專利名稱：一種建立轉(zhuǎn)hCGβ基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種建立轉(zhuǎn)人絨毛膜促性腺激素β亞單位(hCGβ)基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型的方法。
背景技術(shù)：
人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)是一種由α和β兩個亞基組成的糖蛋白，其α亞基與FSH、LH和TSH等三種激素的分子結(jié)構(gòu)相同，β亞基是其特異性的組成部分。近年來研究表明，絨毛膜促性腺激素β亞基CGβ蛋白除了在正常的妊娠滋養(yǎng)層細胞中分泌外，許多人類腫瘤細胞也大量分泌特征性hCGβ蛋白。這些癌變的細胞不僅發(fā)生在性腺來源的組織上(如子宮癌、乳腺癌、卵巢癌等)，肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等非性腺起源的惡性細胞也能大量分泌hCGβ。多種組織的腫瘤選擇性分泌單鏈hCGα、hCGβ、hCGβ的核心片段(hCGβ-cf)，比較HCG、HCG-α、HCG-β3種作為腫瘤的標志，其中hCG-β的敏感性和特異性最強。hCGβ蛋白作為一項重要的血清學指標已被廣泛用于早期腫瘤的診斷。hCGβ在癌細胞中高效表達，并與腫瘤細胞的增殖、遷移和分化有一定的相關性，因此成為防治癌癥的有效目標分子之一。研究認為hCG的抗腫瘤效果與該分子誘導的控制細胞分化途徑進程的遺傳變異有關.而且這種改變可以長期的印記于基因組，從而調(diào)節(jié)機體對于細胞癌變的反應。利用RT-PCR檢測hCGβmRNA的方法可靈敏的檢測到早期的細胞癌變，并與腫瘤的擴增與衰退呈相關性變化。
我國現(xiàn)有癌癥病人300多萬人，每年死于惡性腫瘤的患者約為130萬人，并以3％的速度遞增。子宮頸癌、乳腺癌等生殖系統(tǒng)的腫瘤是十大高發(fā)性腫瘤，攻克生殖系統(tǒng)腫瘤是關系到全人類健康的重要課題。
乳腺癌是一種嚴重危害人類，尤其是女性的健康的惡性腫瘤。研究表明100％的體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞系表達hCGβ，76％的原位乳腺癌細胞表達hCGβ。而健康人不表達這個分子。CGβ作為腫瘤細胞分泌的特征分子之一，亦是防治癌癥的有效靶分子之一。許多實驗已證明利用CGβ純化蛋白、重組蛋白及合成多肽制作的疫苗能夠激發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生有效的免疫反應，從而抑制腫瘤細胞的生長。利用CGβ作為靶抗原，激發(fā)體液免疫反應產(chǎn)生保護性抗體，中和腫瘤細胞分泌的CGβ抗原，能抑制、阻斷腫瘤細胞生長。
然而，時至今日，CGβ在防治癌癥中仍無法進入臨床應用，其瓶頸是缺乏分泌hCGβ腫瘤動物模型，因為目前只在靈長類(包括人類)和極少數(shù)的大型動物檢測到CGβ表達，而在靈長類(包括人類)和極少數(shù)的大型動物建立分泌hCGβ中瘤動物模型是不現(xiàn)實的。而采用現(xiàn)有的技術(shù)將hCGβ轉(zhuǎn)入小鼠，要使小鼠腫瘤細胞穩(wěn)定表達hCGβ，即建立小型的動物模型是有難度的。因為hCGβ進入乳腺癌細胞后，引起細胞生長速度減慢，影響細胞周期，用目前現(xiàn)有的技術(shù)提取單克隆很難獲得轉(zhuǎn)hCGβ基因細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)還沒有建立分泌hCGβ腫瘤動物模型，采用帶有綠色熒光基因與hCGβ基因的共同表達真核表達載體pEGFP，結(jié)合流式細胞儀經(jīng)過三次富集篩選技術(shù)解決了現(xiàn)有技術(shù)提取單克隆很難獲得轉(zhuǎn)hCGβ基因細胞的難題，從而提供一種建立轉(zhuǎn)人絨毛膜促性腺激素β亞單位(hCGβ)基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型的方法。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供的建立轉(zhuǎn)hCGβ基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型的方法，包括下述步驟1)制得全長基因hCGβ，該基因在基因文庫編號為hCGβNM000737；1-1)提取人流產(chǎn)胎盤組織總核糖核酸；1-2)設計特異性引物上游引物5′-cgcaagcttgccaccatggagatgttccaggg-3′；下游引物5′-cgggatcctgtgggaggatcggggtg-3′；1-3)通過溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式擴增方法，克隆得到全長基因hCGβ。
2)利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化上述hCGβcDNA片段；3)將步驟2)得到的hCGβcDNA片段重組到帶有pEGFP標記的真核表達載體中，構(gòu)建成pEGFP-hCGβ真核表達質(zhì)粒；4)將pEGFP-hCGβ真核表達質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細胞；所述的小鼠乳腺癌細胞優(yōu)選綠色熒光基因與hCGβ的共同穩(wěn)定表達的4T1小鼠乳腺癌細胞。
5)用流式細胞儀篩選熒光陽性pEGFP-hCGβ轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌細胞；6)使用Western-Blotting驗證步驟5)中熒光陽性pEGFP-hCGβ轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌細胞中hCGβ蛋白表達；7)流式細胞儀三次富集篩選技術(shù)獲得轉(zhuǎn)hCGβ基因的小鼠乳腺癌細胞；8)將步驟7)中測得的pEGFP-hCGβ轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌細胞注射到小鼠的乳腺位置，得到了轉(zhuǎn)hCGβ基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型。
本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)hCGβ基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型，填補了沒有建立分泌hCGβ腫瘤動物模型的空白，可以用于研究hCGβ與乳腺癌腫瘤發(fā)生，增殖，遷移和分化的機理，為在體評價CGβ抗腫瘤的效果提供小型動物模型。這對CGβ在防治hCGβ分泌型腫瘤的基礎理論研究和臨床前的應用研究具有重要意義。另外，其使用綠色熒光基因與hCGβ的共同表達，使在體直接觀察腫瘤的生長，轉(zhuǎn)移成為可能。


圖1為使用流式細胞儀分選488nm陽性的細胞的結(jié)果圖；圖2為轉(zhuǎn)hCGβ-EGFP基因細胞在熒光顯微鏡下的照片，其中綠色熒光(箭頭所示)為轉(zhuǎn)hCGβ-EGFP基因細胞；圖3為接種1×104個腫瘤細胞后生長曲線。
具體實施例方式
實施例1、本發(fā)明的pEGFP-hCGβ真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建本發(fā)明的pEGFP-hCGβ的構(gòu)建步驟如下1)提取人流產(chǎn)胎盤組織總核糖核酸取流產(chǎn)的胎盤(經(jīng)過病人許可)。在冰浴中將0.5克胎盤組織投入6mL RNA變性提取液(其為Invitrogen公司購得的Trizol提取液)，用組織勻漿機充分破碎；加入0.6mL2mol/L乙酸鈉、6mL體積比為125∶24∶1的酚∶氯仿∶異丙醇的混合液，充分振搖15秒，冰浴15分鐘；在4℃以10000g的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，分出上層清液，加入等體積的異丙醇，于-20℃放置30分鐘；在4℃以10000g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，分出沉淀物，用70％7醇洗滌沉淀兩次，真空干燥，加入無核酸酶水500μL溶解后，得到胎盤組織總RNA提取液，于-80℃保存；取此胎盤組織總RNA提取液(其為Invitrogen公司購得的Trizol提取液)，5μL，進行1.5wt％(重量百分比)甲醛變性瓊脂糖凝膠(含EB0.2μg/mL)電泳檢測，凝膠條帶分析結(jié)果顯示所制備的樣品中28S rRNA的量約為18S rRNA的二倍，此結(jié)果證明了總RNA的完整性。。
2)設計特異性引物上游引物5′-cgcaagcttgccaccatggagatgttccaggg-3′；下游引物5′-cgggatcctgtgggaggatcggggtg-3′；3)通過TDRT-PCR(溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應)擴增hCGβmRNA50μL的反應體系由10μL的AMV/Tfl5×反應緩沖液、2mM的dNTPs混合物、2mM的MgSO4、1μM的上游引物及上游引物、0.1U/μL的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、0.1U/μL的RNasin核糖核酸酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor)、2μg，步驟1)得到的總RNA和無核酸酶的水組成，并在此水溶液上覆蓋50μL無核酸酶礦物油；逆轉(zhuǎn)錄反應在48℃反應45分鐘，接著在95℃滅活5分鐘，并啟動TDRT-PCR擴增反應在第一個變性步驟時加入0.1U/μL的Tfl DNA聚合酶，在降落TDRT-PCR擴增階段，變性溫度為94℃，持續(xù)1分鐘，退火溫度從65℃開始，持續(xù)1分鐘，然后以每兩個循環(huán)下降1℃的速度降至55℃，出現(xiàn)1分鐘，延伸溫度為68℃，持續(xù)40秒；最后在以退火溫度60℃分鐘繼續(xù)擴增15個循環(huán)；最后在72℃延伸10分鐘；克隆得到全長基因hCGβ，該基因在基因文庫編號為hCGβNM000737；4)通過TDRT-PCR擴增的hCGβ，方法同3)，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化hCGβcDNA片段，并將其重組到真核表達載體pEGFP中，構(gòu)建成pEGFP-hCGβ真核表達質(zhì)粒利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化hCGβcDNA片段；純化片段7μL用1μL HindHI和BamH I雙酶切，真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1(該質(zhì)粒購自Clontech公司)經(jīng)過同樣的雙酶切。回收酶切產(chǎn)物，各取1μL建立連接反應，再加入無核酸酶的水至8.0μL，然后加入10×T4 DNA連接酶緩沖液1μL和1U/μL T4 DNA連接酶，混勻后用微量離心機甩至管底，于16℃保溫12小時，得到連接反應產(chǎn)物；
5)質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化將50μL的感受態(tài)細胞DH5α在冰上化凍后加入1～2μL步驟4)得到的連接反應產(chǎn)物，并在冰上放置30分鐘。然后在42℃水浴中熱激30秒，再迅速置于冰上冷卻2分鐘。加入250μL SOC培養(yǎng)基，于37℃在恒溫搖床上以225轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞恢復正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生抗藥性(KAN+)；將上述菌液搖勻后取50μL涂布于篩選LB平板上，其含有75μg/mL卡拉霉素，于37℃培養(yǎng)16～24小時；用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含有75μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)12小時；使用堿裂法提取質(zhì)粒DNA，選擇有正向插入外源DNA片斷的重組克隆質(zhì)粒；測序正確的菌再次搖菌，用Qiagen無內(nèi)毒素試劑盒提取，得到pEGFP-hCGβ質(zhì)粒，備用。
實施例2、將pEGFP-hCGβ真核表達質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染4T1小鼠乳腺癌細胞。
在24孔板中長滿90％的小鼠乳腺癌細胞4T1用無血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗兩遍。將2μg pEGFP-hCGβ質(zhì)粒加入到100μL無血清的DMEM培養(yǎng)液中輕輕混勻，5μL脂質(zhì)體加入到95μL無血清的DMEM培養(yǎng)液中輕輕混勻。將質(zhì)粒和脂質(zhì)體加到一個管中，輕輕完全混勻，室溫放置20分鐘后，把混合物加入到經(jīng)過新鮮培養(yǎng)液沖洗的細胞上，補加300μL無血清的DMEM培養(yǎng)液。細胞放37℃，5％CO2培養(yǎng)12小時后，換加含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12小時后將細胞用胰蛋白酶消化到60毫米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，24小時后，在培養(yǎng)液中加入800μg/mLG418硫酸鹽酸鹽。大約2周后，在培養(yǎng)皿中形成細胞集落，挑取集落繼續(xù)培養(yǎng)準備進一步用流式細胞儀器篩選。
實施例3、使用流式細胞儀篩選488nm熒光陽性4T1小鼠乳腺癌細胞將實施例2中得到的經(jīng)過藥物篩選的細胞用DMEM培養(yǎng)液洗滌兩遍后，加入1mL0.25％胰蛋白酶+0.04％EDTA消化液。待細胞完全消化成單細胞后，加1mL含血清的完全培養(yǎng)液終止消化。500g離心細胞5分鐘后，細胞用100/200目細胞篩過濾去成團細胞。過濾后的單細胞用DMEM重懸成單細胞懸液。
流式細胞儀分選488nm陽性的細胞。用正常的4T1單細胞作為分選陰性對照。
分選出的陽性細胞繼續(xù)培養(yǎng)，反復篩選三次后，細胞用流式細胞儀和熒光顯微鏡分析純度。熒光顯微鏡和流式分析證明hCGβ-EGFP表達細胞純度為97.8％。
如圖1所示，流式細胞儀分選488nm陽性的細胞，即轉(zhuǎn)入hCGβ的4T1小鼠乳腺癌細胞。用正常的4T1細胞作為分選陰性對照，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入hCGβ基因4T1細胞占細胞總數(shù)目的97.8％。P1是篩選的總細胞數(shù)，P2是沒有轉(zhuǎn)入hCGβ基因4T1細胞，P3是轉(zhuǎn)入hCGβ的4T1細胞。
實施例4、使用Western-Blotting驗證熒光陽性4T1小鼠乳腺癌細胞中hCGβ蛋白表達將實施例3中分選出的陽性細胞培養(yǎng)液棄去培養(yǎng)液后用室溫的PBS沖洗2～3遍，用細胞刮刮下細胞后在EP管中煮沸10min，期間顛倒2～3次，將EP管置于0℃后在14000～16000g離心2min，待樣品恢復到室溫后上樣。12％分離膠分離蛋白后濕法轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。5％牛血清白蛋白封閉1小時，洗滌膜，加入鼠抗hCGβ單克隆抗體(該抗體購自calbiochemistry公司)后進行三次洗滌膜，膜上滴加HRP標記的抗鼠二抗(該二抗購自中山公司)；ECL顯色，膠片感受化學發(fā)光。
結(jié)果證明hCGβ蛋白在4T1轉(zhuǎn)基因細胞中表達，而對照細胞(未轉(zhuǎn)入hCGβ的4T1小鼠乳腺癌細胞)無表達。
實施例5、熒光檢測將實施例2中得到的轉(zhuǎn)入hCGβ-EGFP基因的細胞在熒光顯微鏡觀察，細胞質(zhì)中有明顯的綠色熒光表達，如圖2箭頭所示，證明hCGβ主要表達部位是細胞質(zhì)。而作為對照的EGFP綠色熒光在細胞的各個部位均有表達，主要表達在細胞核。顯微鏡檢測進一步證明所有鏡檢的4T1-hCGβ細胞均為陽性。
實施例6、表達hCGβ蛋白的小鼠乳腺癌動物模型構(gòu)建1×104和1×105轉(zhuǎn)基因細胞皮下注射BALB/C小鼠的乳腺位置，第九天成瘤率100％(N＝20)。每隔三天測量一次小鼠腫瘤大小，計算公式腫瘤體積＝4/3π(1/2長)×(1/2寬)2。結(jié)果如圖3所示，小鼠腫瘤大小生長相對穩(wěn)定，與接種天數(shù)成正比關系。
實施例7、表達hCGβ蛋白的小鼠乳腺癌動物模型利用表達hCGβ蛋白的小鼠乳腺癌動物模型，進行pCR3.1-rmCGβ基因疫苗免疫治療乳腺癌的動物實驗。
1.構(gòu)建PCR3.1-rmCGβ，構(gòu)建步驟如下1)胎盤組織總RNA提取用常規(guī)方法提取恒河猴胎盤組織總RNA；
2)克隆得到恒河猴CGβ(rmCGβ)的全長基因，該基因已登入基因文庫rmCGβAY011015；3)通過TDRT-PCR(溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應)擴增rmCG mRNA；4)通過TDRT-PCR擴增的rmCGβ，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化rmCGβ cDNA片段；5)質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化將50μL的感受態(tài)細胞DH5α在冰上化凍后加入2μL0.5Mβ-ME，1-2μL步驟4)得到的連接反應產(chǎn)物，并在冰上放置30分鐘。然后在42℃水浴中熱激30秒，再迅速置于冰上冷卻2分鐘。加入250μL SOC培養(yǎng)基，于37℃在恒溫搖床上以225轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞恢復正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生抗藥性(Amp+)；將上述菌液搖勻后取50μL涂布于篩選LB平板上，其含有75μg/mL Amp，且表面涂有50μg/mL X-gal，于37℃培養(yǎng)16-24小時；用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含有75μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)12小時；使用堿裂法提取質(zhì)粒DNA，選擇有正向插入外源DNA片斷的重組克隆質(zhì)粒；2.用表達hCGβ蛋白的小鼠乳腺癌動物模型進行pCR3.1-rmCGβ基因疫苗免疫治療乳腺癌的動物實驗。
將BALB/c小鼠分成4組，每組10只，第4組為20只第1組注射轉(zhuǎn)入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1細胞，1周后不接種任何物質(zhì)；第2組注射轉(zhuǎn)入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1細胞，1周后接種100μl生理鹽水；第3組注射轉(zhuǎn)入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1細胞，1周后接種100μl pCR3.1空質(zhì)粒(100μg)；第4組注射轉(zhuǎn)入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1細胞，1周后接種100μl pCR3.1-rmCGβ(100μg)。
上述轉(zhuǎn)入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1細胞量均為1×103；每隔一周加強一次，共免疫三次。每隔三天測量一次腫瘤大小。
從注射轉(zhuǎn)入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1細胞開始計時觀察，每隔三天測量一次腫瘤大小，結(jié)果為第1組、第2組、第3組共30只小鼠12天后均發(fā)現(xiàn)腫瘤塊，其大小為30-50mm3；27天時檢查，其中4只小鼠死亡，另26只小鼠均仍有腫瘤塊，其大小為360-410mm3；36天時檢查，腫瘤塊大小為780-820mm3；
第4組的20只小鼠在12天后檢查，均發(fā)現(xiàn)腫瘤塊，其大小為20-30mm3；27天時檢查，其中5只腫瘤塊長大，其大小為220-410mm3，15只小鼠仍有腫瘤塊，但其大小為未見增大(有些腫瘤塊變小)；36天時檢查，小鼠腫瘤塊大小仍未見明顯增大。
利用表達hCGβ蛋白的小鼠乳腺癌動物模型，進行上述pCR3.1-rmCGβ基因疫苗免疫治療乳腺癌的動物實驗，結(jié)果顯示抑癌率達到70％。
權(quán)利要求
1.一種建立轉(zhuǎn)hCGβ基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型的方法，包括下述步驟1)制得全長基因hCGβ，該基因在基因文庫編號為hCGβNM000737；2)回收純化上述hCGβcDNA片段；3)將步驟2)得到的hCGβcDNA片段重組到帶有pEGFP標記的真核表達載體中，構(gòu)建成pEGFP-hCGβ真核表達質(zhì)粒；4)將pEGFP-hCGβ真核表達質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細胞；5)用流式細胞儀篩選熒光陽性pEGFP-hCGβ轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌細胞；6)使用Western-Blotting驗證步驟5)中熒光陽性pEGFP-hCGβ轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌細胞中hCGβ蛋白表達；7)流式細胞儀三次富集篩選技術(shù)獲得轉(zhuǎn)hCGβ基因的小鼠乳腺癌細胞；8)將步驟7)中測得的pEGFP-hCGβ轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌細胞注射到小鼠的乳腺位置，得到了轉(zhuǎn)hCGβ基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型。
2.如權(quán)利要求1所述的建立轉(zhuǎn)hCGβ基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型的方法，其特征在于，所述的全長基因hCGβ的制備是通過1)提取人流產(chǎn)胎盤組織總核糖核酸；2)設計特異性引物上游引物5′-cgcaagcttgccaccatggagatgttccaggg-3′；下游引物5′-cgggatcctgtgggaggatcggggtg-3′；3)通過溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式擴增方法，克隆得到全長基因hCGβ。
3.如權(quán)利要求1所述的建立轉(zhuǎn)hCGβ基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型的方法，其特征在于，所述的小鼠乳腺癌細胞是綠色熒光基因與hCGβ的共同穩(wěn)定表達的4T1小鼠乳腺癌細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種建立轉(zhuǎn)人絨毛膜促性腺激素β亞單位(hCGβ)基因的小鼠乳腺癌腫瘤模型的方法，其為采用帶有綠色熒光基因與hCGβ基因的共同表達真核表達載體pEGFP，結(jié)合流式細胞儀經(jīng)過三次富集篩選技術(shù)，解決了現(xiàn)有技術(shù)提取單克隆很難獲得轉(zhuǎn)hCGβ基因細胞的難題，填補了沒有建立分泌hCGβ腫瘤動物模型的空白，可以用于研究hCGβ與乳腺癌腫瘤發(fā)生，增殖，遷移和分化的機理，為在體評價CGβ抗腫瘤的效果提供小型動物模型。這對CGβ在防治hCGβ分泌型腫瘤的基礎理論研究和臨床前的應用研究具有重要意義。另外，其使用綠色熒光基因與hCGβ的共同表達，使在體直接觀察腫瘤的生長，轉(zhuǎn)移成為可能。
文檔編號A61K49/00GK1935266SQ20051008651
公開日2007年3月28日 申請日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者石樹群, 彭景楩 申請人:中國科學院動物研究所