專利名稱：大腸桿菌在制備腫瘤診斷或治療藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌的醫(yī)療用途，具體地說涉及大腸桿菌在制備腫瘤診斷或治療藥物中的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病，傳統(tǒng)的腫瘤治療模式如手術(shù)切除，放、化療等，具有腫瘤靶向性差、對(duì)病人正常組織損壞大、易復(fù)發(fā)、副反應(yīng)大等缺點(diǎn)。目前迫切需要一種新的技術(shù)或方法，能正確的區(qū)分腫瘤組織與正常組織，達(dá)到特異的識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。隨著對(duì)細(xì)菌的深入認(rèn)識(shí)及現(xiàn)代分子生物學(xué)的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)，很多細(xì)菌如梭狀芽胞桿菌、雙岐桿菌、霍亂弧菌、利斯特菌、沙門菌及大腸桿菌等具有特異的聚集于腫瘤組織，并可在腫瘤組織中生長(zhǎng)繁殖的特性，有些細(xì)菌還具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用(Pawelek J.M，Low K.B，Bermudes D.Bacteria as tumor-targeting vectors.LancetOncol，2003，4548-556.)。利用這一特性，掀起了一場(chǎng)關(guān)于細(xì)菌在腫瘤靶向治療中應(yīng)用的重大變革。細(xì)菌應(yīng)用于腫瘤的靶向治療具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)1.在腫瘤組織內(nèi)，細(xì)菌主要聚集于腫瘤細(xì)胞外，對(duì)抗生素較為敏感，可以較快地清除，較為安全。
2.細(xì)菌的基因組很大，可以快速表達(dá)具有腫瘤治療作用的目的基因，使其在特定部位發(fā)揮更特異、更強(qiáng)的抗腫瘤作用，同時(shí)腫瘤部位的細(xì)菌可以生長(zhǎng)繁殖，使得效應(yīng)基因能在腫瘤部位持續(xù)表達(dá)，從而發(fā)揮更大、更持久的抑瘤效果。
3.某些細(xì)菌無論是在同種基因的腫瘤模型還是異種腫瘤移植物模型，均有較好的腫瘤定位效果，且其在腫瘤組織積聚的量大，即較少的細(xì)菌定位于腫瘤組織便可在此生長(zhǎng)繁殖。
4.很多細(xì)菌經(jīng)過遺傳改造后，如某些細(xì)菌的減毒株、攜帶某些腫瘤治療基因的細(xì)菌等均未改變其腫瘤靶向性，且也未改變其對(duì)抗生素的敏感性，為將細(xì)菌應(yīng)用于腫瘤治療提供了更為廣闊的前景。
5.細(xì)菌用于腫瘤治療有多種注菌方式，如靜脈注射、腹腔內(nèi)注射、瘤內(nèi)注射等，為今后細(xì)菌應(yīng)用于腫瘤治療提供更多的選擇。
6.細(xì)菌不僅能定位于原發(fā)腫瘤部位，也可定位于腫瘤的轉(zhuǎn)移灶，故細(xì)菌不僅能作為腫瘤治療的載體，也可用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及診斷。
目前，用于腫瘤治療主要有兩大類細(xì)菌，一類是厭氧菌屬的芽胞桿菌和雙岐桿菌，另一類是兼性厭氧菌的沙門氏菌。芽胞桿菌是發(fā)現(xiàn)較早，且研究也較多的細(xì)菌，芽胞桿菌的親腫瘤性與腫瘤大小有一定的關(guān)系，即只有腫瘤長(zhǎng)到一定大小后，芽胞桿菌才能定位于腫瘤內(nèi)，且大多數(shù)病人的腫瘤沒有減小的跡象。芽胞桿菌的毒性及缺乏臨床效果影響了其在抗腫瘤方面的應(yīng)用。直到上世紀(jì)90年代，利用芽胞桿菌的親腫瘤性，將其作為抗腫瘤效應(yīng)基因治療的載體取得了良好的成效，但其毒性作用仍然是其應(yīng)用于臨床治療的主要障礙(Liu SC，Minton NP，Giaccia AJ，et al.Anticancer efficacy of systemically deliveredanaerobic bacteria as gene therapy vectors targeting tumor hypoxia/necrosis.Gene Ther，2002，9291-296.)。
雙岐桿菌屬革蘭陽性厭氧菌，是一類無毒且安全的細(xì)菌。研究者們發(fā)現(xiàn)，將雙岐桿菌以靜脈注射的方式注入荷瘤小鼠體內(nèi)時(shí)，可發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)有細(xì)菌聚集，且其在腫瘤組織與在正常組織中量之比＞1000∶1，但未發(fā)現(xiàn)有腫瘤減小或消退的現(xiàn)象，且其只能在直徑1.5cm或更大的腫瘤組織內(nèi)聚集，而在小腫瘤內(nèi)同樣劑量的細(xì)菌則無法聚集，提示雙岐桿菌用于腫瘤治療也依賴于腫瘤大小，有一定局限性。但其作為腫瘤治療的載體仍然吸引著眾多研究者的注意并取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Geng-Feng Fu，Xi Li，Ya-Yi Hou，et al.Bifidobacteriumlongum as an oral delivery system of endostatin for gene therapy on solid liver cancer.CancerGene Therapy，2005，12133-140.)。
沙門氏菌屬革蘭陰性桿菌，是近十年內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤靶向性的一類兼性厭氧菌，其同樣具有腫瘤定位能力，但由于其強(qiáng)毒性作用，故人們積極探索尋求其減毒株或弱毒株，使其更好地用于腫瘤治療。VNP20009是一類敲除了msbB和purI基因的沙門氏菌，其毒性大為減弱，且保留了其腫瘤靶向性。Zhao Ming等研制了一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型沙門氏菌，該種弱毒株保留了腫瘤靶向性，當(dāng)瘤內(nèi)注射沙門氏菌時(shí)，小鼠的腫瘤組織完全消退，表明了減毒性沙門氏菌在抗腫瘤方面的應(yīng)用前景(Zhao Ming，Yang Meng，Li Xiao-Ming，et al.Tumor-targeting bacterial therapy with amino acid auxotrophs of GFP-expressing Salmonellatyphimurium，PNAS，2005，102755-760.)。減毒性沙門氏菌作為某些效應(yīng)基因如腫瘤壞死因子、血管生成抑制素、自殺基因等的載體用于腫瘤靶向治療已有不少報(bào)道，且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得了喜人成果(Ivan King，David Bermudes，Stanley Lin，et al.Tumor-targeted salmonella expressing cytosine deaminase as an anticancer agent.Human GeneTherapy，2002，223261-3266；)，但減毒了的沙門氏菌并非完全無毒，其應(yīng)用于臨床還有一定的限制。
從以上可以看出，芽胞桿菌、雙岐桿菌和沙門氏菌用于腫瘤治療各有其本身的不足，所以目前迫切需要尋找一類即無毒又不受腫瘤大小限制，同時(shí)又具有良好腫瘤靶向性的細(xì)菌用于腫瘤治療。
大腸桿菌屬革蘭陰性桿菌，是寄生于人類和動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群。目前人工改造的大腸桿菌工程菌主要有DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802、K803等，它們的基因組穩(wěn)定，遺傳背景清楚，更重要的是其無毒，廣泛用于基因工程的各個(gè)方面，如作為克隆載體或是某些效應(yīng)基因的表達(dá)載體等。
大腸桿菌也像其它細(xì)菌一樣，具有腫瘤靶向性，當(dāng)靜脈注射細(xì)菌于荷瘤小鼠體內(nèi)時(shí)，在注菌的第二天，即可在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌的存在，研究者觀察到該現(xiàn)象，并未公布有關(guān)大腸桿菌的詳細(xì)數(shù)據(jù)。(Yong A Yu，ShahrokhShabahang，Tatyana M Timiryasova，et al.Visulization of tumors and metastases in live animalswith bacteria and vaccinia virus encoding light-emitting proteins.Nature Biotechnology2004；22313-21)。目前也尚無關(guān)于利用大腸桿菌的腫瘤靶向性發(fā)揮抗腫瘤作用，以及大腸桿菌是否具有抑制腫瘤生長(zhǎng)作用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決目前存在的缺少適合用于腫瘤診斷或治療的細(xì)菌問題，本發(fā)明公開了大腸桿菌在制備腫瘤診斷或治療藥物的用途。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌可以特異地集聚于動(dòng)物腫瘤組織，還發(fā)現(xiàn)多次注射大腸桿菌可以抑制腫瘤生長(zhǎng)。
本發(fā)明中大腸桿菌可以為大腸埃希菌屬的各個(gè)種及其在此基礎(chǔ)上經(jīng)過遺傳工程改造的大腸桿菌工程菌如DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802、K803等。
本發(fā)明中腫瘤可以為各種實(shí)體瘤，如鼠黑色素腫瘤B16-F10、人肝癌BEL7405及SMMC7721、人前列腺癌PC-3、人乳腺癌MCF-7、人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080、鼠膀胱肉瘤細(xì)胞MB-49及鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6。
本發(fā)明用途中腫瘤診斷是通過大腸桿菌聚集于腫瘤組織實(shí)現(xiàn)的，所述腫瘤組織可以為腫瘤原發(fā)灶，也可為腫瘤轉(zhuǎn)移灶。本發(fā)明用途中的腫瘤治療是通過大腸桿菌聚集于腫瘤組織，并抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明用途中用于腫瘤治療大腸桿菌的劑量是5×109cfu/次/kg體重，每周一次，連續(xù)三次，用于腫瘤診斷大腸桿菌的劑量是5×108cfu/kg體重。本發(fā)明用途中腫瘤診斷或治療藥物給藥途徑為靜脈給藥。
本發(fā)明的用途通過以下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證一、動(dòng)物腫瘤模型及轉(zhuǎn)移瘤模型的建立首先進(jìn)行腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)，其中腫瘤細(xì)胞包括B16-F10、MCF-7、PC-3、MB-49、HT1080、C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤、BEL7405及SMMC7721等各種實(shí)體瘤細(xì)胞。培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備成一定濃度細(xì)胞懸液。
然后進(jìn)行腫瘤模型及轉(zhuǎn)移瘤模型的建立，將制備的腫瘤細(xì)胞懸液接種動(dòng)物，其中腫瘤模型的動(dòng)物可以為BALB/C小鼠及裸鼠等，接種方式為右后腿皮下注射，腫瘤轉(zhuǎn)移模型動(dòng)物可以為裸鼠等，接種方式為尾靜脈注射。
二、發(fā)光細(xì)菌的構(gòu)建及檢測(cè)首先制備發(fā)光細(xì)菌按常規(guī)方法制備感受態(tài)大腸桿菌，將質(zhì)粒pXen-1(luxABCDE)(FDrancis KP，Joh D，Bellinger-kawahara C，et al.Monitoring bioluminescentstrphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct.InfectImmun；2000，68(6)3594～3600.)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，涂板后應(yīng)用IVIS成像系統(tǒng)觀察克隆的發(fā)光情況及效率。將發(fā)光效率較高的單克隆菌于帶有抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集細(xì)菌，并制成一定濃度的細(xì)菌懸液，注菌于正常及荷瘤動(dòng)物，可以采用尾靜脈注射等。
三、細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)分布特征及腫瘤定位特性細(xì)菌在正常小鼠中的分布特點(diǎn)。靜脈注射細(xì)菌于正常小鼠，可見細(xì)菌先分布于肺，然后漸向肝臟聚集，最終定位于肝臟。動(dòng)物尸檢結(jié)果也顯示細(xì)菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)短時(shí)間主要聚集于肺臟與肝臟，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)菌只分布于肝臟。
細(xì)菌在荷瘤小鼠中的分布特點(diǎn)。靜脈注射細(xì)菌于荷瘤小鼠，注菌之初，細(xì)菌在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布與在正常小鼠中的分布類似，但在注菌的第二天，荷瘤小鼠的腫瘤部位即有光的存在。解剖小鼠結(jié)果提示細(xì)菌全部分布在腫瘤部位。對(duì)于較大的腫瘤，細(xì)菌主要分布于腫瘤組織的周邊，說明大腸桿菌主要聚集于氧份比較豐富的腫瘤區(qū)域，且較少的細(xì)菌也可在腫瘤中定位。
四、細(xì)菌對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用通過一次注菌及多次注菌于荷瘤動(dòng)物，觀察大腸桿菌本身對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。結(jié)果顯示動(dòng)物腫瘤體積的增長(zhǎng)變化在一次注菌組與對(duì)照組間無明顯差別，但在多次注菌組與一次注菌組間或是與對(duì)照組間則差別明顯。說明多次注菌可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
五、細(xì)菌在轉(zhuǎn)移瘤發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用按上述方法構(gòu)建動(dòng)物轉(zhuǎn)移瘤模型，動(dòng)物可以采用裸鼠等，腫瘤可以為黑色素瘤、肝癌及乳腺癌等，通過腹腔注射底物，活體成像，判斷轉(zhuǎn)移瘤模型是否構(gòu)建成功。然后在構(gòu)建成功的動(dòng)物模型中尾靜脈注射大腸桿菌，觀察到大腸桿菌具有定位于轉(zhuǎn)移瘤的能力。
大腸桿菌應(yīng)用于腫瘤的診斷及治療，除具有細(xì)菌本身的優(yōu)勢(shì)外，還有其獨(dú)有的特點(diǎn)首先，大腸桿菌屬胞外菌，比胞內(nèi)菌更易被抗生素清除；其次，非致病性大腸桿菌是無毒的細(xì)菌，不須先對(duì)細(xì)菌進(jìn)行減毒或弱毒改造即可應(yīng)用；再次，對(duì)大腸桿菌的基因組了解比較全面，改造起來更容易；最后，大腸桿菌是兼性厭氧菌，即可在腫瘤的壞死區(qū)域聚集，也可在氧性豐富的部位聚集，在腫瘤的選擇方面不受腫瘤大小及腫瘤內(nèi)是否缺氧的限制。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)首次證明了大腸桿菌在有腫瘤生長(zhǎng)的動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)腫瘤組織，包括轉(zhuǎn)移瘤具有特異性定位特點(diǎn)，并能抑制腫瘤的生長(zhǎng)。可以利用大腸桿菌對(duì)腫瘤的靶向性及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，加上藥學(xué)上可接受的輔料，以保持大腸桿菌的活性及穩(wěn)定性，用來制備用于腫瘤診斷或治療的藥物，具有非常廣闊的市場(chǎng)前景。


圖1為發(fā)光細(xì)菌在正常小鼠中的分布特點(diǎn)。其中A圖是尾靜脈注射E.coliDH5α(1×109cfu/100ul/鼠)于正常小鼠10～20分鐘后的成像情況，可見發(fā)光細(xì)菌分布于小鼠的雙肺，B圖是尾靜脈注射E.coli DH5α(1×109cfu/100ul/鼠)3天后的成像情況，可見發(fā)光細(xì)菌分布于小鼠的肝臟，其他大腸桿菌工程菌在正常小鼠或裸鼠中的分布情況與此相類似。
圖2為發(fā)光細(xì)菌在荷瘤小鼠中的分布特點(diǎn)。其中A圖是尾靜脈注射E.coliDH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠1天時(shí)的成像情況，B圖是尾靜脈注射E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠2天時(shí)的成像情況，圈中所示的是小鼠腫瘤接種的部位，即腫瘤接種于小鼠右后腿皮下，發(fā)光的區(qū)域是發(fā)光細(xì)菌聚集于腫瘤組織，其他大腸桿菌工程菌在黑色素瘤小鼠或荷有其他實(shí)體瘤小鼠中的分布情況與此相類似。
圖3為尾靜脈注射E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠13天后小鼠的解剖情況。其中A圖是不同器官的曝光情況1-肝臟，2-肺臟，3-心臟，4-腎臟，5-脾臟，6-胃及腸，曝光時(shí)間300s，所有器官未見有發(fā)光細(xì)菌的存在。B圖是整個(gè)腫瘤的曝光情況，曝光時(shí)間30s，可見有大量發(fā)光細(xì)菌的存在。C圖是一切為二的腫瘤曝光情況，曝光時(shí)間30s，從C圖可以看出發(fā)光細(xì)菌主要存在于腫瘤的邊緣區(qū)域，在腫瘤中間的壞死區(qū)域則存在的很少。其他大腸桿菌工程菌在荷有黑色素瘤或其他實(shí)體瘤小鼠中的情況與此相類似。
圖4為大腸桿菌DH5α對(duì)荷有黑色素瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。大腸桿菌DH5α對(duì)荷有其他實(shí)體瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用與此相類似。
圖5為大腸桿菌BL21對(duì)荷有黑色素瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。大腸桿菌BL21對(duì)荷有其他實(shí)體瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用與此相類似。
圖6為大腸桿菌JM109對(duì)荷有黑色素瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。大腸桿菌JM109對(duì)荷有其他實(shí)體瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用與此相類似。
圖7為E.coli DH5α定位于裸鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移灶。其中A圖是取自注菌四天后的黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型裸鼠的肺臟，可見肺上布滿了大大小小的黑色腫瘤轉(zhuǎn)移灶；B圖是將左圖的肺臟，曝光120s后，可見發(fā)光細(xì)菌定位于肺臟的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 動(dòng)物腫瘤模型及轉(zhuǎn)移瘤模型的建立一、實(shí)驗(yàn)材料1、細(xì)胞、細(xì)菌、質(zhì)粒及培養(yǎng)基腫瘤細(xì)胞B16-F10-luc-G5、MCF-7-luc-F5、BEL7405-luc及SMMC7421-luc購于Xenogen公司，PC-3、C6、MB-49及HT1080購于ATCC公司。大腸桿菌DH5α、BL21、JM109等均為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株，市購，本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、DMEM，胎牛血清為Sigma公司產(chǎn)品。細(xì)菌培養(yǎng)基LB中各成分蛋白胨、酵母提取物購于OXOID公司，氯化鈉為國(guó)產(chǎn)分析純。pXen-1(luxABCDE)質(zhì)粒購于Xenogen公司。
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C小鼠和nu/nuBALB/C裸鼠，5～6周齡，體重20±5g，均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。
3、儀器設(shè)備IVIS成像系統(tǒng)(Xenogen公司)；UV-1601型紫外分光光度計(jì)(Bio Rad公司)；Steri-cycle CO2培養(yǎng)箱(Thermo ELECTRON公司)；低溫超速離心機(jī)(Sigma公司)；OLYMPUS顯微鏡；PCR儀(Biometra公司)。
二、方法結(jié)果1、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及制備腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基組成成分與比例為B16-F10、MCF-7、PC-3、MB-49及HT1080細(xì)胞DMEM 90％，F(xiàn)BS 10％。C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤、BEL7405及SMMC7421細(xì)胞RPMI-164090％，F(xiàn)BS 10％。將腫瘤細(xì)胞置于37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行換液或傳代。
常規(guī)方法消化、收集細(xì)胞，1200rpm離心10min，棄上清，并用生理鹽水洗細(xì)胞三次，最后以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。最終將細(xì)胞重懸于生理鹽水中，使其終濃度為5×107cell/ml或5×106cell/ml。
2、腫瘤模型及轉(zhuǎn)移瘤模型的建立BALB/C小鼠及裸鼠的腫瘤模型均采用右后腿皮下接種腫瘤細(xì)胞(5×106cell/100μl/鼠)，裸鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移模型均采用尾靜脈注入腫瘤細(xì)胞的方式(5×105cell/100μl/鼠)。
3、結(jié)果BALB/C小鼠及裸鼠的腫瘤模型在接種腫瘤細(xì)胞的7～10天后即能形成可觸及的腫瘤；裸鼠的轉(zhuǎn)移瘤模型在靜脈注入腫瘤的細(xì)胞的7～14天后形成，轉(zhuǎn)移部位肺轉(zhuǎn)移占80％以上，其他如肝、淋巴結(jié)、脂肪、骨等也可有轉(zhuǎn)移灶。
實(shí)施例二 發(fā)光細(xì)菌的構(gòu)建及檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例一。
二、方法結(jié)果1、發(fā)光細(xì)菌的制備細(xì)菌培養(yǎng)基LB按常規(guī)配制，大腸桿菌DH5α，BL21，JM109等感受態(tài)細(xì)胞按常規(guī)制備。
按常規(guī)方法將pXen-1(luxABCDE)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，BL21，JM109，涂板后采用IVIS成像系統(tǒng)觀察克隆的發(fā)光情況及效率。
2、實(shí)驗(yàn)前細(xì)菌的處理①在給小鼠注菌的前一天，挑取發(fā)光效率較高的單克隆菌落于帶有抗性的LB中，37℃搖床中培養(yǎng)過夜，次日按1∶100轉(zhuǎn)接該菌，繼續(xù)搖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期即OD600＝0.6～1.0。
②按1OD＝8×108cfu/ml計(jì)算菌量，然后離心，去除LB，并用無菌生理鹽水徹底洗三遍，最終稀釋到1×109cfu/ml。
③從制備好的菌液中取100μl用于動(dòng)物的尾靜脈注射。
3、注菌于荷瘤小鼠當(dāng)小鼠接種腫瘤7～10天后，以尾靜脈注射的方式給小鼠注菌，注菌劑量是1×108cfu/100μl/鼠。
結(jié)果通過以上方法制備的發(fā)光細(xì)菌，發(fā)光效率較高，注入到動(dòng)物體內(nèi)后，可在活體情況下，觀察細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)的分布，從而追蹤細(xì)菌的定位(見附圖1～2)。
實(shí)施例三 細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)的分布特征及腫瘤定位特性一、實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例一。
二、方法結(jié)果1、細(xì)菌在正常小鼠中分布的特點(diǎn)靜脈給予2×109cfu/100μl/鼠或1×109cfu/100μl/鼠于正常小鼠體內(nèi)的10～20min內(nèi)，可見細(xì)菌分布于肺，然后細(xì)菌漸向肝臟聚集，并定位于肝臟，見附圖1，其中A圖是尾靜脈注射E.coli DH5α(1×109cfu/100ul/鼠)于正常小鼠10～20分鐘后的成像情況，可見發(fā)光細(xì)菌分布于小鼠的雙肺；B圖是尾靜脈注射E.coli DH5α(1×109cfu/100ul/鼠)3天后的成像情況，可見發(fā)光細(xì)菌分布于小鼠的肝臟；其他大腸桿菌工程菌在正常小鼠或裸鼠中的分布情況與此相類似。大部分小鼠不能耐受大于1×109cfu/100μl/鼠劑量的細(xì)菌，多數(shù)小鼠于注菌的第二天死亡，尸檢結(jié)果顯示細(xì)菌主要聚集于小鼠的肺臟與肝臟，未死或數(shù)天后死亡的小鼠尸檢結(jié)果則顯示細(xì)菌只分布于肝臟。靜脈注射1×108cfu/100μl/鼠細(xì)菌的小鼠則能全部存活，且細(xì)菌的分布最終也只分布于肝臟。
2、細(xì)菌在荷瘤小鼠中分布的特點(diǎn)靜脈注射1×108cfu/100μl/鼠細(xì)菌于荷瘤小鼠，注菌之初，細(xì)菌在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布與在正常小鼠中的分布類似，但在注菌的第二天，荷瘤小鼠的腫瘤部位即有光的存在，見附圖2，其中A圖是尾靜脈注射的E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠1天時(shí)的成像情況，B圖是尾靜脈注射的E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠2天時(shí)的成像情況，圈中所示的是小鼠腫瘤接種的部位，即腫瘤接種于小鼠右后腿皮下，發(fā)光的區(qū)域是發(fā)光細(xì)菌聚集于腫瘤部位，其他大腸桿菌工程菌在黑色素瘤小鼠或荷有其他實(shí)體瘤小鼠中的分布情況與此相類似。解剖小鼠，分別取正常組織與腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)只有腫瘤部位有較強(qiáng)的光，而正常組織如肝、肺、心、腎及胃腸等則無光，提示細(xì)菌全部分布于腫瘤組織。而且我們也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于較大的腫瘤，細(xì)菌主要分布于腫瘤組織的周邊，在腫瘤中心的壞死區(qū)域，細(xì)菌則分布的較少，說明大腸桿菌主要聚集于氧份比較豐富的腫瘤區(qū)域，見附圖3，其中A圖是不同器官的曝光情況1-肝臟，2-肺臟，3-心臟，4-腎臟，5-脾臟，6-胃及腸，曝光時(shí)間300s，所有器官未見有發(fā)光細(xì)菌的存在；B圖是整個(gè)腫瘤的曝光情況，曝光時(shí)間30s，可見有大量發(fā)光細(xì)菌的存在；C圖是一切為二的腫瘤曝光情況，曝光時(shí)間30s，從C圖可以看出發(fā)光細(xì)菌主要存在于腫瘤的邊緣區(qū)域，在腫瘤中間的壞死區(qū)域則存在的很少。其他大腸桿菌工程菌在荷有黑色素瘤或其他實(shí)體瘤小鼠中的情況與此相類似。本研究還發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射1×107cfu/100μl/鼠細(xì)菌的荷瘤小鼠在注菌的第二天進(jìn)行解剖后，腫瘤部位就有光的存在，而在正常組織則無光，提示較少的細(xì)菌也可在腫瘤中定位。
實(shí)施例四 細(xì)菌對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用一、實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例一。
二、方法結(jié)果取三組小鼠分別是對(duì)照組(生理鹽水組)，一次注菌組及多次注菌組，觀察大腸桿菌本身對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。
在接種腫瘤的第7天，將15只小鼠隨機(jī)分為三組，每組5只。一次注菌組及多次注菌組以尾靜脈注射的方式注入1×108cfu/100μl/鼠細(xì)菌懸液，對(duì)照組注入相同體積的生理鹽水，多次注菌組小鼠在第一次注菌后的7天、14天，再次注入相同體積及濃度的菌液。觀測(cè)的指標(biāo)是小鼠腫瘤體積的增長(zhǎng)變化，腫瘤體積的計(jì)算公式為V＝L×W2×0.5(其中L為腫瘤的長(zhǎng)軸，W為腫瘤的短軸)。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，進(jìn)行樣本均數(shù)的兩兩比較，方法采用的是Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，即q檢驗(yàn)。
結(jié)果顯示小鼠腫瘤體積的增長(zhǎng)變化在一次注菌組與對(duì)照組間無明顯差別(P＞0.05)，但在多次注菌組與一次注菌組間或是與對(duì)照組間則差別明顯(P＜0.05)，表現(xiàn)為多次注菌組的小鼠腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢，有的小鼠腫瘤有縮小之現(xiàn)象，提示多次注菌可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，見附圖4～6，分別顯示大腸桿菌DH5α、BL21及JM109對(duì)荷有黑色素瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，此三種工程菌對(duì)荷有其他實(shí)體瘤小鼠腫瘤的作用與此相類似。
實(shí)施例五 細(xì)菌在轉(zhuǎn)移瘤發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用一、實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例一。
二、方法結(jié)果按上述方法構(gòu)建裸鼠黑色素瘤、肝癌及乳腺癌等轉(zhuǎn)移瘤模型，1～2周后，按0.1ml/10g腹腔注射底物，活體成像后，可以判斷轉(zhuǎn)移瘤模型是否構(gòu)建成功。
當(dāng)模型構(gòu)建成功后，按上述方法，尾靜脈注菌，觀察大腸桿菌是否具有定位于轉(zhuǎn)移瘤的能力。
結(jié)果尾靜脈注射黑色素瘤，肝癌及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞于裸鼠體內(nèi)，10天后活體成像可見肺臟轉(zhuǎn)移瘤構(gòu)建成功，尾靜脈注入1×108cfu/100μl/鼠的大腸桿菌3～4天后，解剖小鼠可見肺臟布滿了大小不同的轉(zhuǎn)移灶，成像顯示，在肺臟轉(zhuǎn)移灶有發(fā)光細(xì)菌存在，說明大腸桿菌可定位于腫瘤的轉(zhuǎn)移灶，見附圖7，而在沒有腫瘤轉(zhuǎn)移灶的其他臟器，則未見有發(fā)光細(xì)菌的存在；其他大腸桿菌工程菌在轉(zhuǎn)移瘤中的定位情況與此相類似。
權(quán)利要求
1.大腸桿菌在制備腫瘤診斷或治療藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中大腸桿菌為大腸埃希菌屬的每個(gè)種或在此基礎(chǔ)上經(jīng)過遺傳工程改造的大腸桿菌工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中大腸桿菌為DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802或K803。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中腫瘤為實(shí)體瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中腫瘤為鼠黑色素腫瘤B16-F10、人肝癌BEL7405及SMMC7721、人前列腺癌PC-3、人乳腺癌MCF-7、人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080、鼠膀胱肉瘤細(xì)胞MB-49或鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其中腫瘤診斷的大腸桿菌的劑量是5×108cfu/k體重。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其中腫瘤治療的大腸桿菌的劑量是5×109cfu/次/kg體重，每周一次，連續(xù)三次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其中腫瘤診斷或治療藥物的給藥途徑為靜脈給藥。
全文摘要
本發(fā)明公開了大腸桿菌在制備腫瘤診斷或治療藥物中的用途。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明了大腸桿菌可以定位于動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤組織，并對(duì)腫瘤組織生長(zhǎng)具有抑制作用，可以用來制備腫瘤診斷或治療的藥物，具有廣闊的市場(chǎng)和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K35/66GK1903374SQ20051008711
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者張學(xué)敏, 張海英, 王晨輝 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心