專(zhuān)利名稱(chēng)：非肽類(lèi)sars冠狀病毒3cl蛋白酶抑制劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類(lèi)預(yù)防和治療抗SARS冠狀病毒和其他病毒感染的化合物，具體涉及一類(lèi)非肽類(lèi)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的抑制劑二苯甲基哌嗪類(lèi)衍生物。
背景技術(shù)：
2003年春天，非典型肺炎(SARS，Severe Acute Respiratory Syndrome)在香港、廣州、北京等地區(qū)爆發(fā)，給人們的身心健康帶來(lái)了極大的傷害。沒(méi)有預(yù)防或治療先例的SARS流行病引起了人們的高度重視。對(duì)SARS的藥物研發(fā)一度成為我國(guó)科學(xué)家研究的焦點(diǎn)。然而，到目前為止仍沒(méi)有SARS建議用藥。
研究表明變種的冠狀病毒是導(dǎo)致SARS的主要元兇。冠狀病毒的主要蛋白酶或稱(chēng)3CL蛋白酶是病毒復(fù)制中的關(guān)鍵蛋白，其主要功能是水解病毒所表達(dá)的兩個(gè)多聚蛋白質(zhì)。序列分析表明3CL蛋白酶在已測(cè)定的SARS基因組中是保守的，有可能成為藥物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵靶標(biāo)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是找到非肽類(lèi)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的抑制劑，并用于抗SARS冠狀病毒和其他病毒感染。
本發(fā)明的技術(shù)方案是基于SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)，對(duì)ACD等藥物數(shù)據(jù)庫(kù)虛擬篩選，得到可能對(duì)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶有抑制的化合物。我們購(gòu)買(mǎi)并合成了百余個(gè)化合物(其中包括一些臨床用藥)，并利用反相高壓液相色譜方法和底物pNA標(biāo)記的酶活性體系進(jìn)行了這些化合物對(duì)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶活性影響的測(cè)試，篩選出對(duì)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶有抑制的化合物，然后對(duì)細(xì)胞培育的SARS病毒進(jìn)行測(cè)試。
經(jīng)按上述方案進(jìn)行藥物篩選，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了如下所示(通式為式I)的一類(lèi)化合物對(duì)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶及細(xì)胞培育的SARS病毒具有抑制作用
式I式I中，R11～R15、R21～R25獨(dú)立選自氫、C1～C4直鏈或支鏈烷基、C2～C5直鏈或支鏈烯基、C3～C8環(huán)烷基、C5～C8環(huán)烯基、鹵素、羥基、C1～C4烷氧基、硝基、羥甲基、酰胺基、三氟甲基、苯基、取代苯基，其中的烷基或者烯基鏈上可以無(wú)取代，也可以被選自下面的一個(gè)或者多個(gè)基團(tuán)所取代鹵素、苯基、C3～C8環(huán)烷基、C5～C7環(huán)烯基、硝基、羥甲基、酰胺基、三氟甲基、三氟甲氧基。
Q為(CH2)nQ1，其中n為1～3的整數(shù)；Q1為羥基、羥甲氧基、羥乙氧基、C1～C4烷氧基、苯基、吡啶基、酰胺基、C1～C4氮烷基、C1～C4氮，氮二烷基、1-氮取代-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮基、1-氮取代咪唑基。
式I化合物中存在有手性中心，因此本發(fā)明還包括其各種旋光異構(gòu)體。
本發(fā)明還包括式I化合物的水合物。
式I化合物可以與酸形成各種可藥用的鹽，如鹽酸鹽。
將式I化合物與藥學(xué)上可接受的輔劑結(jié)合，可以制備治療和預(yù)防SARS病毒感染的藥物。
R13、R23優(yōu)選基團(tuán)為鹵素，最佳為氯。Q1優(yōu)選基團(tuán)為羥乙氧基、苯基、吡啶基、酰胺基、1-氮取代-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮基。
當(dāng)R為氫，n＝1，Q1為苯基、吡啶基、酰胺基時(shí)，是我們合成的新化合物。
當(dāng)R13為氯，其余R為氫，n＝2，Q1為羥乙氧基時(shí)，該化合物的鹽酸鹽是pkumdl_cvs_1003，即鹽酸去氯羥嗪，化學(xué)名2-[2-[4-(4-氯苯基)苯基甲基-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇二鹽酸鹽，拼音名YANSUAN QIANGQIN，英文名HydroxyzineDihydrochloride，CAS No.2192-20-3，分子式C21H27ClN2O2·2HCl，分子量447.83，作為抗組胺藥上市多年。
當(dāng)R為氫，n＝3，Q1為1-氮取代-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮基時(shí)，是鎮(zhèn)靜性抗組胺藥奧沙米特，化學(xué)名為1-[3-[4-(二苯甲基)-1-哌嗪基]丙基]-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮。
未見(jiàn)上述化合物抑制3CL蛋白酶的文獻(xiàn)報(bào)道。
我們選用分子對(duì)接程序Dock4.0和Autodock3.05研究了化合物pkumdl_cvs_1003等與SARS-3CL蛋白酶的結(jié)合模式。如附圖1所示，式I化合物結(jié)合到3CL蛋白酶上并且產(chǎn)生生物活性的基本因素是體積占位以及相應(yīng)的疏水相互作用式I化合物的哌嗪環(huán)位于結(jié)合口袋的中心位置，該環(huán)上的N與3CL蛋白酶的Glu47的主鏈氧以及Thr190上的側(cè)鏈羥基有較強(qiáng)的靜電相互作用；與甲基相連的兩個(gè)芳香環(huán)和分別占據(jù)了蛋白的S1和S1’的位置。
本發(fā)明利用反相高壓液相色譜方法和底物pNA標(biāo)記的酶活性體系對(duì)受試化合物進(jìn)行SARS冠狀病毒3CL蛋白酶活性影響測(cè)定。反相高壓液相色譜及顯色活性測(cè)定方法定量、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、不易受其他物質(zhì)干擾，是目前利用天然底物測(cè)定RNA病毒(包括導(dǎo)致普通感冒或上呼吸道感染等多種病毒和導(dǎo)致SARS的變種冠狀病毒)3CL蛋白酶活性的國(guó)際通用方法(John Ziebuhr，Gerhard Heusipp，and Stuart G.Siddell，J.VIROL.1997，71(5)，3992-3997.Chang-kang Huang，Ping Wei，Ke-qiang Fan，Ying Liu，Lu-hua Lai.Biochemistry2004，43(15)，4568-4574.)。
利用細(xì)胞單層接種法對(duì)細(xì)胞培育的SARS病毒進(jìn)行測(cè)試。
本發(fā)明經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，化合物pkumdl_cvs_1003，pkumdl_cvs_1006等對(duì)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶及細(xì)胞培育的SARS病毒具有較好的抑制作用，提示一些老藥可以開(kāi)發(fā)出新的用途。


圖1是本發(fā)明的式I化合物與與SARS-3CL蛋白酶的結(jié)合模式圖。
具體實(shí)施例方式在以下實(shí)施例中，我們所用候選化合物購(gòu)自ICN試劑公司或用常規(guī)試劑合成；所用3CL蛋白酶為經(jīng)基因克隆、表達(dá)、純化制備的，最后經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾柱達(dá)到95％以上純度；所用的底物是根據(jù)3CL蛋白酶在SARS病毒多聚蛋白質(zhì)上的切點(diǎn)所合成的11肽。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，所采用的操作方法和操作步驟以及底物反應(yīng)條件等，都是依據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的方法設(shè)計(jì)、實(shí)施的。
為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，列舉以下實(shí)施例，但其對(duì)本發(fā)明的范圍無(wú)任何限制。
實(shí)施例1.奧沙米特的合成[參考文獻(xiàn)劉翔，劉庭輝，劉百里。沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，18(5)，327-328。]一、合成路線 二、實(shí)驗(yàn)步驟A、1-異丙烯基-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮(2)的制備在裝有分水器的反應(yīng)瓶中，加入鄰苯二胺54g(0.5mol)、二甲苯220ml，加熱攪拌回流后，緩慢滴加乙酰乙酸乙酯71.5g(0.55mol)和二甲苯20ml混合液，滴畢，攪拌回流，共沸脫水至無(wú)水珠出現(xiàn)為止，繼續(xù)攪拌回流2h。反應(yīng)畢，冷卻，析出結(jié)晶，過(guò)濾，干燥，得白色粒狀結(jié)晶(3)56.2g(產(chǎn)率64.6％)，mp121-122℃B、1-(3-氯丙基)-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮(3)的制備在反應(yīng)瓶中，加入(2)5.042g(0.029mol)、1，3-氯溴丙烷6.5ml、苯37ml和氯化芐基三乙胺(TEBA)0.502g，攪拌溶解后，緩慢滴加60％氫氧化鈉溶液22ml，加畢，于60攪拌7h，反應(yīng)畢，冷卻，加入冷水，分出有機(jī)層，水層用苯提取，合并有機(jī)層，水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，固體抽濾，洗滌，干燥后加入一反應(yīng)瓶中，加乙醇40ml和鹽酸5ml，室溫?cái)嚢?h，將反應(yīng)液倒入冰水300ml中，析出白色固體，抽濾，干燥，得粗品(3)4.304g(產(chǎn)率70.6％)。用乙醇-水重結(jié)晶得白色晶體，mp114-115℃。
C、二苯甲基溴甲烷(4)的制備在反應(yīng)瓶中，加入二苯甲醇12g(0.065mol)、氫溴酸9.25g，升溫至100℃左右，緩慢滴加濃硫酸11ml，加畢，于115℃攪拌5h。冷卻，用苯提取，合并有機(jī)層，依次用碳酸氫鈉溶液、水洗滌，無(wú)水氯化鈣干燥，減壓旋掉溶劑，柱層析提純，得無(wú)色液體(4)14.505g(產(chǎn)率90.3％)。
D、二苯甲基哌嗪(5)的制備在反應(yīng)瓶中，加入六水哌嗪18.1g(0.093mol)、甲苯20ml，攪拌回流共沸脫水至無(wú)水珠出現(xiàn)為止。脫水畢，冷卻至40℃，滴加(4)2.47g(0.01mol)和甲苯3ml的溶液，加畢，加熱攪拌回流8h。反應(yīng)畢，冷卻，加水20ml，攪拌后，分出水層(可回收六水哌嗪)，有機(jī)層用水洗滌后，加入7mol/L鹽酸攪拌，用甲苯萃取。鹽酸層用10％氫氧化鈉溶液調(diào)至pH為12，析出晶體，過(guò)濾，干燥，得白色固體(5)1.713g(產(chǎn)率68.0％)，mp88-89℃(文獻(xiàn)89-91℃)。
E、1-[3-[4-(二苯甲基)-1-哌嗪基]丙基]-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮(奧沙米特，pkumdl_cvs_1005)(1)的合成在反應(yīng)瓶中，加入(4)1.052g(0.005mol)，二苯基哌嗪1.25g(0.005mol)、DMF4.5ml，三乙胺1ml(0.0022mol)，碘化鉀0.132g，于70-80℃攪拌反應(yīng)14小時(shí)，冷卻，將反應(yīng)液倒入20ml蒸餾水中，氯仿萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，柱層析提純，氯仿∶甲醇(體積比100∶5)淋洗，固體用異丙醇-異丙醚重結(jié)晶，得無(wú)色晶體1.2g(56.3％)，mp152-154℃1HNMR(CDCl3)δ1.95(s，2H，CH2C)，2.43(s，10H，哌嗪環(huán)上的和與哌嗪氮相連的CH2上的氫)，3.93(s，2H，CH2NCO)，4.21(s，1H，ArCH)，7.03(s，4H，Ar-H)，7.17-7.42(m，10H，苯環(huán)上的氫)，9.67(s，1H，ArNHCO)。
實(shí)施例2.1-二苯甲基-4-芐基哌嗪(pkumdl_cvs_1006)的合成按照實(shí)施例3中E步驟操作條件，把(4)換成芐基氯，制得1-二苯甲基4-芐基哌嗪，丙酮重結(jié)晶得無(wú)色晶體，產(chǎn)率81.2％。
1HNMR(CDCl3)δ2.46(s，8H，哌嗪環(huán)上的氫)，3.51(s，2H，CH2Ph)，4.23(s，1H，ArCH)，7.14-7.42(m，15H，苯環(huán)上的氫)實(shí)施例3.1-二苯甲基-4-[(吡啶-3-基)甲基]哌嗪(pkumdl_cvs_1007)的合成按照實(shí)施例3中E步驟操作條件，把(4)換成3-氯甲基吡啶鹽酸鹽，制得1-二苯甲基-4-[(吡啶-3-基)甲基]哌嗪，丙酮重結(jié)晶得無(wú)色晶體，產(chǎn)率61.8％。
1HNMR(CDCl3)δ2.41(s，8H，哌嗪環(huán)上的氫)，3.49(s，2H，CH2-)，4.27(s，1H，CH-)，7.12-7.42，7.65-7.69，8.43-8.45(m，d，d，14H，苯環(huán)與吡啶環(huán)上的氫)。
實(shí)施例4.2-[4-(二苯甲基)哌嗪-1-基]乙酰胺(pkumdl_cvs_1008)的合成按照實(shí)施例3中E步驟操作條件，把(4)換成氯乙酰胺，制得2-[4-(二苯甲基)哌嗪-1-基]乙酰胺，丙酮重結(jié)晶得無(wú)色晶體，產(chǎn)率88.2％。
1HNMR(CDCl3)δ2.42，2.57(d，8H，哌嗪環(huán)上的氫)，3.01(s，2H，CH2-)，4.24(s，1H，CH-)，5.50(寬單峰，1H，NH-)，7.03(寬單峰，1H，NH-)，7.14-7.42(m，10H，苯環(huán)上的氫)。
實(shí)施例5.SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的制備一、實(shí)驗(yàn)緩沖液體系1.破壁緩沖液40mM Tris-HCl100mM NaCl10mM咪唑7.5mM β-巰基乙醇2.Ni-NTA柱(1)洗柱緩沖液40mM Tris-HCl100mM NaCl10mM咪唑7.5mM β-巰基乙醇(2)洗脫緩沖液40mM Tris-HCl100mM NaCl250mM咪唑7.5mM β-巰基乙醇(3)凝膠過(guò)濾柱40mM Tris-HCl100mM NaCl7.5mM β-巰基乙醇二、操作步驟及方法1.載體構(gòu)建從3CL蛋白酶的克隆載體中用引物擴(kuò)增，通過(guò)Nhe I和Xho I的DNA限制性?xún)?nèi)切酶切口連接入表達(dá)載體pET21a(Novagen公司)，得到3CL蛋白酶的表達(dá)載體pET21a-3CLP-21x。該載體表達(dá)的3CL蛋白酶的氨基酸鏈碳端帶有6個(gè)組氨酸。
2.表達(dá)純化表達(dá)載體pET21a-3CLP-21x轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Novagen公司)。在轉(zhuǎn)化平板上挑取一個(gè)轉(zhuǎn)化子單菌落，50毫升LB培養(yǎng)基37℃，220轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)12小時(shí)后，按1％的接種量轉(zhuǎn)接入1升LB培養(yǎng)基中37℃，220轉(zhuǎn)/分鐘繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝0.8，加入終濃度為0.5mM/L的IPTG，30℃，240轉(zhuǎn)/分鐘誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)。5000g離心收集菌體，超聲破壁，24000g離心收集上清液。上清液過(guò)Ni-NTA柱(Qiagen公司)純化，過(guò)完Ni柱后得到的產(chǎn)品經(jīng)過(guò)超濾濃縮，再經(jīng)過(guò)Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾柱(Amersham Pharmacia公司)純化，最終得到95％以上純度的3CL蛋白酶產(chǎn)品，產(chǎn)量約每升培養(yǎng)液15毫克純蛋白。
實(shí)施例6.底物合成根據(jù)3CL蛋白酶在病毒多聚蛋白質(zhì)上的切點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一個(gè)11肽NH2-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-CONH2，作為3CL蛋白酶酶促反應(yīng)的分解底物，酶促反應(yīng)的分解產(chǎn)物分別為NH2-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-COOH和NH2-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-CONH2。利用標(biāo)準(zhǔn)的芴甲氧羰基(Fmoc)/叔丁基(tBu)保護(hù)策略多肽固相合成方法合成此底物11肽。多肽固相合成在Rink樹(shù)脂(Advanced ChemTech公司，美國(guó))上進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)方法1.稱(chēng)量0.667g Rink樹(shù)脂(取代值0.6mmol/g)，在反應(yīng)器中以5mL二氯甲烷溶脹3小時(shí)；2.抽干二氯甲烷，再加入40％六氫吡啶DMF溶液5mL，脫除Fmoc保護(hù)基，反應(yīng)40分鐘；3.抽干反應(yīng)液，以DMF、二氯甲烷、異丙醇、DMF順次洗滌樹(shù)脂；4.稱(chēng)量1.6mmol保護(hù)氨基酸，加入等摩爾量的1-羥基苯并三氮唑及2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-四甲基脲六氟磷酸鹽的N-甲基吡咯烷酮溶液2mL溶解，反應(yīng)成活潑酯，再加入等摩爾量二異丙基乙基胺；5.將此溶液加入反應(yīng)器，于搖床震蕩反應(yīng)3-5小時(shí)；6.反應(yīng)完成后，抽干反應(yīng)液，以DMF、二氯甲烷、異丙醇、DMF順次洗滌樹(shù)脂；7.取少量樹(shù)脂，加入干凈小試管，分別加入(1)水合茚三酮/無(wú)水乙醇溶液、(2)苯酚/無(wú)水乙醇溶液、(3)KCN/吡啶溶液各兩滴，于沸水浴中加熱2～3分鐘，觀察樹(shù)脂顏色。若樹(shù)脂無(wú)色，則反應(yīng)完全，可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)步驟8；若樹(shù)脂變藍(lán)色，則反應(yīng)不完全，應(yīng)自步驟4重新進(jìn)行這一步偶聯(lián)反應(yīng)；8.加入40％六氫吡啶DMF溶液5mL，脫除Fmoc保護(hù)基，反應(yīng)40分鐘；9.抽干反應(yīng)液，以DMF、二氯甲烷、異丙醇、DMF順次洗滌樹(shù)脂。按步驟4偶聯(lián)下一氨基酸；10.待所有氨基酸殘基偶聯(lián)完成并脫Fmoc保護(hù)后，將樹(shù)脂仔細(xì)洗滌干凈，真空干燥至恒重；11.每25mg肽樹(shù)脂加入1mL K試劑(5％水，5％苯酚，5％苯甲硫醚，2.5％二巰基乙烷，82.5％三氟乙酸)于室溫反應(yīng)不超過(guò)3小時(shí)；12.反應(yīng)完成后，加入大量冰乙醚中，冰凍過(guò)夜。過(guò)濾并用冰乙醚洗凈；13.用適當(dāng)濃度的乙腈/水溶液溶解，過(guò)濾除去樹(shù)脂，洗凈。濾液真空凍干，即得產(chǎn)物。
14.產(chǎn)物經(jīng)高壓液相色譜分離純化，以基質(zhì)輔助激光解吸附離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定分子量。
所用保護(hù)氨基酸分別為Fmoc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Gln-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Ser(But)-OH，，F(xiàn)moc-Thr(But)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH。
實(shí)施例7.反相高壓液相色譜測(cè)試抑制劑pkumdl_cvs_1003一、實(shí)驗(yàn)試劑儲(chǔ)備液Tris-HCl緩沖溶液儲(chǔ)備液200mM，pH＝8.0；二硫代蘇糖醇儲(chǔ)備液100mg/mL溶于水；3CL蛋白酶儲(chǔ)備液6mg/mL溶于Tris-HCl緩沖溶液，分子量為35kDa；底物11肽凍干粉，分子量為1192Da。
實(shí)驗(yàn)溶液Tris-HCl緩沖溶液40mM，pH＝8.0。
3CL蛋白酶溶液取10μL3CL蛋白酶儲(chǔ)備液，加二硫代蘇糖醇儲(chǔ)備液10μL，Tris-HCl緩沖溶液360μL。
底物11肽稱(chēng)量一定質(zhì)量?jī)龈煞?，用Tris-HCl緩沖溶液溶解至濃度為4mM。
終止液0.1％三氟乙酸水溶液抑制劑pkumdl_cvs_1003(Hydroxyzine Dihydrochloride)為ICN公司產(chǎn)品，CAS Number2192-20-3。將其溶于DMSO，制備成濃度為1mM的溶液。
二、操作步驟及方法取5μL Tris-HCl緩沖溶液，加5μL抑制劑DMSO溶液，20μL底物11肽溶液。加入20μL 3CL蛋白酶溶液后開(kāi)始計(jì)時(shí)，20分鐘后加入50μL終止液。
反應(yīng)時(shí)底物11肽濃度為1.6mM，3CL蛋白酶濃度為1.8μM，二硫代蘇糖醇濃度為6.8mM，抑制劑濃度為0.1mM。
高壓液相色譜分析Zorbax C18分析型反相色譜柱(Agilent公司，美國(guó))，Lab-Prep高壓液相色譜系統(tǒng)(Gilson公司，法國(guó))，Unipoint高壓液相色譜控制軟件(Gilson公司，法國(guó))，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220納米。流動(dòng)相A為0.1％三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1％三氟乙酸乙腈溶液，洗脫梯度為0至50％流動(dòng)相B，洗脫時(shí)間為15min，流速1mL/min，進(jìn)樣量80μL。
利用Unipoint高壓液相色譜控制軟件包含的峰面積積分方法計(jì)算底物11肽被3CL蛋白酶分解所得到的兩產(chǎn)物的峰面積。將此峰面積與空白樣品(為用不含抑制劑的DMSO配制的分析樣品)相應(yīng)峰面積對(duì)比，則可以確定生成產(chǎn)物減少的比例，可以據(jù)此計(jì)算抑制率。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在該實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得pkumdl_cvs_1003的抑制率為45.3％。
實(shí)施例8. 底物pNA標(biāo)記的酶活性體系測(cè)試抑制劑pkumdl_cvs_1006一、儀器酶標(biāo)儀Molecular Device，SpectraMax GeminiXS移液器GilsonTip頭 Axygen酶標(biāo)板Costar，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板離心管Axygen
pH計(jì)Cole ParmerEIMSMicromass GCT mass spectrometer，Manchester，England二、試劑pNA底物(Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-pNA)上海吉爾生化其余所用試劑均為市售分析純級(jí)三、溶液配制pNA儲(chǔ)液 2mM pNA dd-H2O溶液Buffer 1 Tris-HCl 20mM NaCl 100mMEDTA5mMDTT 1mMpH 7.4Buffer 2 Tris-HCl 75mM NaOAc25mMBis-Tris25mM Glycine 25mMEDTA5mMDTT 1mM我們?cè)O(shè)計(jì)并購(gòu)買(mǎi)得到了C-端對(duì)硝基苯胺(pNA)標(biāo)記的多肽底物，其序列為T(mén)hr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-pNA，其中Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln為酶自切位點(diǎn)的P1-P6序列，將自切位點(diǎn)的P1’位的Ser用顯色基團(tuán)pNA代替，酶催化水解Gln-pNA鍵，釋放出顯色化合物pNA，通過(guò)監(jiān)測(cè)pNA的生成速度確定底物的水解速度。所有實(shí)驗(yàn)都在37℃下完成，根據(jù)底物水解前后差譜，確定體系最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為390nm。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在25μM下測(cè)得pkumdl_cvs_1006的抑制率為38.3％。
實(shí)施例9.測(cè)試對(duì)Vero細(xì)胞培育的SARS病毒的抑制作用實(shí)驗(yàn)材料1.受試物pkumdl_cvs_10032.樣品來(lái)源北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院3.細(xì)胞Vero 150代4.病毒協(xié)和株7代5.溶液DMEM實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞單層接種法實(shí)驗(yàn)步驟一.pkumdl_cvs_1003對(duì)Vero細(xì)胞毒性測(cè)定1.Vero細(xì)胞12傳代，40萬(wàn)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)。
2.藥物pkumdl_cvs_1003先用100μL二甲基亞砜(DMSO)稀釋?zhuān)缓笥门囵B(yǎng)液配制成200μg/ml，二倍稀釋至1.5625μg/mL，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200μL。
3.每天觀察細(xì)胞CPE，三天后記錄結(jié)果，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損傷的藥物濃度為藥物的安全濃度。
4.結(jié)果

pkumdl_cvs_1003對(duì)Vero細(xì)胞無(wú)毒副作用的最大安全濃度為25μg/mL。
二.pkumdl_cvs_1003抗SARS病毒實(shí)驗(yàn)1.Vero細(xì)胞12傳代，40萬(wàn)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)。
2.藥物pkumdl_cvs_1003以培養(yǎng)液配制成25ug/mL，二倍稀釋至3.125μg/mL，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每稀釋度兩孔，每孔100μL。
3.加病毒協(xié)和株7代SARS病毒稀釋成10-4(10TCID50)，每孔100μL，37℃、5％CO2培養(yǎng)5天。
4.觀察結(jié)果

結(jié)論25μg/mL pkumdl_cvs_1003對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中的SARS冠狀病毒有抑制作用。
權(quán)利要求
1.式I化合物或其旋光異構(gòu)體或其水合物或其與酸形成的可藥用的鹽制備SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的抑制劑的用途， 式I其中，R11、R12、R13、R14、R15、R21、R22、R23、R24、R25獨(dú)立選自氫、C1～C4直鏈或支鏈烷基、C2～C5直鏈或支鏈烯基、C3～C8環(huán)烷基、C5～C8環(huán)烯基、鹵素、羥基、C1～C4烷氧基、硝基、羥甲基、酰胺基、三氟甲基、苯基、取代苯基，其中的烷基或烯基鏈上可以無(wú)取代，或者帶有一個(gè)或多個(gè)選自下面的取代基團(tuán)鹵素、苯基、C3～C8環(huán)烷基、C5～C7環(huán)烯基、硝基、羥甲基、酰胺基、三氟甲基、三氟甲氧基；Q為(CH2)nQ1，其中n為1～3的整數(shù)；Q1選自羥基、羥甲氧基、羥乙氧基、C1～C4烷氧基、苯基、吡啶基、酰胺基、C1～C4氮烷基、C1～C4氮，氮二烷基、1-氮取代-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮基、1-氮取代咪唑基。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述式I化合物的R13和/或R23為鹵素。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，其中所述鹵素為氯。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述式I化合物的Q1選自羥乙氧基、苯基、吡啶基、酰胺基、1-氮取代-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮基。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的式I化合物選自2-[2-[4-(4-氯苯基)苯基甲基-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇、1-[3-[4-(二苯甲基)-1-哌嗪基]丙基]-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮、1-二苯甲基-4-芐基哌嗪、1-二苯甲基-4-[(吡啶-3-基)甲基]哌嗪、2-[4-(二苯甲基)哌嗪-1-基]乙酰胺。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的式I化合物與酸形成的可藥用的鹽為鹽酸去氯羥嗪，其化學(xué)名是2-[2-[4-(4-氯苯基)苯基甲基-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇二鹽酸鹽。
7.式I化合物或其旋光異構(gòu)體或其水合物或其與酸形成的可藥用的鹽制備治療和預(yù)防SARS病毒感染的藥物的用途。
8.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，其中所述的式I化合物選自2-[2-[4-(4-氯苯基)苯基甲基-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇、1-[3-[4-(二苯甲基)-1-哌嗪基]丙基]-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮、1-二苯甲基-4-芐基哌嗪、1-二苯甲基-4-[(吡啶-3-基)甲基]哌嗪、2-[4-(二苯甲基)哌嗪-1-基]乙酰胺。
9.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述的式I化合物與酸形成的可藥用的鹽為鹽酸去氯羥嗪，其化學(xué)名是2-[2-[4-(4-氯苯基)苯基甲基-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇二鹽酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類(lèi)非肽類(lèi)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的抑制劑及其用途。該抑制劑為二苯甲基哌嗪類(lèi)衍生物，其抑制機(jī)理在于體積占位及其與3CL蛋白酶之間的疏水相互作用。利用反相高壓液相色譜方法和底物pNA標(biāo)記的酶活性體系進(jìn)行該抑制劑對(duì)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶活性影響的測(cè)試，證實(shí)其對(duì)3CL蛋白酶具有抑制作用，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)其對(duì)細(xì)胞培育的SARS冠狀病毒有抑制作用，可用于治療和預(yù)防SARS病毒感染。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1965833SQ20051008693
公開(kāi)日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2005年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月18日
發(fā)明者來(lái)魯華, 劉瑩, 劉振明, 范可強(qiáng), 黃?？? 魏平, 裴劍鋒, 劉士勇, 陳浩 申請(qǐng)人:北京大學(xué)