細(xì)胞膜穿透肽hPP5及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體講，涉及一種細(xì)胞膜穿透肽及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人類基因組計(jì)劃的完成和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的生物分子 比如蛋白質(zhì)、多肽、核酸等均有可能成為治療藥物。但是與傳統(tǒng)藥物不同的是，這些治療分 子在體內(nèi)穩(wěn)定性低，需要在胞內(nèi)發(fā)揮功能的分子難以進(jìn)入細(xì)胞，因而會限制其作為藥物的 推廣應(yīng)用。故開發(fā)能有效攜帶這些治療性生物大分子進(jìn)入靶細(xì)胞，且經(jīng)濟(jì)、安全的載體系統(tǒng) 是亟需解決的問題。
[0003] 近年來，非病毒藥物運(yùn)輸載體以其安全性、低毒性、低免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)被寄予厚 望。迄今比較常用的生物大分子細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入方式有電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和有機(jī)高分子納米 顆粒等。但可能存在著安全隱患如對細(xì)胞的毒性作用、胞內(nèi)釋放困難、難于組裝及操作、難 于應(yīng)用到個(gè)體等這樣或那樣的缺點(diǎn)。因此尋找新型的、理想的非病毒藥物輸送系統(tǒng)引起了 學(xué)者們的廣泛興趣（圖1)。
[0004] 在過去的20多年間，將核酸、多肽、蛋白等具有治療作用的生物活性大分子跨膜 轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)技術(shù)的基礎(chǔ)研究取得了突破性進(jìn)展。國內(nèi)外學(xué)者在對一些病毒感染特性的研 究中相繼發(fā)現(xiàn)了一類蛋白結(jié)構(gòu)域，如：HIV-lTat(48~60)、VP22 (267~300)以及果蠅蛋白 ANTP(43~58)等具有介導(dǎo)異源蛋白、寡聚核酸、金屬螯合物等生物活性大分子直接跨過細(xì) 胞膜進(jìn)入胞漿和核內(nèi)的功能，這一類富含陽離子、具有穿膜功能的短肽被稱之為細(xì)胞膜穿 透肽（cell-penetratingpeptides，CPP)、穿膜肽或蛋白車專導(dǎo)域（proteintransduction domains，PTDs)。1988年Green和Frankel等首次發(fā)現(xiàn)TAT--人免疫缺陷病毒（HIV) 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可以穿透細(xì)胞膜/核膜進(jìn)入細(xì)胞漿/細(xì)胞核，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白 第48-60位氨基酸殘基（YGRKKRRQRRR)形成的肽段即可完全發(fā)揮其穿膜功能。以后又相 繼發(fā)現(xiàn)了多個(gè)源自病毒或其它生物的CPP，如I型單純皰疹病毒（herpessimplexvirus type1，HSV_1)蛋白的VP22、果繩同源觸角蛋白（drosophilahemeoproteinantennapedia transcriptionprotein,ANTP)、乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV)的前S抗原等。 依據(jù)其來源不同可將已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CPP大致分為兩類：一類為來源于病毒的短肽，如上面提 及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原等；另一類為根據(jù)天然CPP的特點(diǎn)人工合成的短肽，如多聚 精氨酸、MPG、PEP-1、MAP、transportan和各種基于不同信號序列合成的肽段等。CPP能在 體外或體內(nèi)作為載藥多肽，介導(dǎo)一系列生物活性分子如DNA、siRNA、多肽、蛋白質(zhì)甚至納米 顆粒等進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮各自的生物學(xué)效應(yīng)。這些CPP因其本身具有低毒、副作用小、不干擾 所攜帶大分子生物活性等特點(diǎn)，被廣泛用于體外或/和體內(nèi)向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送生物活性分子， 尤其是在抗腫瘤治療的應(yīng)用研究方面更是引人注目。CPP研究在基礎(chǔ)生物學(xué)和應(yīng)用研究上 都具有極大意義，作為一種有效的胞內(nèi)運(yùn)載工具，有著廣泛的應(yīng)用前景（圖2)。
[0005] 然而來源于病毒或其他種屬生物蛋白結(jié)構(gòu)域的CPP，在臨床應(yīng)用上可能仍然存在 一定的安全隱患，比如可能的細(xì)胞毒性和免疫原性問題。人們對TAT作為CPP進(jìn)行了大量 研究，腹腔注射Tat-0 -半乳糖苷酶，能進(jìn)入小鼠各種臟器組織，甚至可以透過血腦屏障進(jìn) 入腦組織。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全憂患，一直未能用于臨床研究。另 有報(bào)道稱，應(yīng)用TAT攜帶藥物的上呼吸道噴霧引發(fā)了嚴(yán)重的肺部病理反應(yīng)?？梢?，針對不同 治療需要，開發(fā)更為安全的、新型細(xì)胞膜穿透肽一一人源性細(xì)胞膜穿透肽（hCPP)是非常必 要的。
[0006] 2002年，Beck-SickingerAG小組開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)人源性細(xì)胞膜穿透 肽一一來源于人降血鈣素（hCT)的第9-32的殘基。隨后相繼報(bào)道的人源性細(xì)胞膜穿透肽還 有來自于hCLOCK蛋白（一種與生物節(jié)律調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白，2004年）、Hph-l( -種人源轉(zhuǎn)錄 因子，2006年）、Bag-l蛋白（一種可與Bcl-2相互作用的激活糖皮質(zhì)激素受體的蛋白，2006 年）、pl4ARF蛋白（一種人抑癌基因蛋白，2008年）、人乳鐵蛋白（2009年）、人Cytc77-101 及Cytc86-101 (2010年）和TCTP蛋白（來源于人翻譯控制腫瘤蛋白氨基末端10個(gè)氨基酸 殘基，2011年）的CPP等。與其它物種蛋白來源的CPP相比，人源性CPP引起人體的免疫反 應(yīng)的可能性小，潛在的不安全因素相對少，作為人類疾病治療的藥物載體，具有絕對優(yōu)勢， 有著更廣闊的開發(fā)、應(yīng)用前景。
[0007]FutakiS等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜穿透肽的穿膜能力與多肽序列中精氨酸殘基的數(shù)量和位 置有很大的相關(guān)性。我們在從事細(xì)胞膜穿透肽研究中，通過對蛋白數(shù)據(jù)庫中一級結(jié)構(gòu)的檢 索、分析發(fā)現(xiàn)人源性的組蛋白去甲基化酶PHD鋅指蛋白13(PHDfingerprotein13)的一 段長為20個(gè)氨基酸的短肽的一級結(jié)構(gòu)富含屬于堿性氨基酸的精氨酸和賴氨酸，分布著很 強(qiáng)的正電荷，這與大多數(shù)已知CPP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)很相似，繼而分析其二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它可形成 經(jīng)典的a-螺旋構(gòu)象。推測這段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性細(xì)胞膜穿透 肽。我們繼而合成了這段短肽并命名為hPP5,觀察了其對培養(yǎng)細(xì)胞的穿膜效率，細(xì)胞毒性及 穿膜機(jī)制，同時(shí)還觀察、評估了其向細(xì)胞內(nèi)遞送綠色熒光蛋白（GFP)的效果，為hPP5作為一 種新型人源性藥物運(yùn)輸載體的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供 相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。
[0009] 如本文中所使用的，術(shù)語"生物分子"是指，存在于生物體中的分子的總稱，包括但 不限于，核酸、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、和小分子化合物以及其任意的復(fù)合物。
[0010] 術(shù)語"寡肽"通常是指2-10個(gè)氨基酸組成的肽。術(shù)語"多肽"通常是指11個(gè)以上 的氨基酸組成的肽。術(shù)語"蛋白質(zhì)"通常是指含有51個(gè)以上的氨基酸殘基的多肽鏈。
[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種新的細(xì)胞膜穿透肽hPP5,本發(fā)明提供的細(xì)胞膜穿透肽hPP5是源于人類組蛋白去甲基化酶PHD鋅指蛋白13的一段多肽序列，其具有細(xì)胞膜穿透能 力，所述多肽序列的長度在20個(gè)氨基酸以內(nèi)，所述的細(xì)胞優(yōu)選真核細(xì)胞，更優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞， 最優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明所述細(xì)胞膜穿透肽hPP5的多肽序列包含SEQIDN0 :1所示的序列，即Phe-Leu-Leu-Asp-Arg-Lys-Lys-Thr-Asp-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Arg -Arg(SEQIDNO:1)(苯丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨 酸-蘇氨酸-天門冬氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-賴氨酸-賴氨酸-賴氨 酸-精氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸），優(yōu)選地，所述細(xì)胞膜穿透肽hPP5的氨基酸序列如 SEQIDNO:1所示。本發(fā)明所述的細(xì)胞膜穿透肽hPP5,其為合成的或重組的。
[0013] 本發(fā)明還提供了合成的或重組的融合蛋白，該融合蛋白包含細(xì)胞膜穿透肽hPP5 與蛋白（例如可用作藥物的蛋白和用作標(biāo)記的蛋白），其中，細(xì)胞膜穿透肽hPP5直接或者通 過接頭與所述蛋白連接。優(yōu)選地，所述可用作藥物的蛋白選自抗腫瘤的蛋白，所述用作標(biāo)記 的蛋白選自綠色熒光蛋白GFP。
[0014] 本發(fā)明還提供了編碼所述細(xì)胞膜穿透肽hPP5或所述融合蛋白的核酸，含有所述 核酸的載體（例如原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體），含有所述核酸或所述載體的宿主細(xì)胞 或重組病毒，所述宿主細(xì)胞包括轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌，例如重組細(xì)菌或重組真菌。本發(fā)明 還提供了制備所述細(xì)胞膜穿透肽hPP5或所述融合蛋白的方法，其包括：培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞 或重組病毒，和，從培養(yǎng)物中回收所述的細(xì)胞膜穿透肽hPP5或者融合蛋白。
[0015] 我們首次發(fā)現(xiàn)這一肽段具有穿透細(xì)胞膜的功能，并可攜帶蛋白質(zhì)等生物分子跨膜 進(jìn)入體外多種細(xì)胞（包括貼壁培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞以及傳代培養(yǎng)細(xì)胞 等）內(nèi)，是一種極具開發(fā)前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜運(yùn)輸載體。因此，本發(fā)明 還提供了所述細(xì)胞膜穿透肽hPP5用作藥物運(yùn)輸載體的用途或在制備藥物運(yùn)輸載體中的應(yīng) 用，特別是用作細(xì)胞內(nèi)藥物運(yùn)輸載體的應(yīng)用，其中所述藥物運(yùn)輸載體攜帶生物分子跨膜進(jìn) 入細(xì)胞，這些細(xì)胞包括貼壁培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞以及傳代培養(yǎng)細(xì)胞等。 其中，所述生物分子包括核酸、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、和小分子化合物以及其任意 的復(fù)合物。
[0016] 本發(fā)明還提供了包含藥物運(yùn)輸載體的復(fù)合物，其特征在于所述藥物運(yùn)輸載體為所 述的細(xì)胞膜穿透肽hPP5,優(yōu)選地，所述復(fù)合物還包含可用作藥物的生物分子，優(yōu)選地，所述 藥物運(yùn)輸載體直接或者通過接頭與生物分子連接，優(yōu)選地，所述復(fù)合物包含藥物運(yùn)輸載體 與可用作藥物的蛋白，優(yōu)選地，所述藥物運(yùn)輸載體直接或者通過接頭與可用作藥物的蛋白 連接。本發(fā)明還提供了一種制備所述復(fù)合物的方法，包括將所述的細(xì)胞膜穿透肽hPP5與生 物分子直接連接或者通過接頭連接，得到所述復(fù)合物。其中所述生物分子可來自核酸、寡 肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、納米顆粒和小分子化合物以及其任意的復(fù)合物。所述復(fù)合物 適合用于生產(chǎn)藥物、保健品、美容或護(hù)膚品、轉(zhuǎn)染試劑或診斷試劑。
[0017] 本發(fā)明還提供了包含藥物運(yùn)輸載體的細(xì)胞內(nèi)藥物，其特征在于所述藥物運(yùn)輸載體 為所述的細(xì)胞膜穿透肽hPP5。本發(fā)明還提供了一種制備細(xì)胞內(nèi)藥物的方法，是將所述的細(xì) 胞膜穿透肽hPP5與可用作藥物的生物分子連接，得到所述細(xì)胞內(nèi)藥物。所述生物分子為生 物活性分子，如DNA、siRNA、多肽、蛋白質(zhì)或納米顆粒，特別是抗腫瘤活性分子；所述細(xì)胞內(nèi) 藥物可用于離體細(xì)胞，也可以用于體內(nèi)細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，與其它生物蛋白來源的CPP相比，對細(xì)胞基本無毒副作用，潛 在的不安全因素相對較少。因此，作為臨床應(yīng)用的藥物分子載體有著更為廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0019] 圖1是新型治療分子胞內(nèi)遞送策略示意圖。
[0020] 圖2是細(xì)胞膜穿透肽（CPP)及其可攜帶入胞的生物藥物的工作原理示意圖。
[0021] 圖3是本發(fā)明的新型人源性細(xì)胞膜穿透肽hPP5的二級輪狀結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022] 圖4是本發(fā)明的新型人源性細(xì)胞膜穿透肽hPP5的二級結(jié)構(gòu)中存在的螺旋及折疊 分析示意圖。
[0023] 圖5是本發(fā)明的新型人源性細(xì)胞膜穿透肽hPP5的原核表達(dá)及純化結(jié)果的電泳照 片。其中，泳道M為：標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；泳道1為：pET15b-hP