專利名稱：一種增加滇紫草培養(yǎng)細(xì)胞紫草素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用超聲波增加滇紫草培養(yǎng)細(xì)胞紫草素含量的方法。
技術(shù)背景滇紫草(Omwwc^am'cwtowmBur. etFr.)主產(chǎn)云南，是云南省本地常用中草藥，屬紫 草科(Boraginaceae)植物，其根藥用。主要有效成分為紫草素及其衍生物，這些成分不但 具有抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用，而且還作為天然色素廣泛用于醫(yī)藥、化妝品和印 染工業(yè)。目前，滇紫草的野生資源破壞嚴(yán)重，市場上供需矛盾凸顯。而利用植物細(xì)胞大規(guī) 模培養(yǎng)技術(shù)在反應(yīng)器中直接培養(yǎng)細(xì)胞獲得藥用次生代謝產(chǎn)物是將來生產(chǎn)植物藥最直接、最 有效的手段。開展細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物，首先要獲得一種能快速增殖細(xì) 胞的方法，以保證高效的生產(chǎn)效率，縮短生長周期，降低生產(chǎn)成本。超聲波在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷治療上的應(yīng)用已經(jīng)有幾十年歷史，前人的一些研究結(jié)果表 明低強(qiáng)度的超聲波刺激能夠影響細(xì)胞的生長，使細(xì)胞膜和細(xì)胞器的形態(tài)發(fā)生變化，這些變 化可導(dǎo)致細(xì)胞代謝和膜通透性的改變。已有許多研究表明超聲波能夠提高酶以及微生物細(xì) 胞在反應(yīng)器中的生物轉(zhuǎn)化效率，但是生物反應(yīng)過程中超聲波的影響機(jī)理仍然不十分清楚， 大多數(shù)情況下認(rèn)為是超聲波的機(jī)械刺激強(qiáng)化了生物轉(zhuǎn)化過程中傳質(zhì)和混合，甚至提高了酶 的活性，使細(xì)胞內(nèi)代謝反應(yīng)更加旺盛。過去有關(guān)超聲波生物學(xué)效應(yīng)的研究大多集中于人和 動(dòng)物細(xì)胞及微生物，應(yīng)用于植物細(xì)胞的研究較少。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能有效提高滇紫草離體培養(yǎng)細(xì)胞紫草素含量的方法。該方法的操作步驟如下1) 滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L + 2，4-D 0.2mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25土1 。C，滇紫草細(xì)胞接種于繼代培養(yǎng) 基后，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期28-30天；滇紫草細(xì)胞繼代培養(yǎng)的目的是為了獲得足夠細(xì)胞生 物量用于研究超聲波對細(xì)胞紫草素合成的影響；2) 滇紫草細(xì)胞超聲波處理a. 用超聲波清洗器來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的超聲刺激作用；b. 將繼代培養(yǎng)10天的細(xì)胞接種在裝有40mL含lmg/L激動(dòng)素(KT)的M10液體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25士1 °C，搖床轉(zhuǎn)速110r/min，暗培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)周期為 12 d;c.在細(xì)胞培養(yǎng)過程的第2—6天中，選取超聲波功率80—200W、超聲波處理時(shí)間1 —5 min，對滇紫草培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行超聲波刺激；3) 超聲波刺激后繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成12天的培養(yǎng)周期；4) 紫草素含量的測定取培養(yǎng)的滇紫草細(xì)胞培養(yǎng)液，3500r/min離心20min，回收的 沉淀物為鮮細(xì)胞，將鮮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入一定量的石油醚(沸點(diǎn)30—60 。C)，用 超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后在室溫下振蕩(110r/min)提取24 h，提取液用于測 定細(xì)胞中紫草素的含量。紫草素呈紅棕色，用分光光度計(jì)測量，在520nm處有最大吸收峰。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得 到C二187.85X—2.09， R=0.9995，其中C為石油醚溶液中的紫草素濃度(mg/L)， X為該 測定溶液的吸光度值，R為相關(guān)系數(shù)。S= (CNV/W) X100%; P=1000SW其中，S為紫草素含量(％)， P為紫草素產(chǎn)量(mg/L)， W為愈傷組織干重(g/L)， V 為萃取液體積(L)， N為稀釋倍數(shù)。(該測定方法為現(xiàn)有技術(shù))本發(fā)明內(nèi)容的關(guān)鍵點(diǎn)在于1.超聲波功率的選取；2.超聲波處理時(shí)間的確定；3.超 聲波處理時(shí)刻的選取。以上關(guān)鍵點(diǎn)如能把握好，可以顯著提高細(xì)胞紫草素的含量。本發(fā)明操作簡便，效果良好，擴(kuò)展性強(qiáng)，文中所述的超聲波細(xì)胞處理法可運(yùn)用到植物細(xì)胞大規(guī)模生物反應(yīng)器上，用來提高有效次生代謝產(chǎn)物含量。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制。 實(shí)施例h1) 滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25士1 °C，滇紫草細(xì)胞接種于繼代培養(yǎng)基 后，避光培養(yǎng)；2) 將繼代培養(yǎng)10天的滇紫草細(xì)胞接種在裝有40mL含lmg/L激動(dòng)素(KT)的M10液 體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25士1 °C，搖床轉(zhuǎn)速IIO r/min，暗培養(yǎng)；3) 在培養(yǎng)的第2天，對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞施加功率為80W、時(shí)長為5 min的超聲波刺激， 如

圖1所示，細(xì)胞經(jīng)超聲波刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成12天的培養(yǎng)周期。4)培養(yǎng)結(jié)束后測定細(xì)胞紫草素的含量為1.1%，比不經(jīng)過任何超聲刺激的對照組提高 了20%。實(shí)施例2:1 )滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25士1 。C，滇紫草細(xì)胞接種于繼代培養(yǎng)基 后，避光培養(yǎng)；2) 將繼代培養(yǎng)10天的滇紫草細(xì)胞接種在裝有40mL含lmg/L激動(dòng)素(KT)的M10液 體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25士1 °C，搖床轉(zhuǎn)速IIOr/min，暗培養(yǎng)；3) 在培養(yǎng)的第4天，對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞施加功率為100W、時(shí)長為2min的超聲波刺激， 細(xì)胞經(jīng)超聲波刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成12天的培養(yǎng)周期；4) 培養(yǎng)結(jié)束后測定細(xì)胞紫草素的含量為1.2%，比不經(jīng)過任何超聲刺激的對照組提高 了31%。實(shí)施例3:1) 滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25土1 °C，滇紫草細(xì)胞接種于繼代培養(yǎng)基 后，避光培養(yǎng)；2) 將繼代培養(yǎng)10天的滇紫草細(xì)胞接種在裝有40mL含lmg/L激動(dòng)素(KT)的M10液 體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25士1 °C，搖床轉(zhuǎn)速IIOr/min，暗培養(yǎng)；3) 在培養(yǎng)的第6天，對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞施加功率為200W、時(shí)長為lmin的超聲波刺激， 細(xì)胞經(jīng)超聲波刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成12天的培養(yǎng)周期；4) 培養(yǎng)結(jié)束后測定細(xì)胞紫草素的含量為1.3%，比不經(jīng)過任何超聲刺激的對照組提高 了42%。 M10培養(yǎng)基成分如下表成分濃度(mg/L)成分濃度(mg/L)KN03680NaH2P04*2H2019Na2S042000CuCl2，2H200.15CaCl2500NaFe-EDTA2H3B031.6Sucrose50000Inositol100Kinetin (KT)權(quán)利要求
1、一種增加滇紫草培養(yǎng)細(xì)胞紫草素含量的方法，其特征在于該方法的操作步驟包括1)滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)使用繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25±1℃，滇紫草細(xì)胞接種于繼代培養(yǎng)基后，避光培養(yǎng)；2)將繼代培養(yǎng)10天的滇紫草細(xì)胞接種在裝有40mL含1mg/L激動(dòng)素的M10液體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±1℃，搖床轉(zhuǎn)速110r/min，暗培養(yǎng)；3)在細(xì)胞培養(yǎng)過程的第2-6天中，選取超聲波功率80-200W、超聲波處理時(shí)間1-5min，對滇紫草培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行超聲波刺激；4)超聲波刺激后繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成12天的培養(yǎng)周期。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種增加滇紫草培養(yǎng)細(xì)胞紫草素含量的方法。其操作步驟主要包括1.滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)；2.滇紫草細(xì)胞的液體培養(yǎng)和超聲波處理過程；3.紫草素含量測定過程。利用超聲波對懸浮培養(yǎng)的滇紫草細(xì)胞進(jìn)行刺激，是提高細(xì)胞紫草素含量的有效手段。本發(fā)明操作簡便，效果良好，擴(kuò)展性強(qiáng)，可運(yùn)用到植物細(xì)胞大規(guī)模生物反應(yīng)器上，用來提高有效次生代謝產(chǎn)物含量。
文檔編號C12N5/04GK101402939SQ200810233580
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日
發(fā)明者暢 劉, 劉迪秋, 鋒 葛, 陳朝銀 申請人:昆明理工大學(xué)