專利名稱：：一種用稀土元素促進滇紫草細胞紫草素合成的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用稀土元素促進滇紫草細胞紫草素合成的方法。
背景技術：
：滇紫草(Ono柳a;am'cw/a化mBur.etFr.)主產(chǎn)云南，是云南省本地常用中草藥，屬紫草科(Boraginaceae)植物，其根藥用。主要有效成分為紫草素及其衍生物，這些成分不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用，而且還作為天然色素廣泛用于醫(yī)藥、化妝品和印染工業(yè)。目前，滇紫草的野生資源破壞嚴重，市場上供需矛盾凸顯。而利用植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術在反應器中直接培養(yǎng)細胞獲得藥用次生代謝產(chǎn)物是將來生產(chǎn)植物藥最直接、最有效的手段。而對于開展細胞培養(yǎng)技術來生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物，獲得一種能顯著促進次生代謝物合成的方法，是保證高生產(chǎn)效率，縮短生長周期，降低生產(chǎn)成本的有效手段。稀土元素在植物生長中的生理作用己經(jīng)引起植物細胞工程研究人員的重視。例如，在長春花細胞懸浮培養(yǎng)的指數(shù)期加入硝酸鑭，對細胞的生長和次生代謝物的積累均有促進作用(元英進等，稀土，1993，14(3):38-40)。在發(fā)菜細胞培養(yǎng)中加入鑭，不但能促進其生長，而且還能改變氨基酸含量(劉世名等，中國稀土學報，1999，17(1):60-64)。在水母雪蓮的培養(yǎng)過程中，添加鈰或者鑭可以明顯促進細胞的增殖，同時能增加細胞的黃酮含量(Yuanetal.Biotech.Lett.,2002,24:1889-1892.)。肉灰蓉細胞的培養(yǎng)時，加入鑭、鈰或釹都能提高細胞的生物量，獲得較好的增殖效果(Ouyangetal.J.Biotech.,2003，102:129-134)。我們曾經(jīng)詳細研究了稀土元素對新疆紫草細胞生長的影響，表明多種稀土元素在合適的濃度范圍內(nèi)能顯著增加培養(yǎng)細胞的生物量(Geetal.PlantGrowthRegulation,2006,48:283-290;中國發(fā)明專利，ZL20310113089.4)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用稀土元素促進滇紫草細胞紫草素合成的方法。該方法的操作步驟如下1)滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25士1°C，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期28-30天；2)合成培養(yǎng)基的配制M10培養(yǎng)基+稀土元素，M10培養(yǎng)基的成分如表l所示；稀土元素的種類和濃度為€63+(0-0.2mM)、La3+(0-0.2mM)、Nd3+(0-0.2mM)中的一種。在裝有40mL固體培養(yǎng)基的三角瓶中進行，采用繼代培養(yǎng)15天的細胞接種，培養(yǎng)溫度為25±1°C，pH值5.6，暗培養(yǎng)，該紫草素合成階段的細胞培養(yǎng)周期為15天。表1M10培養(yǎng)基成分成分濃度(mg/L)成分濃度(mg/L)KN03680NaH2P04'2H2019Na2S042000CuCl2'2H200.15CaCl2500NaFe-EDTAH3B031.6Sucross50000Inositol100Kinetin(KT)13)紫草素含量的測定將培養(yǎng)的滇紫草細胞轉移至三角瓶中，加入一定量的石油醚(沸點30_60°C)，用超聲細胞破碎儀進行細胞破碎，然后在室溫下振蕩(110r/min)提取24h，提取液用于測定細胞中紫草素的含量。紫草素呈紅棕色，用分光光度計測量，在520nm處有最大吸收峰。繪制標準曲線，得到C二187.85X—2.09，相關系數(shù)r=0.9995，其中C為石油醚溶液中的紫草素濃度(mg/L)，X為該測定溶液的吸光度值，(紫草素含量的測定方法參見《過程工程學報》2008，8巻第1期，115-119頁)S=(CNV/W)X100%;其中，S為紫草素含量(％)，W為愈傷組織干重(mg)，V為萃取液體積(L)，N為稀釋倍數(shù)。本發(fā)明的關鍵點在于1.添加稀土元素的種類；2.添加稀土元素的濃度。以上關鍵點如能把握好，可以顯著提高細胞紫草素的含量。本發(fā)明操作簡便，效果良好，本發(fā)明可應用到植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物的實際生產(chǎn)過程中。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制。實施例h1)滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+2,4-D0.2mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25土1°C，避光培養(yǎng)；2)將繼代培養(yǎng)15天的滇紫草細胞接種在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為M10培養(yǎng)基+Ce3+(用量見下表)，pH值5.6，培養(yǎng)溫度為25土1。C，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15天。3)培養(yǎng)結束后測定細胞紫草素的含量，其結果見表2。表2不同濃度的C^+對滇紫草細胞紫草素含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注對照組為不添加稀土元素的實驗組。實施例2:1)滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+2,4-D0.2mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25土1°C，避光培養(yǎng)；2)將繼代培養(yǎng)15天的滇紫草細胞接種在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為M10培養(yǎng)基+La3+(用量見下表)，pH值5.6,培養(yǎng)溫度為25士1。C，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15天。3)培養(yǎng)結束后測定細胞紫草素的含量，其結果見表3。表3不同濃度的L^+對滇紫草細胞紫草素含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注對照組為不添加稀土元素的實驗組。實施例3:1)滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+2,4-D0.2mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25士1°C，避光培養(yǎng)；2)將繼代培養(yǎng)15天的滇紫草細胞接種在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為M10培養(yǎng)基+Nd3+(用量見下表)，pH值5.6，培養(yǎng)溫度為25土1°C，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15天。3)培養(yǎng)結束后測定細胞紫草素的含量，其結果見表4。表4不同濃度的NdS+對滇紫草細胞紫草素含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注對照組為不添加稀土元素的實驗組。權利要求1、一種用稀土元素促進滇紫草細胞紫草素合成的方法，其特征在于該方法的操作步驟包括1)滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)使用繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25±1℃，避光培養(yǎng)；2)將繼代培養(yǎng)15天的滇紫草細胞接種在含稀土元素的M10固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，稀土元素種類和濃度為Ce3+0-0.2mM、La3+0-0.2mM、Nd3+0-0.2mM，其中的一種，培養(yǎng)溫度為25±1℃，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15天。全文摘要本發(fā)明涉及用稀土元素促進滇紫草細胞紫草素合成的方法。其操作步驟主要包括1.滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)；2.稀土元素促進滇紫草細胞紫草素的合成；3.紫草素含量測定過程。向培養(yǎng)基中添加稀土元素能提高滇紫草細胞紫草素含量。本發(fā)明操作簡便，效果良好，本發(fā)明可應用到植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物的實際生產(chǎn)過程中。文檔編號C12P7/26GK101407783SQ20081023364公開日2009年4月15日申請日期2008年11月26日優(yōu)先權日2008年11月26日發(fā)明者劉迪秋,鋒葛,陳朝銀,黃文虎申請人:昆明理工大學