)死亡，死亡時(shí)間主要集中在8-30h之間。死亡小鼠解剖肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器均無明顯異常變化，做病理組織學(xué)檢查未見明顯病理改變。7日后處死剩余動(dòng)物，解剖肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎均無異常變化，病理組織學(xué)檢查未見明顯病理改變。統(tǒng)計(jì)小鼠死亡數(shù)，用Bliss法計(jì)算LD50值及95％可信限，小鼠直腸給藥LD50為763.6mg/kg，95％可信限為650.4～896.4mg/kg。
取健康大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)等分5組，實(shí)驗(yàn)前禁食16h，直腸給藥，0.2ml/120g，劑量見表2，灌胃器進(jìn)入直腸1.5cm，給完藥后立即用海綿栓塞入肛門固定，4小后取出。觀察7日內(nèi)，大鼠外觀行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、飲食、大小便及其顏色、皮毛、膚色、呼吸、鼻、耳、眼、口腔有無異常分泌物，體重變化及死亡等情況。結(jié)果見表17。
表17紫草提取物大鼠直腸給藥LD50測(cè)定

給藥20min后動(dòng)物出現(xiàn)中毒反應(yīng)，主要表現(xiàn)為動(dòng)物活動(dòng)減少、精神萎靡、被毛蔬松、呼吸困難，糞便為黑色，鼻、眼、口腔無異常分泌物，死亡時(shí)間在6-26h之間。動(dòng)物最高死亡率為50％，未能測(cè)出大鼠LD50值。
二、口服給藥LD50測(cè)定選取健康小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)等分為6組，實(shí)驗(yàn)前禁食16h，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別灌胃給予不同劑量紫草素，體積均為40ml/Kg，觀察7日內(nèi)小鼠外觀行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、飲食、大小便及其顏色、皮毛、膚色、呼吸、鼻、耳、眼、口腔有無異常分泌物，體重變化及死亡等情況。結(jié)果見表18。
表18.紫草素小鼠灌胃給藥LD50測(cè)定

在給藥后動(dòng)物表現(xiàn)安靜、少動(dòng)、豎毛、死亡前呼吸徐緩、給藥30分鐘后排尿?yàn)樽仙S便為黑色，10小時(shí)后動(dòng)物有死亡，死亡時(shí)間主要集中在12-30小時(shí)之間。死亡動(dòng)物解剖肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎均無異常變化，做病理組織學(xué)檢查未見明顯病理改變。7日后處死剩余動(dòng)物，解剖肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎均無異常變化，做病理組織學(xué)檢查未見明顯病理改變。統(tǒng)計(jì)動(dòng)物死亡數(shù)，用Bliss法計(jì)算LD50值及95％可信限，小鼠灌胃給藥LD50為6.319g/kg，95％可信限為4.791～8.334g/kg。
三、注射給藥LD50測(cè)定選取健康小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)等分為5組，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別腹腔注射給予不同劑量紫草提取物，體積均為5ml/Kg，觀察7日內(nèi)小鼠外觀行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、飲食、大小便及其顏色、皮毛、膚色、呼吸、鼻、耳、眼、口腔有無異常分泌物，體重變化及死亡等情況。結(jié)果見表19。
表19紫草提取物小鼠腹腔注射給藥LD50測(cè)定

在給藥10min后出現(xiàn)中毒反應(yīng)，主要表現(xiàn)為動(dòng)物活動(dòng)減少、精神萎靡、被毛蔬松、呼吸困難，5h后動(dòng)物有死亡，死亡時(shí)間主要集中在8-24h之間。死亡動(dòng)物解剖肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎均無異常變化。7日后處死剩余動(dòng)物，解剖肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎均無異常變化。統(tǒng)計(jì)動(dòng)物死亡數(shù)，用Bliss法計(jì)算LD50值及95％可信限，小鼠腹腔注射給藥LD50為12.06mg/kg，95％可信限為10.48～13.89mg/kg。
選取健康大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)等分為5組，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別腹腔注射給予不同劑量紫草提取物，體積均為5ml/Kg，觀察7日內(nèi)小鼠外觀行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、飲食、大小便及其顏色、皮毛、膚色、呼吸、鼻、耳、眼、口腔有無異常分泌物，體重變化及死亡等情況。結(jié)果見表20。
表20紫草提取物大鼠腹腔注射給藥LD50測(cè)定

在給藥10min后出現(xiàn)中毒反應(yīng)，主要表現(xiàn)為動(dòng)物活動(dòng)減少、精神萎靡、被毛蔬松、呼吸困難，5h后動(dòng)物有死亡，死亡時(shí)間主要集中在8-24h之間。死亡動(dòng)物解剖肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎均無異常變化。7日后處死剩余動(dòng)物，解剖肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎均無異常變化。統(tǒng)計(jì)動(dòng)物死亡數(shù)，用Bliss法計(jì)算LD50值及95％可信限，大鼠腹腔注射給藥LD50為9.635mg/kg，95％可信限為8.251～11.25mg/kg。
小鼠直腸給藥紫草提取物L(fēng)D50為763.6mg/kg，95％可信限為650.4～896.4mg/kg；灌胃給予紫草提取物L(fēng)D50為6.319g/kg，95％可信限為4.791～8.334g/kg；小鼠腹腔注射給藥LD50為12.06mg/kg，95％可信限為10.48～13.89mg/kg。大鼠直腸給藥及灌胃給藥未測(cè)出LD50值；腹腔注射給藥LD50為9.635mg/kg，95％可信限為8.251～11.25mg/kg。
綜上所述，紫草素對(duì)前列腺炎具有治療活性，以之為主要成分的栓劑對(duì)各種前列腺炎模型具有良好的治療效果。
權(quán)利要求
1.紫草素在制備治療前列腺炎藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療前列腺炎藥物為栓劑。
3.一種治療前列腺炎的栓劑，基本由紫草素和栓劑基質(zhì)組成，所述紫草素占所述栓劑重量的0.5-1.5％，余量為栓劑基質(zhì)；所述栓劑基質(zhì)由50-70％重量的半合成脂肪酸甘油酯，10-30％重量的液體石蠟和15-25％重量的凡士林組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療前列腺炎的栓劑，其特征在于所述紫草素占所述栓劑重量的1％，所述栓劑基質(zhì)由70％重量的半合成脂肪酸甘油酯，10％重量的液體石蠟和20％重量的凡士林組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了紫草素的新用途。本發(fā)明發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紫草素具有治療前列腺炎的功效，能用于制備治療前列腺炎的藥物。更具體的，本發(fā)明公開一種治療前列腺炎的栓劑，該栓劑基本由紫草素和栓劑基質(zhì)組成，所述紫草素占所述栓劑重量的0.5－1.5％，余量為栓劑基質(zhì)；所述栓劑基質(zhì)由50－70％重量的半合成脂肪酸甘油酯，10－30％重量的液體石蠟和15－25％重量的凡士林組成。本發(fā)明的發(fā)明人創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)了作為中藥紫草的提取物紫草素，具有治療前列腺炎的活性，以之為主要成分的藥物，有抗菌、抗炎、解熱、利尿作用，治療前列腺炎的效果明顯，并且毒性小，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K9/02GK1726904SQ200510087038
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2005年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月25日
發(fā)明者張軍兵, 李超生, 史官正, 余家相, 汪平, 武惠斌 申請(qǐng)人:北京羚銳偉業(yè)科技有限公司