專利名稱：活性蛋白復(fù)合型納米硒的制備及液相保存技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種活性蛋白復(fù)合型納米硒的制備方法和保存技術(shù)。
背景技術(shù)：
硒是人體生命活動(dòng)必需的微量元素，其生物效應(yīng)是多方面的。硒參與構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)硫氧還蛋白還原酶、脫碘酶等的活性中心，補(bǔ)充一定劑量的硒可以增強(qiáng)紅細(xì)胞及肝臟中GSH-Px的活性，能提高免疫系統(tǒng)的保護(hù)能力及抵抗能力，拮抗和降低某些有毒元素及物質(zhì)的毒性，硒對癌癥、艾滋病、心血管病、克山病和白內(nèi)障的防預(yù)與治療均起著不可忽視的作用，同時(shí)，有著明顯的抗衰老效果。一些無機(jī)態(tài)的硒和有機(jī)硒都有較好的生物活性，但大多對生命體有較高的急性毒性，限制了它們的應(yīng)用。
試驗(yàn)研究表明，與無機(jī)硒(如亞硒酸鈉或二氧化硒等)、有機(jī)硒(如硒蛋氨酸、硒酵母等)相比，納米硒既有很高的生物學(xué)活性，又顯示出低毒高效特征在急性毒性(LD50)方面，無機(jī)硒為15mg/kg，有機(jī)硒為35mg/kg，納米硒則為113mg/kg。在緩慢毒性方面，飼料中無機(jī)硒或有機(jī)硒的含量在4-5ppm時(shí)即可導(dǎo)致大鼠體重下降和肝硬化，而納米硒含量在6ppm時(shí)也不發(fā)生上述現(xiàn)象。納米硒還有護(hù)肝、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用；延緩衰老、抗氧化作用?？傊?，納米硒具有無機(jī)硒和有機(jī)硒不可比擬的高安全性及高生物性的特點(diǎn)，是已發(fā)現(xiàn)的急性毒性最低的補(bǔ)硒制劑。
納米硒的生物活性已被認(rèn)可，中華人民共和國發(fā)明專利ZL97107038.5關(guān)于活性紅色單質(zhì)硒的制備方法，闡明了單質(zhì)制備方法合活性試驗(yàn)結(jié)果，“硒旺”膠囊(納米硒)相繼被國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為保健食品(衛(wèi)食健字1998第134號)。該發(fā)明中的納米硒需以固態(tài)粉末的形式加以保存。
活性蛋白是一類從微生物或微藻中提取的天然蛋白或重組蛋白，例如從螺旋藻中提取的藻膽蛋白(含藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白)。
藻藍(lán)蛋白是螺旋藻中重要的活性成分之一，具有明顯的抗氧化活性，可清除吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧，拮抗過氧化硝基對DNA的氧化損傷，減輕氧自由基對神經(jīng)細(xì)胞的毒害，能提高機(jī)體免疫力促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞再生，促進(jìn)PHA誘導(dǎo)的正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、增強(qiáng)空斑形成細(xì)胞溶血能力和血清中溶血素的含量，有恢復(fù)T細(xì)胞受環(huán)磷酸酰胺損傷后E玫瑰花環(huán)的形成能力。藻藍(lán)蛋白具有抗腫瘤、抗輻射、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、清除自由基及抑制癌細(xì)胞的能力，廣泛用于食品、化妝品、染料等工業(yè)，用于臨床診斷、免疫學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域。作為一種重要的活性成分，又可制成藥品用于醫(yī)療保健。
在中華人民共和國發(fā)明專利ZL97107038.5活性紅色單質(zhì)硒的制備方法中單質(zhì)硒制備的方法中，存在著如下問題和缺點(diǎn)
1.沒有闡明單質(zhì)硒的微粒狀態(tài)，因而只籠統(tǒng)地稱蛋白質(zhì)態(tài)或多肽類，同時(shí)，所用蛋白質(zhì)僅為分散劑，只是單質(zhì)硒制備的必需品，但不具備相應(yīng)的生物活性。
2.單質(zhì)硒的制備過程中需加入還原劑。
3.產(chǎn)品單質(zhì)硒需經(jīng)分離而以固態(tài)形式存在，固而其開發(fā)產(chǎn)品為膠囊，即“硒旺”膠囊(衛(wèi)食健字1998第134號)。
現(xiàn)有技術(shù)中還未見納米硒活性蛋白復(fù)合物及其制備和保存方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的為提供一種活性蛋白如藻藍(lán)蛋白與納米硒的復(fù)合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的為提供上述活性蛋白和納米硒復(fù)合物的制備方法。本發(fā)明的還一個(gè)目的為提供上述活性蛋白和納米硒復(fù)合物的液相保存方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題為1.解決了保持活性蛋白與納米硒各自活性的問題。蛋白本身具有良好生物活性，而在液相體系中，活性蛋白既是還原劑又是分散劑；活性蛋白對納米硒特殊的聚集形態(tài)和排列起穩(wěn)定和保護(hù)作用；活性蛋白對整個(gè)液相體系中的納米硒粒子起到保存作用，獲得的活性活性蛋白復(fù)合型納米硒可直接應(yīng)用于實(shí)際研究和生產(chǎn)中。
2.解決了納米硒在液相中的貯存問題，從而開辟了納米單質(zhì)硒新的使用方式，如口服液、注射劑和噴霧劑。無需外加還原劑原位直接將亞硒酸鈉或二氧化硒[下簡稱Se(IV)]還原即可得到活性蛋白復(fù)合型納米硒，所制備的活性蛋白復(fù)合型納米硒無需進(jìn)一步分離而直接在液相中保存，這種液相中的活性蛋白復(fù)合型納米硒可直接作為含硒保健口服液、含硒注射劑或含硒噴霧劑，必要時(shí)，也可進(jìn)一步處理制成活性復(fù)合型納米硒膠囊。
本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，具體步驟為1.取一定體積的藻藍(lán)蛋白，藻藍(lán)蛋白的濃度可以根據(jù)實(shí)際情況確定，2.加入一定體積的Se(IV)溶液，Se(IV)的濃度可根據(jù)情況而定，使藻藍(lán)蛋白的最終濃度達(dá)到約3.5μmol/L，3.兩者的加入順序可以改變。
藻藍(lán)蛋白能將+4價(jià)硒[亞硒酸鈉或二氧化硒，即Se(IV)]還原成0價(jià)硒并形成復(fù)合型納米硒。
藻藍(lán)蛋白和Se(IV)的各自濃度，以Se(IV)與藻藍(lán)蛋白摩爾比(R)為5～20(即含硒量在1.39～5.53μg/mL)效果較好。
本發(fā)明的技術(shù)效果1.實(shí)現(xiàn)了復(fù)合物體系中硒以活性蛋白復(fù)合的納米硒狀態(tài)存在。
2.復(fù)合物體系中蛋白質(zhì)組分可發(fā)揮多種功能，不僅僅是分散劑和穩(wěn)定劑，還是重要活性組分和還原劑，從而強(qiáng)化了納米硒的活性并大大簡化了生成、保存手法。
3.解決了納米硒的液相保存技術(shù)問題，活性蛋白復(fù)合型納米硒制備和直接以水溶液保存。在4℃～6℃溫度下保存5個(gè)月仍保持穩(wěn)定，從而開辟納米硒新的應(yīng)用方式，如口服液、注射劑和噴霧劑等。
4.復(fù)合物液相體系中，活性蛋白和納米硒的含量均可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整，以滿足各種不同的劑量要求。
四

圖1為Se(IV)與藻藍(lán)蛋白摩爾比R＝10時(shí)制得的活性蛋白復(fù)合型納米硒的TEM照片。
圖2為納米硒對超氧離子和羥自由基清除作用結(jié)果圖。A為對超氧離子的結(jié)果；B為對羥自由基的結(jié)果。
五具體實(shí)施例方式
以下通過具體的實(shí)施例對技術(shù)方案作進(jìn)一步描述，所提供的實(shí)施例并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)例1活性藻藍(lán)蛋白復(fù)合納米硒的制備1.取3mL濃度為7μmol/L的藻藍(lán)蛋白，2.加入3mL濃度為70μmol/L的Se(IV)溶液，使藻藍(lán)蛋白的最終濃度達(dá)到3.5μmol/L，室溫混勻。
所得的復(fù)合物如圖1所示，從圖1的透射電鏡可見，生成的納米硒呈球形(圖A和B)分布，藻藍(lán)蛋白的存在對納米硒的有明顯的均勻分散作用和穩(wěn)定作用，生成的納米硒粒子吸附在藻藍(lán)蛋白表面，形成核-殼的復(fù)合型納米材料。
實(shí)施例2活性藻藍(lán)蛋白復(fù)合納米硒體外抗氧化活性1.納米硒對自由基的清除作用納米硒對自由基具有較強(qiáng)的清除作用，最大清除率達(dá)30％左右，比相同劑量的硒代蛋氨酸對自由基清除作用明顯增強(qiáng)。需要提出的是，亞硒酸鈉在這一劑量范圍內(nèi)不僅未發(fā)現(xiàn)對自由基的清除效應(yīng)，反而會增強(qiáng)自由基產(chǎn)生。具體結(jié)果見圖2。
2.納米硒的EC50結(jié)果見下表1，納米硒的EC50只相當(dāng)于Se-Met的50％。
表1納米硒體外清除超氧離子和羥自由基的EC50

實(shí)施例3納米硒體內(nèi)生物活性1.對小鼠的急性毒性納米硒的LD50為122.8mg Se/kg BW(body weight)，95％可信度區(qū)間為90.8-167.5mg Se/kg BW。而無機(jī)硒亞硒酸鈉的LD50為15.5mg Se/kg BW，95％可信度區(qū)間為12.3-18.4mg Se/kg BW。結(jié)果說明，微藻轉(zhuǎn)化的納米硒比亞硒酸鈉的急性毒性劑量低7.9倍。
2.對細(xì)胞活性的影響在強(qiáng)氧化劑誘導(dǎo)細(xì)胞毒性時(shí)，納米硒的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)高于亞硒酸鈉，在32ng/ml時(shí)與亞硒酸鈉相比即具有顯著性意義。對人肝癌細(xì)胞株則表現(xiàn)出一定程度的生長抑制效應(yīng)，而且納米硒比亞硒酸鈉的效應(yīng)更為明顯。
3.對細(xì)胞硒酶活性的影響 納米硒只有在高劑量時(shí)對GPx酶活性的增強(qiáng)作用比亞硒酸鈉高，對TR的效應(yīng)則低于亞硒酸鈉。
4.小鼠不同組織器官中硒的含量 納米硒對缺硒小鼠血及組織硒水平均具有明顯提高作用。對小鼠肝、血和腎中硒水平的提高作用相對較快。納米硒對睪丸組織中硒水平的提高作用較弱。第8周時(shí)，以補(bǔ)充亞硒酸鈉小鼠肝組織硒含量為100％，補(bǔ)充Nano-Se的小鼠肝組織硒含量為90.5％。
5.對小鼠不同組織器官中GPx活性的影響以第8周時(shí)補(bǔ)充亞硒酸鈉小鼠組織的GPx活性為100％，補(bǔ)充Nano-Se對血中GPx活性提高最明顯，為122.7％。采用缺硒小鼠模型，用硒酶活性恢復(fù)率與組織硒含量恢復(fù)率的比值作為各含硒組分對小鼠不同組織的活性指數(shù)(Activityindex)，納米硒對不同組織平均活性指數(shù)為1.4。
6.對硒酶GPx1、GPx4基因表達(dá)的影響 半定量RT-PCR結(jié)果表明，口服納米硒對小鼠肝組織中GPx1和GPx4 mRNA轉(zhuǎn)錄有一定程度的上調(diào)作用，平均約1.5-2。
權(quán)利要求
1.一種液相體系中活性蛋白復(fù)合型納米硒，其特征在于是由活性蛋白和納米硒組成的復(fù)合物。
2.一種液相體系中活性蛋白復(fù)合型納米硒的制備方法，其特征在于由亞硒酸鹽溶液同活性蛋白溶液直接反應(yīng)而生成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的亞硒酸鹽為亞硒酸鈉或二氧化硒，即4價(jià)態(tài)的無機(jī)硒化合物Se(IV)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于液相中的納米硒量是可依據(jù)需要而調(diào)節(jié)控制的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的制備方法，其特征在于復(fù)合型指的是活性蛋白與納米硒粒子存在特定的相互作用，蛋白本身是一種活性成分，同時(shí)在該體系中活性蛋白既是還原劑又是分散劑和穩(wěn)定劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述活性蛋白復(fù)合型納米硒的保存技術(shù)，其特征在于活性蛋白復(fù)合型納米硒按照權(quán)利要求2所述方法制備后無需分離而直接在液相中保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的保存技術(shù)，其特征在于活性蛋白復(fù)合型納米硒可直接以水溶液的形式保存于4℃～6℃冰箱中，貯存5個(gè)月而保持穩(wěn)定。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述活性蛋白復(fù)合型納米硒的應(yīng)用，其可直接作為含硒口服液、含硒注射劑或含硒噴霧劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了活性蛋白復(fù)合型納米硒，及其制備方法和液相保存技術(shù)，既保證了納米態(tài)硒的穩(wěn)定存在又使兩種活性物質(zhì)反應(yīng)制得新型的復(fù)合藥物，對解決硒利用的急性毒性問題和開發(fā)新型納米藥物，開辟了活性納米硒新的使用方式?；钚缘鞍讖?fù)合型納米硒進(jìn)入動(dòng)物體的途徑是多方面的，既可以口服液形式通過消化道吸收進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)代謝，又可以注射或噴霧方式吸收。
文檔編號A61P31/00GK1947792SQ20051008660
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月13日
發(fā)明者鄭文杰, 楊芳, 黃峙, 郭振江, 陳填烽, 白燕 申請人:暨南大學(xué)