一種基于家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)制備人髓過氧化物酶的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和生物技術領域，具體而言，特指一種基于家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)、應用家蠶作為生物反應器來廉價、高效地制備具催化活性的人髓過氧化物酶(Myeloperoxidase, ΜΡ0)的方法。
【背景技術】
[0002]人MPO是一種存在于正常人多形核中性白細胞(Polymorphonuclearneutrophils, PMN)嗜苯胺藍顆粒(Azurophilic granules)中被糖基化的血紅素包含形可溶酶，它通過催化形成強氧化物和次氯酸在自身免疫有氧殺滅微生物系統(tǒng)中扮演著重要角色。
[0003]針對自身免疫系統(tǒng)性血管炎和炎癥性等疾病，利用抗中性粒細胞胞漿抗體(P-ANCA)進行診斷已成為既定工具。臨床上常見的自身抗原是人MPO及蛋白酶3 (PR3)，通過抗原特異性診斷設備檢測與這些抗原相對應的來自于中性粒細胞嗜天青顆粒的自身抗體，能夠很容易的診斷出與抗中性粒細胞胞漿抗體相關的疾病。作為P-ANCA免疫熒光圖譜的主要標靶，人MPO自身抗體指出了某些疾病的程度，如:特發(fā)性新月體性腎小球腎炎，Churg-Strauss綜合征以及經(jīng)典型結節(jié)性多動脈炎等相關疾病。
[0004]人MPO的基因編碼全長為11千堿基(kilobase, kb)，最初的翻譯產(chǎn)物是一個80千道爾頓(kilodalton，kDa)的蛋白，該蛋白N-端由41個氨基酸組成的信號肽段被酶解切除后，繼而糖基化加入富含甘露糖的側鏈后重新生成一個約90 kDa酶性不活躍的apoproMPO，當結合一個血紅素基團后，apoproMPO變成了酶性活躍的前體蛋白ΜΡ0。N-端125個氨基酸前區(qū)通過酶解產(chǎn)生了一個約75 kDa的蛋白，經(jīng)過第二次酶解生成由約57 kDa重鏈和約12 kDa輕鏈組成的重輕原體人ΜΡ0，最終包裝成的一個成熟的人ΜΡ0，其分子量大約為150 kDa，由一對重鏈和一對輕鏈組成，兩個重鏈沿著長軸由一個二硫鍵相連，富含甘露糖的糖基和兩個鐵素基團通過共價鍵與重鏈相連。
[0005]早期的研究表明，用人MPO的cDNA轉染BHK細胞，觀察到一個被糖基化了的85 kDa的precursor ΜΡ0，它從內(nèi)質網(wǎng)被緩慢釋放，但沒有進行進一步的蛋白水解過程(Cully, J., et al, 1989, Exp.Cell Res., 180: 440-450)。Moguilevsky 等也觀察到了一個從CHO細胞釋放的具有酶活性的84 kDa的precursor ΜΡ0,盡管這個84 kDa的MPO與從 HL-60 細胞釋放的 89 kDa 的 MPO 非常相似(Hur，S.-J., et al, 1989，J.B1l.Chem., 264: 8542-8548)，但也沒有發(fā)現(xiàn)其具有蛋白水解過程(Moguilevsky，N., et al,1991，Eur.J.B1chem., 197: 605-614)。應用桿狀病毒表達系統(tǒng)在Sf_9昆蟲細胞中表達重組人MPO的實驗表明，有兩種形式的MPO被觀察到，一種是84 kDa的釋放形MPO (釋放到培養(yǎng)基上清中)，另一種是在細胞內(nèi)表達的74 kDa的ΜΡ0，這兩種形式的MPO均顯示被糖基化修飾，而只有胞內(nèi)表達的74 kDa的MPO進行了翻譯后的蛋白水解過程(Taylor，K.L.et al, 1992, B1chem.B1phys.Res.Commun., 187: 1572-1578)，但這兩種形式的MPO均不具過氧化酶的活性。也有研究表明，在感染了含人MPO重組病毒的r.細胞培養(yǎng)基中添加血紅素前體，其表達的釋放形MPO具有相應的酶催化活性(Shin，K.et al,2000, B1chem.B1phys.Res.Commun., 271: 831-836)。
[0006]臨床上用于自身免疫系統(tǒng)相關疾病體外診斷的MPO以人天然蛋白為最佳，但天然蛋白的資源有限，來源各異，導致純化的天然抗原純度低、批次之間不一致，且成本昂貴，以德國Diarect公司產(chǎn)品為例，每毫克天然(非重組)人MPO高達一萬元人民幣以上(http://www.eb1trade.com/custom/b1sun/ 100224/DIARECT.htm)。由于表達和蛋白折疊技術的瓶頸限制，利用體外表達系統(tǒng)所獲得的重組人MPO成本高昂，如以色列ProSpec-Tany公司從大腸桿菌表達系統(tǒng)中制備的重組人MPO每毫克更高達八萬元人民幣以上(http://www.amyjet.com/products/ENZ-334.shtml)。嚴重制約了自身免疫系統(tǒng)相關疾病體外診斷技術的發(fā)展。
[0007]家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)憑借其高表達水平及強大的翻譯后修飾功能而被普遍應用于大規(guī)模表達外源蛋白，通過家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)表達的人重組蛋白具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性與人的天然蛋白相似，且家蠶飼養(yǎng)簡單方便，成本低，目前已經(jīng)成為世界上最具商業(yè)開發(fā)價值的真核表達系統(tǒng)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對制約在體外表達系統(tǒng)中制備重組人MPO的技術瓶頸，本發(fā)明首次提出一種高效、廉價、大規(guī)模制備重組人MPO的方法。本發(fā)明提出一種基于家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)，利用家蠶作為生物反應器，大規(guī)模、低成本、高效率地制備重組人MPO的方法。
[0009]本發(fā)明所采用的技術方案是:將完整的人MPO的cDNA (在C-端設計帶有6個組氨酸)克隆到自身含6個組氨酸的供體質粒(pFastBacHTb)上，獲得含人MPO基因的重組供體質粒；在大腸桿菌(菌株為BmDHlOBac)中和家蠶桿狀病毒基因組桿粒(Bacmid)于轉座子(Tn7)上發(fā)生轉座，通過藍白斑篩選出帶有目的基因的克隆，隨后在家蠶細胞中(細胞株為BmN)制備含人MPO基因的重組病毒；感染宿主昆蟲家蠶，同時給家蠶添加一定量的血紅素前體；收集含表達了人MPO的家蠶幼蟲的體液，在裂解緩沖液存在下經(jīng)超聲波裂解，4°C下進行高速離心，收集的上清應用鎳-柱親和層析結合離子交換層析的方法進行分離純化，最終獲得目的產(chǎn)物。
[0010]本技術方案所述的人MPO的cDNA來源于已公開的DNA序列(GenBank:BC130476.1);所述的桿狀病毒是家蠶桿狀病毒(BmNPV);所述的宿主昆蟲為家蠶(Bombyxmori)，品種為“306”;所述的宿主昆蟲感染時間是五齡期幼蟲；所述的感染方法是經(jīng)昆蟲皮下注射接種感染；所述的血紅素前體的添加是經(jīng)口喂食；所述的桿狀病毒供體質粒是是商品化的質粒(型號為pFastBacHTb)。
[0011]本技術方案所述的分離純化具體操作是:收集的經(jīng)超聲波裂解、高速離心后含表達了人MPO的上清，經(jīng)過鎳-親和層析柱和離子交換層析柱分離純化出高純度的目的產(chǎn)物。所述的鎳-親和層析柱為帶組氨酸標簽蛋白純化試劑盒，離子交換層析柱是指FPLC MonoS。
[0012]本發(fā)明的突出優(yōu)點表現(xiàn)為:
表達量高:通過制備含人MPO家蠶重組桿狀病毒感染五齡起蠶第二天的家蠶幼蟲，在感染4-5天后收集高表達了人MPO的蠶血淋巴，經(jīng)分離純化后，每條蠶可制備高達1.7微克左右目的蛋白。
[0013]成本低:家蠶是目前唯一可以大規(guī)模商業(yè)化無菌飼養(yǎng)的昆蟲物種，由于避免了苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)-昆蟲細胞表達系統(tǒng)中昆蟲細胞培養(yǎng)所需昂貴的培養(yǎng)基和胎牛血清，使得用家蠶作為生物反應器制備人MPO的成本低。
[0014]
【附圖說明】
[0015]圖1為重組供體質粒的構建；
其中 A:聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain React1n, PCR)產(chǎn)物(?2277 bp)。B:供體質粒 pFastBacHTb (Lane 1-2)和 PCR 產(chǎn)物(Lane 3-4) ^Xho I 和III 雙酶切。C:連接反應前酶切產(chǎn)物膠回收效率的鑒定，Lane 1:供體質粒pFastBacHTb，Lane 2: PCR產(chǎn)物。D:挑選的克隆雙酶切鑒定，Lane 1:空供體質粒作為對照，Lane 2_4:連接產(chǎn)物涂平板過夜后所挑選克隆經(jīng)雙酶切反應后的瓊脂糖膠。圖中酶切后的供體質粒和MPO片段分別用箭頭表示，Lane M表示標準DNA標記(marker)，左邊的數(shù)字表示標準DNA標記的位置，以堿基對bp (base pair)表示。
[0016]圖2為發(fā)生同源重組家蠶Bacmid DNA的PCR鑒定；
其中以MPO中間引物C1669TGAATCGTCAGAACCAAATTG169。作為正引物和特異性反向引物(pUC/Ml3: 5’ -AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)對挑選的白斑 Bacmid DNA 進行的 PCR 鑒定，圖中M表示DNA marker，以左邊的數(shù)字表示(bp)，“I”表示以未發(fā)生轉座的藍斑Bacmid DNA作為對照，“2”和“3”表示發(fā)生