升高，到96和120小時時達最高值。
[0028]實施例4:在五齡家蠶中大量表達的人重組MPO的分離純化
根據(jù)實施例3人重組MPO在五齡家蠶中的表達時相，其酶活性在接種病毒后第4和第5天時達最高值。因此，按照實施例3接種病毒的條件，接種大約300頭蠶，收集4 一 5天發(fā)病后的蠶血淋巴，用His-(組氨酸)標簽蛋白純化專用裂解緩沖液稀釋，經(jīng)超聲波裂解、高速離心后取上清，經(jīng)過鎳-親和層析柱和離子交換層析柱Mono S分離純化，共獲得大約0.5毫克左右高純度的目的產(chǎn)物，其分子量大約為90 kDa,與人早幼粒白血病細胞HL-60所釋放的 89 kDa 的 MPO 相近(Hur, S.-J., et al, 1989，J.B1l.Chem., 264: 8542-8548)。
[0029]經(jīng)Mono S離子交換層析柱純化后的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE分析結(jié)果如圖4所示，蛋白純度在95%以上，平均每條蠶可獲得約1.7微克純化后的人MPO蛋白。
[0030]
實施例5:經(jīng)分離純化后目的蛋白的蛋白質(zhì)印跡雜交(Western Blot)鑒定以實施例4經(jīng)Mono S柱后的第21號餾分經(jīng)過10%的SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，分別以抗組氨酸His-標簽的鼠單克隆抗體和抗人源MPO兔多克隆抗體作為一抗進行免疫反應，以標記了堿性磷酸酶的抗鼠源和抗兔源的免疫球蛋白IgG (Immunoglobulin G)作為二抗，以堿性磷酸酶試劑盒進行顯色反應，結(jié)果表明，所制備的分子量大約為90 kDa的目的蛋白不但被抗His-標簽的抗體所識別(圖5A)，同時也能夠被商品化抗人MPO的抗體識別(圖5B)，初步驗證了所表達的目的蛋白為人ΜΡ0。
[0031]
實施例6:經(jīng)分離純化后目的蛋白的質(zhì)譜鑒定
將實施例4中經(jīng)Mono S離子交換層析柱純化后的SDS-PAGE凝膠電泳上相對應的大約90 kDa位置的目的條帶用醫(yī)用手術(shù)刀割下(圖4中第21號餾分)，進行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜分析條件:儀器型號:5800 MALD1-T0F/T0F(AB SCIEX公司)；檢測方式:正離子，反射模式。分析結(jié)果:蛋白質(zhì)得分(Protein Score):1140 ;總離子(Total 1n):835 ;有41條肽段相匹配，如圖6所示，其氨基酸的覆蓋率為61.48%，這進一步驗證了所制備的目的蛋白為人ΜΡ0。
[0032]
實施例7:分離純化后的人MPO酶活性分析
根據(jù)比色法MPO活性檢測試劑盒使用說明書，首先繪制發(fā)色載色體(TNB)標準曲線如圖7A所示；同時，測定各樣品經(jīng)反應60分鐘后在412 nm處的吸光度(樣品A412)，以不加MPO基質(zhì)的反應作為空白對照(空白對照A412),計算出兩者差值AA412=(空白對照A412)-(樣品A412),對照標準曲線，根據(jù)AA412確定反應所消耗TNB的量B (納摩爾)，由公式:(BX樣品稀釋倍數(shù))/(反應時間X樣品量)，計算出MPO的比活性。一個單位(Unit) MPO的活性定義為:在25°C下每分鐘水解基質(zhì)產(chǎn)生的氨基乙磺酸氯胺所消耗I個微摩爾(μ mole)TNB所需要MPO的量。如圖7B所示，在25°C下反應60分鐘，經(jīng)計算，我們所制備的重組人MPO (實施例四經(jīng)Mono S柱純化后第21號餾分)的比活性為396.7±41.7毫單位/毫克，與陽性對照(來源于人嗜中性粒細胞表達的ΜΡ0，SIGMA-ALDRICH公司產(chǎn)品，CatalogNumber: MAK068F)的比活性(366.7毫單位/毫克)相近。
[0033]本發(fā)明利用家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)在五齡家蠶中制備的人重組MPO具與來源于人嗜中性粒細胞表達的MPO相當?shù)谋然钚裕磺冶磉_量高:平均每條蠶可制備高達1.7微克左右目的蛋白；成本低:由于避免了 AcMNPV-昆蟲細胞表達系統(tǒng)中昆蟲細胞培養(yǎng)所需昂貴的培養(yǎng)基和胎牛血清，且家蠶飼養(yǎng)簡單方便，使得利用家蠶作為生物反應器制備人MPO的成本低。
SEQUENCE LISTING
<110>江蘇大學、中山瑞福醫(yī)療器械科技有限公司〈120〉一種基于家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)制備人髓過氧化物酶的方法〈160〉 I
<170> Patent In vers1n 3.3
〈210〉 I
〈211〉 33
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
I AGGAGACTCG AGATGGGGGT TCCCTTCTTC TCT33
<110>江蘇大學、中山瑞福醫(yī)療器械科技有限公司
〈120〉一種基于家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)制備人髓過氧化物酶的方法
〈160〉 2
<170> Patent In vers1n 3.3
〈210〉 2
〈211〉 48
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 2
I TACAAGCTTC TAGTGATGGT GATGGTGATG GGAGGCTTCC CTCCAGGA 48<110>江蘇大學、中山瑞福醫(yī)療器械科技有限公司〈120〉一種基于家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)制備人髓過氧化物酶的方法〈160〉 3
<170> Patent In vers1n 3.3
〈210〉 3
〈211〉 12
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 3
I CTGAATCGTC AGAACCAAAT TG 12
<110>江蘇大學、中山瑞福醫(yī)療器械科技有限公司
〈120〉一種基于家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)制備人髓過氧化物酶的方法
〈160〉 4
<170> Patent In vers1n 3.3
〈210〉 4
〈211〉 13
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 4
I AGCGGATAAC AATTTCACAC AGG 13
【主權(quán)項】
1.一種基于家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)制備人髓過氧化物酶的方法，其特征在于按照下述步驟進行: 將完整的人髓過氧化物酶MPO的CDNA (在C-端設計帶有6個組氨酸)克隆到自身含6個組氨酸的供體質(zhì)粒(pFastBacHTb)上，獲得含人MPO基因的重組供體質(zhì)粒；在大腸桿菌(菌株為BmDHlOBac)中和家蠶桿狀病毒基因組桿粒(Bacmid)于轉(zhuǎn)座子(Tn7)上發(fā)生轉(zhuǎn)座，通過藍白斑篩選出帶有目的基因的克隆，隨后在家蠶細胞中(細胞株為BmN)制備含人MPO基因的重組病毒；以制備的重組病毒感染宿主昆蟲家蠶，同時給家蠶添加一定量的血紅素前體；收集含表達了人MPO的家蠶幼蟲的體液，在裂解緩沖液存在下經(jīng)超聲波裂解，4°C下進行高速離心，收集的上清應用鎳-柱親和層析結(jié)合離子交換層析的方法進行分離純化，最終獲得目的產(chǎn)物人髓過氧化物酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)制備人髓過氧化物酶的方法，其特征在于:所述的人MPO的cDNA來源于已公開的DNA序列(GenBank: BC130476.1);所述的桿狀病毒是家蠶桿狀病毒(BmNPV);所述的宿主昆蟲為家蠶(Bombyx mori)，品種為“306” ;所述的宿主昆蟲感染時間是五齡期幼蟲；所述的感染方法是經(jīng)昆蟲皮下注射接種感染；所述的血紅素前體的添加是經(jīng)口喂食；所述的桿狀病毒供體質(zhì)粒是是商品化的質(zhì)粒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)制備人髓過氧化物酶的方法，涉及基因工程和生物技術(shù)領域。將完整的人髓過氧化物酶MPO的cDNA克隆到自身含6個組氨酸的供體質(zhì)粒上，獲得含人MPO基因的重組供體質(zhì)粒；在大腸桿菌BmDH10Bac中和家蠶桿狀病毒基因組桿粒于轉(zhuǎn)座子上發(fā)生轉(zhuǎn)座，通過藍、白斑篩選出帶有目的基因的克隆，隨后在家蠶細胞中制備含人MPO基因的重組病毒；用獲得的含目的基因的重組病毒感染宿主昆蟲家蠶，同時給家蠶添加一定量的血紅素前體；收集家蠶幼蟲的體液，經(jīng)超聲波裂解，下進行高速離心，收集的上清進行分離純化，最終獲得目的產(chǎn)物。本發(fā)明利用家蠶作為生物反應器，大規(guī)模、低成本、高效率地制備重組人MPO的方法。
【IPC分類】C12N15/866, C12N9/08
【公開號】CN105112382
【申請?zhí)枴緾N201510553322
【發(fā)明人】陳俏梅, 周亞竟, 孫祥明, 張茜, 張倩, 陳焰, 陳慧卿, 陳克平, 傅海龍, 王紅勛
【申請人】江蘇大學, 中山瑞福醫(yī)療器械科技有限公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年9月1日