專利名稱：羧酸門控的硝基氧(cgn)化合物和組合物以及使用其的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療和防止源于氧化應(yīng)激的慢性和急性病以及障礙。新型化合物，組合物和它們的使用方法還涉及治療和診斷藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
許多急性和慢性病以及障礙可歸因于來自內(nèi)源和外源產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species)(“ROS”)的損傷。當(dāng)抗氧化酶和維生素的正常解毒能力被壓制時(shí)，產(chǎn)生ROS損傷。包含治療ROS損傷的重組抗氧化酶和維生素的添加物已經(jīng)顯示一些優(yōu)點(diǎn)和局限性。氧化氮(NO·)和過氧化物(O2·-)兩個(gè)都是生理的氣體自由基，其單獨(dú)或結(jié)合能夠引發(fā)ROS級聯(lián)和損傷。正在進(jìn)行的藥物開發(fā)計(jì)劃以補(bǔ)充或去除NO·為目標(biāo)。使用過氧化物岐化酶(SOD)作為模型，備選的藥物開發(fā)策略是以去除O2·-和減弱后繼的ROS級聯(lián)為目標(biāo)。后者的計(jì)劃涉及分別在“金屬-中心”或“不含金屬”的合成分子如螯合過渡金屬離子或硝基氧中模仿SOD的催化活性。在專利如美國專利5,725,839；5,741,893；5,767,089；5,804,561；5,807,831；5,817,632；5,824,781；5,840,701；5,591,710；5,789,376；5,811,005；6,048,967中描述多硝酰基化的“金屬中心”(即多硝?；t蛋白)和“不含金屬”(即多硝酰基清蛋白)的血蛋白質(zhì)作為血管ROS損傷的保護(hù)劑和顯象劑的用途。然而，一般公認(rèn)沒有一種方法可以治療所有的ROS損傷。實(shí)際上，已經(jīng)要求連續(xù)的研究計(jì)劃來致力于先前未預(yù)見的挑戰(zhàn)。本發(fā)明顯示存在新型合成的活性中心“羧酸門控的硝基氧(carboxylic-gated-nitroxide)(CGN)”的類似物。
本發(fā)明還顯示CGN的合成和它酯化和非酯化形式的“金屬-中心”和“不含金屬”的新型化合物，以及它們在定向傳遞到所考慮的治療位點(diǎn)中的效用。另外，通過與現(xiàn)有藥物或?qū)蚍肿?targeting molecule)共價(jià)連接和結(jié)合使用，增加它們的治療應(yīng)用。
發(fā)明概述公開了羧酸門控的硝基氧(CGN)化合物，它們的酯化衍生物組合物以及治療和防止源于ROS損傷的疾病和障礙的使用方法。本發(fā)明的組合物包含CGN，并用于治療暴露于不良高水平活性氧物質(zhì)(ROS)的組織。除CGN以外，可以在適當(dāng)?shù)乃幬?，化妝品，和用于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，口服，局部，鼻，肺，或直腸給藥的診斷配方中使用其活性衍生物。CGN和它的衍生物的實(shí)例包括酯化的CGN，酯化的二羧氨基酸CGN，和酯化的羧基二氨基酸CGN以及它們的衍生物，其包括二硝基氧化物，三硝基氧化物衍生物，或共軛物，其單獨(dú)或與現(xiàn)有藥物或?qū)蚍肿咏Y(jié)合使用。描述硝基氧化物的藥物配方和給藥途徑。具體地，本發(fā)明組合物的局部施用顯示CGN在細(xì)胞內(nèi)的定向傳遞是如何通過細(xì)胞酯酶將作為前藥的疏水酯化的CGN裂解成其游離酸形式的親水CGN來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的硝基氧化合物包含3個(gè)分子特征，其提供本發(fā)明的特征。首先，本發(fā)明的化合物包含含有直接鍵合在一起的氮和氧原子的分子的第一部分，并且包含不成對電子(·NO)。第二，本發(fā)明的化合物包含至少包含兩個(gè)氧原子的分子的第二部分，其第二部分提供負(fù)電荷，例如一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)或更多羧酸基團(tuán)?？梢詷?gòu)造第二部分以便在給定的反應(yīng)，例如去除酯基團(tuán)的烷基部分以后產(chǎn)生羧酸基團(tuán)。第三，本發(fā)明的化合物包含位于第一和第二部分之間的連接基團(tuán)，該連接基團(tuán)允許第二部分的負(fù)電荷效應(yīng)向第一部分“彎曲”，由此幫助維持(·NO)部分在人體內(nèi)各種環(huán)境中的穩(wěn)定性。
在局部施用中描述CGN的組合物和給藥途徑以顯示CGN在細(xì)胞內(nèi)的定向傳遞是如何通過細(xì)胞酯酶將作為前藥的疏水酯化的CGN裂解成其親水的游離酸形式的CGN來實(shí)現(xiàn)的。使用兩種硝基氧化物的氮穩(wěn)定的同位素和如通過順磁共振光譜學(xué)檢測它們共同給藥(co-adminstration)(氣溶膠，直腸，和口服)的分布，代謝和消除研究，明確地證明相對于4-羥基-2，2，6，6-四甲基-哌啶-1-氧基(一種現(xiàn)有技術(shù)的化合物)的生物半衰期和胞內(nèi)傳遞的改善。本發(fā)明顯示酯酶水解的酯化CGN提供它們的羧酸部分作為“門”，其保護(hù)分子的體內(nèi)穩(wěn)定性而不影響催化活性。提供的局部，靜脈內(nèi)，口服，和肺給藥的實(shí)例包括選擇的CGN衍生物。提供在照射前和照射后施用時(shí)CGN防止由UVB誘導(dǎo)的急性和慢性皮膚損傷功效的實(shí)例。
附圖簡述

圖1顯示酯化的羧酸門控的硝基氧(CGN)和它們的衍生物的結(jié)構(gòu)通式。
圖2顯示酯化的二羧氨基酸CGN的結(jié)構(gòu)通式。
圖3顯示酯化的羧酸二氨基酸和它們的衍生物的結(jié)構(gòu)通式。
圖4顯示在實(shí)施例部分示例的選擇的化合物的通用結(jié)構(gòu)。
圖5顯示通用化合物2，2，6，6-四甲基-1-氧基-哌啶-4-琥珀酸酯。
圖6顯示R2被一個(gè)羥基(-H)取代的圖5的半通用結(jié)構(gòu)。
圖7顯示R2和R3被氫取代的圖5的結(jié)構(gòu)，其被稱為化合物2，2，6，6-四甲基-1-氧基-哌啶-4-琥珀酸酯(TOPS)。
圖8顯示R2和R3分別H和乙基取代的圖5的結(jié)構(gòu)，稱為化合物2，2，6，6-四甲基-1-氧基-哌啶-4-琥珀酸一乙酯(E-TOPS)。
圖9顯示其中R2和R3基團(tuán)都是乙基的圖5的結(jié)構(gòu)，即2，2，6，6-四甲基-1-氧基-4-哌啶-琥珀酸二乙酯(DE-TOPS)。
圖10顯示其中R2和R3基團(tuán)都是叔丁醇的圖5的結(jié)構(gòu)，即2，2，6，6-四甲基-1-氧基-4-哌啶-琥珀酸二叔丁酯(DB-TOPS)。
圖11顯示其中R2是Tempol的圖5的半通用結(jié)構(gòu)，即TE-TOPS。
圖12顯示其中R2和R3都是Tempol的圖5的結(jié)構(gòu)，即TT-TOPS。
圖13顯示其中通用環(huán)為五元環(huán)的圖4的結(jié)構(gòu)。
圖14顯示液相色譜，其鑒定TOPS和它的羧酸衍生物酯，E-TOPS和DE-TOPS。
圖15顯示在水相環(huán)境中通過氫氧化鈉(NaOH)將DE-TOPS水解成TOPS。水解前和水解后的EPR信號明顯顯示，發(fā)生從DE-TOPS至TOPS的幾乎完全轉(zhuǎn)化。
圖16顯示液相色譜儀HPLC和EPR譜，其描述從14N E-TOPS和15NTempol合成TE-TOPS期間的結(jié)構(gòu)變化。
圖17(A和B)顯示14N-15NTE-TOPS體外和體內(nèi)水解成兩個(gè)單價(jià)基團(tuán)。
圖18顯示當(dāng)將兩個(gè)腹膜內(nèi)共同給藥于小鼠中時(shí)，與15N Tempol相比14N E-TOPS延長的體內(nèi)血漿半衰期。
圖19顯示當(dāng)將兩個(gè)靜脈內(nèi)共同給藥于小鼠中時(shí)，與15N Tempol相比14N E-TOPS延長的體內(nèi)血漿半衰期。
圖20顯示當(dāng)將兩個(gè)肌內(nèi)共同給藥于小鼠中時(shí)，與15N Tempol相比14NE-TOPS延長的體內(nèi)血漿半衰期。
圖21顯示當(dāng)將兩個(gè)口服共同給藥于小鼠中時(shí)，與15N Tempol相比14NE-TOPS延長的體內(nèi)血漿半衰期。
圖22A-C顯示當(dāng)將14N-DE-TOPS和15N-Tempol共同施用于無毛小鼠的皮膚上時(shí)，DE-TOPS在Franz Diffusion細(xì)胞中的皮膚滲透和區(qū)室化22A-施用前；22B-在受體細(xì)胞中；和22C在20小時(shí)的皮膚中。
圖23顯示通過EPRI的DE-TOPS人皮膚滲透和區(qū)室化。
圖24顯示在小鼠的LD50研究中對于與Tempol相比的E-TOPS，生存率與劑量之間的關(guān)系。
圖25顯示在每日局部施用10天后DE-TOPS通過排泄在尿中的代謝和血漿中的減少。
圖26顯示通過EPR測定的E-TOPS的過氧化物歧化酶活性。
圖27顯示DE-TOPS，E-TOPS，和TOPS的劑量依賴性抑制血紅蛋白誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元的毒性。
圖28顯示TOPS，E-TOPS，和DE-TOPS的劑量依賴性抑制過亞硝酸鹽誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元的毒性。
圖29顯示TOPS，E-TOPS，和DE-TOPS以劑量依賴性的方式抑制通過過亞硝酸鹽的羥基苯乙酸(HPA)的硝化。
圖30顯示E-TOPS減少由腫瘤壞死因子α(TNF-α)在不同溫育時(shí)間對Y-79細(xì)胞系誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。
圖31顯示DE-TOPS的預(yù)先局部施用防止LTVB急性誘導(dǎo)的無毛小鼠上的皮膚損傷。
圖32顯示在對照或在照射前施用DE-TOPS的情況下，在11天UVB照射后無毛小鼠皮膚的組織病理學(xué)變化。
圖33顯示DE-TOPS的預(yù)先局部施用防止在4個(gè)月時(shí)UVB在無毛小鼠上慢性誘導(dǎo)皮膚損傷。
圖34顯示DE-TOPS的后局部施用防止UVB在無毛小鼠上急性誘導(dǎo)皮膚損傷。
圖35顯示在對照或在照射后施用DE-TOPS的情況下，在11天的UVB照射后無毛小鼠皮膚的組織病理學(xué)變化的分?jǐn)?shù)。
圖36(A，B和C)當(dāng)每次照射施加10分鐘或2小時(shí)時(shí)比較DE-TOPS和Tempol對于UVB誘導(dǎo)的急性損傷的作用。
圖37(3組)顯示在用DE-TOPS處理和紫外照射15天后DE-TOPS，空白對照劑，和Retin A的比較。
發(fā)明詳述在描述本發(fā)明的化合物，配方和用途之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體結(jié)構(gòu)，配方和用途，當(dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方案的目的，并不是為了限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅由后附的權(quán)利要求限定。
在提供一個(gè)范圍的值時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解在范圍的上限和下限之間，除非上下文另外明確規(guī)定，到下限單位的十分之一的每個(gè)居中值也被特別公開。每一個(gè)在所述范圍中任何所述值或居中值與在該所述范圍中其它任何所述或居中值之間的較小范圍被包含在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地被包括或排除在范圍外，其中兩者之一，兩者都不或兩者都被包括在較小范圍中的每個(gè)范圍也被包含在本發(fā)明內(nèi)，使任何具體不包括的界限在所述范圍中。在所述范圍包括一個(gè)或兩個(gè)界限處，不包括包含界限的那些之一或兩個(gè)的范圍也被包括在本發(fā)明中。
除非另有規(guī)定，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的意義。盡管可以將與本文所述的那些類似或等效的任何方法和材料用于本發(fā)明的實(shí)施或檢驗(yàn)中，現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物在此作為參考引入以公開和描述與所引用出版物有關(guān)的方法和/或材料。
必須指出如這里和在后附權(quán)利要求中使用，單數(shù)形式“a”，“and”，和“the”包括復(fù)數(shù)對象(plural referent)，除非上下文另外明確規(guī)定。因此，例如提及“硝基氧(a nitroxide)”包括多種這樣的化合物或官能團(tuán)單元，提及“配方(the formulation)”包括提及一種或多種配方和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物，等等。
提供這里討論的出版物儀儀因?yàn)樗鼈兊墓_內(nèi)容在本發(fā)明的申請日之前。這里決不可被認(rèn)為是承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)依靠先前的發(fā)明先于該出版物。另外，提供的
公開日期可以不同于實(shí)際的
公開日期，其需要獨(dú)立地確認(rèn)。
另外，可以構(gòu)造本發(fā)明的化合物以便它與它被提供的生物有機(jī)體以化合物結(jié)構(gòu)變化的方式反應(yīng)，由此增強(qiáng)化合物定點(diǎn)傳遞至所需位置。
當(dāng)施用于生物環(huán)境中時(shí)特別設(shè)計(jì)本發(fā)明的化合物以增加診斷和治療效用，在所述生物環(huán)境中胞內(nèi)保留是重要的，并且疏水屏障如皮膚，角質(zhì)層，或其它這樣的膜是選擇性可滲透的。當(dāng)傳遞至包含酯酶的細(xì)胞時(shí)這些化合物特別有效。這些組合物可以用于減輕活體中由曝露于化學(xué)試劑和毒素，以及太陽，UV，或其它形式的電離照射引起的自由基的毒性效應(yīng)。專用的方法和配方還使本發(fā)明的化合物能夠診斷和治療各種各樣的生理疾病，并且使用測量硝基氧和它們反應(yīng)性的成象技術(shù)分析體內(nèi)反應(yīng)。本發(fā)明還涉及新型硝基氧組合物，其允許將治療量的硝基氧靶向(targeting)或區(qū)室化在局部區(qū)域，特別是滲透和保留在皮膚中的皮內(nèi)界面內(nèi)。
本發(fā)明的化合物可以通過如圖1-13的結(jié)構(gòu)式來定義。例如可以以任何所需的方式配制這些化合物以產(chǎn)生任何所需的藥物有效配方?？梢詫⒒衔锘旌?，溶解和/或懸浮在藥用載體中?？梢曰陬A(yù)定用途選擇該載體。例如，乳膏，凝膠劑和洗劑可以用于對皮膚的局部施用。鹽溶液可以用作注射劑。
可以以任何所需方式施用本發(fā)明的化合物和組合物。通常，將化合物配制成適合于具體類型的給藥的組合物，例如施用于人皮膚的洗劑，在嘴和上喉中漱口的水/乙醇配方，用于注射的鹽水溶液。
發(fā)明主要內(nèi)容關(guān)于包括化合物，由在適當(dāng)載體中的化合物組成的配方，和治療方法的本發(fā)明，存在許多方面。構(gòu)造化合物以提供CGN對于生物有機(jī)體(例如人)的抗氧化作用，并且在足夠長的時(shí)期內(nèi)提供作用以便獲得所需治療結(jié)果。以這樣的方式即NO基團(tuán)被相同分子內(nèi)的羧化物“門控”來構(gòu)造本發(fā)明的CGN，以便它的氧化還原調(diào)節(jié)功能在體內(nèi)被長期保持。CGN的NO基團(tuán)位置相對于2個(gè)羧化物基團(tuán)可以是對稱或不對稱。
本發(fā)明的化合物(參見圖1-13)可以結(jié)合成各種各樣的用于多種不同治療的配方。治療通常是調(diào)節(jié)生物化學(xué)反應(yīng)或更具體地減少如這里進(jìn)一步所述的氧化反應(yīng)。獲得的調(diào)節(jié)作用通常大于維生素如維生素C的抗氧化作用，而通常小于內(nèi)源催化劑的作用。如以下通常所述人體對感染的過度反應(yīng)通常產(chǎn)生調(diào)節(jié)氧化反應(yīng)的需要。
血液由血漿，紅細(xì)胞和白細(xì)胞組成。紅細(xì)胞供氧運(yùn)輸用而白細(xì)胞提供針對感染的防御。白細(xì)胞包括包括2種類型-淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的白細(xì)胞。白細(xì)胞還包括粒細(xì)胞，其分成3種類型-嗜堿性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞)和嗜中性粒細(xì)胞。
嗜中性粒細(xì)胞是白細(xì)胞中的最豐富的并且是關(guān)于本發(fā)明特別感興趣的。嗜中性粒細(xì)胞擠過毛細(xì)管來發(fā)現(xiàn)感染的組織或什么可能被錯(cuò)當(dāng)成已經(jīng)遭受創(chuàng)傷的感染組織。嗜中性粒細(xì)胞是從骨髓中釋放，循環(huán)，并通過趨化性指向感染和炎癥，所述趨化性使細(xì)胞向更高濃度的給定化學(xué)藥品移動。一旦嗜中性粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)外源顆?；蚣?xì)菌，嗜中性粒細(xì)胞吞沒它，釋放酶，來源于它的顆粒的過氧化氫和其它化學(xué)藥品將它氧化，例如殺死細(xì)菌。感染處的膿是死的嗜中性粒細(xì)胞和其它細(xì)胞碎片。盡管該過程在抗感染中是健康的，身體通常過分反應(yīng)和導(dǎo)致由于過度氧化的另外的炎癥，參見美國專利5,211,937，特別是其圖5。
本發(fā)明的化合物可以降低氧化的速率和/或總量，從而減少炎癥。本發(fā)明的CGN化合物可以提供對于常規(guī)硝基氧如4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(Tempoll)的優(yōu)點(diǎn)，如下列各項(xiàng)1)靶向傳遞在局部施用后CGN酯滲透角質(zhì)層并優(yōu)選被活的皮膚細(xì)胞吸收。在進(jìn)入細(xì)胞后，前藥的酯鍵被胞內(nèi)脂酶裂解，將CGN轉(zhuǎn)化成它的游離酸形式，使它膜可滲透性更差。該體內(nèi)酶促轉(zhuǎn)化有效地將CGN區(qū)室化在包含脂酶的皮膚細(xì)胞內(nèi)。
2)體內(nèi)門控功能在它水解的游離酸狀態(tài)，作為“門”的羧化物將保護(hù)或保衛(wèi)硝基氧的胞內(nèi)催化活性。
3)體內(nèi)安全性不同于Tempol(LD50＝375mg/kg)，在2g/kg下檢測不到CGN的急性毒性(LD50)。
簡而言之，本發(fā)明公開CGN，其分子內(nèi)羧化物部分“保衛(wèi)”它的硝基氧部分的體內(nèi)還原而不影響它的催化活性。
本發(fā)明公開化合物，配方和使用羧化物門控的硝基氧(CGN)的方法，所述羧化物門控的硝基氧(CGN)用于防止和治療起因于活性氧物質(zhì)(ROS)的疾病或損傷。本發(fā)明的化合物，配方和方法可以單獨(dú)或與在美國專利5,725,839；5,741,893；5,767,089；5,804,561；5,807,831；5,817,632；5,824,781；5,840,701；5,591,710；5,789,376；5,811,005；6,048,967中任何一個(gè)公開的化合物組合使用。
本發(fā)明包含普通種類的CGN，其包括單功能CGN和雙功能CGN。單功能CGN指它單獨(dú)的抗-ROS損傷活性。雙功能CGN指增加第二種活性，其來源于偶聯(lián)的現(xiàn)有藥物部分CGN，不僅提供“羧化物門控”作用而且其確定形式還定向傳遞它的胞內(nèi)抗ROS活性。CGN的體內(nèi)靶向傳遞和穩(wěn)定性提高它的治療指數(shù)和診斷效用。
公開單獨(dú)的或在配方中的穩(wěn)定的單和雙功能CGN化合物，其包括它們的酯化衍生物及其前體，和這些的用途。至于單功能CGN，可以通過酯化羧酸基團(tuán)來調(diào)節(jié)氧化/還原活性和區(qū)室化。本發(fā)明的化合物包含一種或多種產(chǎn)生“門”功能的羧化物，其“前藥”(例如酯)形式提供增加的CGN穿過細(xì)胞膜的通透性，而且導(dǎo)致增強(qiáng)的體內(nèi)半衰期?？梢杂矛F(xiàn)有的藥物通過酯或酰胺基團(tuán)修飾CGN以形成雙功能CGN。
用于治療源于ROS損傷的組織損傷的組合物包含CGN，它的酯或其活性藥物衍生物，其是在適當(dāng)?shù)乃幬?，化妝品，和診斷配方中，用于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，口服，局部，鼻，肺，陰道，經(jīng)皮或直腸給藥。
化合物合成在圖1，2和3中顯示CGN的3種結(jié)構(gòu)通式。結(jié)構(gòu)I是在圖1中描述的CGN。它是由任何酮或醛硝基氧與酯化的二羧酸反應(yīng)合成。結(jié)構(gòu)II是在圖2中描述的單氨基CGN。它是由羧基或乙酰氨基硝基氧與二酯化的二羧基α-氨基酸反應(yīng)合成。結(jié)構(gòu)III是二氨基酸CGN(參見圖3)。它是由羧基或乙酰氨基硝基氧與酯化和酰氨基二氨基酸反應(yīng)合成，其中酯化基團(tuán)是具有OH官能團(tuán)的任何化合物，包括現(xiàn)有的藥物。在結(jié)構(gòu)II中2個(gè)氨基用來連接硝基氧和最佳地，其它具有羧基的部分。因此，CGN的實(shí)例包括酯化的二羧化物CGN，酯化的一氨基酸CGN，和二氨基酸CGN以及其它衍生物，其包括二硝基氧，三硝基氧衍生物，或偶聯(lián)物，單獨(dú)或與現(xiàn)有的藥物或?qū)蚍肿咏M合使用。
描述CGN的組合物和給藥途徑。在多個(gè)實(shí)施例中本發(fā)明組合物的局部施用顯示CGN在細(xì)胞內(nèi)的定向傳遞是如何通過細(xì)胞酯酶將作為前藥的疏水酯化的CGN裂解成游離酸形式的親水CGN來實(shí)現(xiàn)的。已經(jīng)測試CGN的第二個(gè)實(shí)例如E-TOPS與現(xiàn)有技術(shù)的硝基氧，Tmpol相比在共同給藥中的血漿半衰期。當(dāng)給藥(腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，和口服)E-TOPS和Tempo時(shí)觀察到相對Tempol的E-TOPS延長的半衰期。已經(jīng)在UVB-誘導(dǎo)皮膚損傷的無毛小鼠模型中測試CGN的第3個(gè)實(shí)例如DE-TOPS。
定義這里使用術(shù)語“硝基氧(nitroxide)”來描速包含彼此直接相連的氧和氮原子的分子。硝基氧可以是電子給體或受體。硝基氧可以包含穩(wěn)定的硝?；杂苫?，其包含前體(如N-H形式)及其衍生物，所述衍生物包括它們對應(yīng)的羥胺衍生物(N-OH)，其中氧原子被羥基取代并且以鹵化氫的形式存在?？梢詫⒈景l(fā)明的硝基氧給藥于系統(tǒng)如人，并且通過給予或接受電子起調(diào)節(jié)氧化和還原反應(yīng)的作用。通過被強(qiáng)供電子團(tuán)取代的兩個(gè)相鄰的碳原子在氮核處提供硝基氧化物不成對電子的穩(wěn)定性。在N-O鍵的氧上具有部分負(fù)電荷，2個(gè)相鄰碳原子一起將不成對電子定位在氮核上。硝基氧通常可以具有雜環(huán)或線性結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的硝基氧可以含有一個(gè)，兩個(gè)或多個(gè)羧基或可以容易地變成羧基的基團(tuán)如酯基團(tuán)，羧基幫助維持使硝基氧化物作為電子給體的自由電子。在體內(nèi)環(huán)境中硝基氧可以與第一個(gè)過氧化物反應(yīng)形成氧銨(oxoammonium)(作為電子給體)，然后與第二個(gè)過氧化物反應(yīng)重新形成硝基氧(作為電子受體)。如果將硝基氧還原成羥胺，它失去它調(diào)節(jié)反應(yīng)的能力。通過將硝基氧定位在兩個(gè)羧酸基團(tuán)之間獲得“門控”作用，即硝基氧受到保護(hù)，并且與缺乏羧酸基團(tuán)的分子相比，在更多樣的體內(nèi)環(huán)境中它調(diào)節(jié)反應(yīng)的能力在更長的時(shí)期內(nèi)被保持。
這里使用的術(shù)語“醫(yī)治”，“治療”等通常指獲得期望的藥理和/或生理效果。治療是獲得有益或期望的臨床結(jié)果的方法，所述臨床結(jié)果包括但不限于減少活性氧物質(zhì)(ROS)的不良作用。在完全或部分抑制疾病和/或其癥狀方面，效果可以是防止性的，并且/或者在部分或完全治愈疾病和/或起因于疾病的副作用方面可以是治療性的。通常，本發(fā)明的方法包括治療通常與炎癥反應(yīng)有關(guān)的疾病并且可以施用于多種不同區(qū)域，特別是膜表面，包括皮膚，包括在GI道，鼻，喉，嘴，陰道腔中的那些的粘膜，眼表面，以及肺表面和血管系統(tǒng)表面。這里使用的“治療”包含在哺乳動物，特別是人中該癥狀或疾病的任何治療，并且包括(a)防止或診斷受試者中的疾病和/或癥狀，所述受試者易患疾病和/或癥狀但還未診斷為患有該疾??；(b)抑制疾病，即阻止它的發(fā)展；和/或(c)減輕疾病和/或它的癥狀，即導(dǎo)致疾病和/或由疾病導(dǎo)致的癥狀的消退。
本發(fā)明目標(biāo)在于調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，特別是調(diào)節(jié)過度氧化。多種身體損傷，包括將細(xì)胞經(jīng)受形形色色的包括紫外線和核照射的照射以及鈍傷可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和與其伴隨的過度氧化。治療可以與其它輔助治療如使用抗炎藥或抗生素藥物結(jié)合以調(diào)節(jié)炎癥和防止感染。
使用本發(fā)明的化合物和組合物可能進(jìn)行的治療類型包括對皮膚施用化合物和/或組合物以便在它發(fā)生以前治療曬斑和/或在曬斑已經(jīng)發(fā)生以后治療與曬斑有關(guān)的炎癥反應(yīng)。另外，在施用用于治療癌癥的照射或X線透射檢查之前和/或之后可以治療患者的皮膚。類似地，可以使患者漱口包含本發(fā)明的化合物的漱口藥以便治療照射對嘴和喉內(nèi)表面的副作用?？梢詫⒈景l(fā)明的化合物直接施用于骨髓以便提供保護(hù)，防止骨髓的過度氧化?？梢詫⒈景l(fā)明的化合物注射給患者以便調(diào)節(jié)血管系統(tǒng)中的炎癥反應(yīng)和過度氧化。當(dāng)被包括在施用于皮膚的化妝品配方中時(shí)本發(fā)明的化合物可以用于治療。此外，當(dāng)將皮膚進(jìn)行整容外科和/或激光磨皮(laserresurfacing)時(shí)，可以在激光磨皮之前和/或激光磨皮之后施用本發(fā)明的化合物和配方以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。經(jīng)閱讀本公開內(nèi)容后本領(lǐng)域技術(shù)人員將想起這些和其它類型的治療。
術(shù)語“有效量”是足以產(chǎn)生有益的或期望結(jié)果的量，所述結(jié)果包括臨床結(jié)果，同樣地“有效量”取決于其被施用的環(huán)境?？梢砸詥位蚨鄤┝拷o藥有效量。有效量可以是足以獲得治療，例如調(diào)節(jié)不良高水平的活性氧物質(zhì)的量。
“包含”和它的類似表述指“包括?！狈肿犹匦酝ㄟ^幾種獨(dú)立的化學(xué)結(jié)構(gòu)或分子改性可以實(shí)現(xiàn)按照本發(fā)明的CGN的生理區(qū)室化或定點(diǎn)傳遞。按照這里公開的標(biāo)準(zhǔn)來設(shè)計(jì)分子以提供選擇的滲透性和反應(yīng)性特性。可以將改性的CGN化合物局部施用并以特定的細(xì)胞，例如活表皮細(xì)胞為目標(biāo)。通過將CGN轉(zhuǎn)化成如本文所述的改性形式改變硝基氧的膜溶解度。例如，增加酯基團(tuán)，使分子具有更多脂溶性。通過由細(xì)胞脂酶催化的反應(yīng)去除這些基團(tuán)，使CGN具有更多水溶性并且更小脂溶性(例如在人脂質(zhì)中溶解性低1個(gè)對數(shù)，2個(gè)對數(shù)或3個(gè)對數(shù)或更多)。一旦改性的CGN已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞，內(nèi)源脂酶的普通胞內(nèi)水解機(jī)制產(chǎn)生CGN的衍生物，其具有降低的膜滲透性。因此，這些化合物容易進(jìn)入細(xì)胞(當(dāng)脂溶性時(shí))，但抵抗離開細(xì)胞(當(dāng)具有更大水溶性和更小脂溶性時(shí))，結(jié)果，顯示關(guān)于跨膜進(jìn)入活細(xì)胞的增加的滲透性。減少的脂溶性和增加的水溶性還提供硝基氧例如通過常規(guī)的生理清除過程滲出活體細(xì)胞或組織的降低的趨勢。該特征產(chǎn)生可選擇的體內(nèi)優(yōu)選區(qū)室化和持續(xù)治療或診斷的潛力。
如本文所述，通過酯化可以增強(qiáng)CGN的積累和隔離或區(qū)室化。局部施用優(yōu)選二酯，其可以是不對稱的，并且使其中一個(gè)酯化基團(tuán)比另一個(gè)更不穩(wěn)定。例如，BE-TOPS的叔丁酯比乙酯更容易水解，因?yàn)樗纫阴ジ环€(wěn)定。包含這兩種酯的不對稱硝基氧的水解因而將首先產(chǎn)生較小膜滲透性的一羧酸E-TOPS。具體二羧酸酯衍生物，例如琥珀酸酯的選擇決定區(qū)室化和胞內(nèi)積累的特性，因此可以被設(shè)計(jì)成較高或較低以適合具體的診斷或治療指示。同樣，天然存在的二羧酸氨基酸(例如天冬氮酸，谷氨酸)的二酯的制備將允許胞內(nèi)增加的積累和隔離，并且具有增加的優(yōu)勢，因?yàn)樘烊淮嬖诘陌被嵩诮o藥，分布，代謝和排泄(ADME)研究中眾所周知。
可以用于本發(fā)明的CGN在結(jié)構(gòu)上是多樣的，因?yàn)镃GN的必要性能是它被酯化的能力。因此，可以使用它一羧基，二羧基，或多羧基狀態(tài)的CGN。本發(fā)明所選實(shí)施方案具有下列結(jié)構(gòu)，盡管本發(fā)明考慮衍生物，異構(gòu)體，取代，聚合物，和保持其中官能度的其它常規(guī)化學(xué)改性。
本發(fā)明的化合物包括由結(jié)構(gòu)通式I包含的那些圖1 其中R1是任何硝基氧(nitroxide)或更具體地任何硝酰基自由基(NO)，其包含含有一個(gè)位于氮原子周圍的不成對電子的基團(tuán)，或更具體地另外包含碳和氫原子的線性(直鏈或支鏈)或環(huán)狀硝酰基自由基。R1的一個(gè)實(shí)例是2，2，6，6-四甲基-4-哌啶-1-氧基；其中R2和R3各自獨(dú)立地為氫，烷基，鏈烯基(alkeynyl)，芳基，芳烷基，烷芳基(akaryl)或硝基氧，特別是可以獨(dú)立地為氫，或乙基，應(yīng)當(dāng)指出當(dāng)R2和/或R3為H時(shí)形成羧酸基團(tuán)，并且該酸在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中例如人體中可以轉(zhuǎn)化為鹽?？梢孕纬扇魏嘻}，特別是可以形成Na和K鹽；其中“n”是0-18的整數(shù)(例如1-6或1-4)，特別是可以為“1，”“2”或“3?！痹谏鲜鼋Y(jié)構(gòu)I中可以通過-NH-基團(tuán)與“R1，”基團(tuán)結(jié)合以提供如以下式II所示的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)圖2 其中變量R1，R2，R3和n如上定義，特別是“n”可以是1，2或3。另外，當(dāng)“R1”是單環(huán)的環(huán)狀部分時(shí)，所述單環(huán)部分包含一個(gè)不成對電子位于氮原子周圍的“NO”基團(tuán)，例如R1可以是2，2，6，6-四甲基-4-coboxyl-哌啶(piperidene)-1-氧基，n可以為“1”。
在上述結(jié)構(gòu)I或II中“R2”或“R3”可以不與“O”但與“NH”連接部分結(jié)合。但“R2”和“R1”各自通過“NH”連接，獲得如下所述的產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)III。
圖3 當(dāng)變量R1，R2，R3和“n”是如對于I和II的上述定義時(shí)，上述結(jié)構(gòu)III包含本發(fā)明的化合物。
在結(jié)構(gòu)I，II和III中，R1部分被定義為可以是含有一個(gè)不成對電子的硝?；杂苫?，硝?；杂苫梢允侨缦率鼋Y(jié)構(gòu)IV所示的環(huán)狀硝酰基。
通過結(jié)構(gòu)通式IV舉例本發(fā)明的化合物圖4 其中R2和R3是結(jié)構(gòu)I，II或III相關(guān)的如上定義的各自獨(dú)立的部分，特別地R2和R3可以是甲基，乙基，或可以為叔丁基的丁基。
如這里使用環(huán)可以是在至少一個(gè)位置含有NO基團(tuán)的-N-的任何環(huán)狀部分。環(huán)可以是如圖5的6元環(huán)，如圖13的5元環(huán)或其它環(huán)和/或稠環(huán)結(jié)構(gòu)。
在圖7中其中R2＝R3＝H(TOPS)的一個(gè)結(jié)構(gòu)中是在胞內(nèi)產(chǎn)生硝基氧功效的酯酶裂解后活細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，R2和(或)R3它們本身是如每個(gè)圖11和圖12的結(jié)構(gòu)，圖6描述不對稱結(jié)構(gòu)，R2＝H并且R3每個(gè)是關(guān)于結(jié)構(gòu)I，II和III的如上定義的任何部分。圖8給出圖6的實(shí)例，其中R3＝乙醇(E-TOPS)。圖9和圖10提供圖5的對稱結(jié)構(gòu)的實(shí)例，其中R2＝R3＝乙醇(DETOPS)或者R2＝R3＝叔丁醇(DTTOPS)。圖11給出二自由基結(jié)構(gòu)的實(shí)例，其中R2＝Tempol(TETOPS)。
在本發(fā)明化合物的任何結(jié)構(gòu)中R2和R3可以用來將分子與其它原子，分子，或生物物質(zhì)結(jié)合。例如，在結(jié)構(gòu)III中R2可以用來將分子與其它反應(yīng)活性部位結(jié)合，如在美國專利5,725,839；5,741,893；5,767,089；5,804,561；5,807,831；5,817,632；5,824,781；5,840,701；5,591,710；5,789,376；5,811,005；6,048,967中任何一個(gè)所述。另外，與OR2基團(tuán)連接的NH可以用來與其它分子如銅三肽(copper tri-peptide)結(jié)合。
因?yàn)楸疚乃龅幕衔锾峁┛寡趸趸醯亩ㄏ蛑委熈?，它們在防止和減輕氧化應(yīng)激效應(yīng)中是高度有效的。發(fā)現(xiàn)與Tempol相比，通過以200mg/kg靜脈內(nèi)給藥，肌內(nèi)，口服，和腹腔內(nèi)給藥E-TOPS具有增加的體內(nèi)半衰期。參見圖18，19，20，和21。還已經(jīng)證明與Tempol相比E-TOPS在小鼠LD50模型中具有極低的急性毒性曲線(profile)(參見圖24)。
在經(jīng)皮施用中，當(dāng)在小鼠中照射之前和之后施用時(shí)DE-TOPS(圖32，35)配方減少UVB光誘導(dǎo)的皮膚加厚，出血，炎癥。DE-TOPS還顯示對由UVB照射誘導(dǎo)的慢性損傷的效果(圖33)。這些制劑在減少皺紋方面比Retin A有利(參見圖37)。如以下更詳細(xì)地描述，本發(fā)明CGN化合物的主要優(yōu)勢是以多種途徑給藥生理相容的溶液的能力。此外，取決于靶細(xì)胞和診斷或治療目的，通過同時(shí)皮下給藥多硝基氧(polynitroxide)可以增強(qiáng)這些化合物的活性。
本發(fā)明的組合物可以用于皮膚病學(xué)/化妝品可接受的用于經(jīng)皮的載體如軟膏，洗劑，或凝膠劑，和其它作為稀釋劑，分散劑或載體的溶劑或載體。載體可以包含通常用在護(hù)膚品中的物質(zhì)如水，液體或固體潤膚劑，硅油，乳化劑，溶劑，濕潤劑，增稠劑，粉劑，推進(jìn)劑等。
如上所述，不成對的硝?；娮訛橄趸跆峁┏丝寡趸钚砸酝獾钠渌杏眯阅堋Ｌ貏e是，硝基氧在它們自由基形式中是順磁探針，其EPR信號可以反映生物系統(tǒng)中的代謝信息，例如氧張力或組織的氧化還原態(tài)。因?yàn)樘烊淮嬖诘牟怀蓪﹄娮釉隗w內(nèi)基本上沒有，EPR成象具有另外的優(yōu)點(diǎn)，即基本上沒有背景噪聲。硝基氧還減少氫核的馳豫時(shí)間，可在質(zhì)子或核磁共振成象中用作造影劑。硝基氧還可以作為造影劑將代謝信息增加到已經(jīng)從MRI獲得的形態(tài)數(shù)據(jù)。例如，通過取代硝基氧上的各種官能團(tuán)，可以操縱包括松弛性(relaxivity)，溶解度，生物分布(biodistribution)，體內(nèi)穩(wěn)定性和耐受性的性能。通過區(qū)分等強(qiáng)度的，但在組織學(xué)上不相似的組織和通過促進(jìn)損傷如血腦屏障的損傷，膿腫和腫脹的定位和鑒定，從硝基肟獲得的對比度增強(qiáng)可以改善MRI的性能。
配方鑒于硝基氧穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，可以通過各種途徑對患者給藥本文公開的組合物。為了本發(fā)明的目的，通過已知的技術(shù)配制無毒的“藥物”或“藥物可接受的”組合物，當(dāng)需要時(shí)與批準(zhǔn)用于對人給藥的載體或添加劑一起使用。如以下實(shí)施例所述，給藥途徑包括任何類型的注射，包括肌內(nèi)，皮下或腹膜內(nèi)；靜脈內(nèi)，眼或眼內(nèi)；口；任何類型的跨粘膜傳遞，包括頰，鼻，肛門，和陰道；局部或經(jīng)皮的；和肺內(nèi)的。該組合物可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的緩沖液，鹽，或其它溶劑以保持疫苗在溶液中的活性。
本發(fā)明的組合物或配方可包含在藥用賦形劑或載體中的有效量的本發(fā)明的硝基氧。載體通常為相對惰性的物質(zhì)，其促進(jìn)以適于傳遞至患者如人的劑量形式給藥藥物有效物質(zhì)。
包括的適當(dāng)賦形劑不限于穩(wěn)定劑，潤濕劑和乳化劑，用于改變同滲容摩的鹽，包封劑(encapsulating agents)，緩沖液，透皮促進(jìn)劑，潤膚霜，和凝膠劑。藥用賦形劑的實(shí)例在在此引入以公開和描述載體和配方的Remington’s Pharmaceutical Sciences(Alfonso R.Gennaro編輯，第19版1995)中描述。
對反膚施用的局部配方可以包含硝基氧，載體，和濾光劑(sun block)或UV吸收劑。如在美國專利6,235,271；6,224,854；6,071,501；5,976,513；5,972,316；和5,968,485中任何一個(gè)和在這些專利中引用的專利和出版物中所公開，已知大量的UV吸收劑。UV吸收劑可以是任何已知的油溶性UV吸收劑，特別是已經(jīng)批準(zhǔn)并銷售的用于化妝品用途那些。例如在“Sunscreens”，Development，Evaluation and Regulatory Aspects，Eds.N.J.Lowe和N.A.Shaath，M.Dekker Inc.，New York and Basel，1990；和KenKlein，Encyclopediaof UV absorbers for sunscreen products，Cosmetics &Toiletries 107 45-64(1992)中描述該油溶性的有機(jī)UV吸收劑。
油溶性，非微粉化的UV吸收劑例如可以是對氨基苯甲酸衍生物如對氨基苯甲酸的酯，鹽或胺-改性(amine-modified)的衍生物；水楊酸衍生物如它的酯或鹽；二苯甲酮衍生物；二苯甲酰甲烷衍生物；二苯丙烯酸酯衍生物；苯并呋喃衍生物；包含一個(gè)或多個(gè)有機(jī)硅殘基的聚合紫外吸收劑；肉桂酸酯；樟腦衍生物；三苯胺基-s-三嗪衍生物；苯基苯并咪唑磺酸及其鹽；尿刊酸(3-咪唑-4-基-丙烯酸)或其乙酯；薄荷基鄰氨基苯甲酸鹽(或酯)；苯并三唑；羥基苯基三嗪衍生物；或雙間苯二酚二烷基氨基三嗪。
二苯甲酮衍生物的具體實(shí)例包括二苯甲酮-3-(2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮)，二苯甲酮-4(2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸)和二苯甲酮-8-(2，2’-二羥基-4-甲氧基二苯甲酮)。
二苯甲酰甲烷衍生物的具體實(shí)例是丁基甲氧基二苯甲酰甲烷[1-(4-叔丁基)-3-(4-甲氧苯基)-1，3-丙烷-1，3-二酮]。
二苯丙烯酸酯衍生物的具體實(shí)例包括奧克立林(2-氰基-3，3’-二苯丙烯酸2-乙基己基酯)和依托立林(2-氰基-3，3’-二苯丙烯酸乙酯)。
苯并呋喃衍生物的具體實(shí)例包括在美國專利5,338,539或EP582189中描述的3-(苯并呋喃基)-2-氰基丙烯酸酯，在美國專利5,518,713中描述的2-(2-苯并呋喃基)-5-叔丁基苯并噁唑和在美國專利5,362,481中描述的2-(對氨基苯)苯并呋喃。
包含一個(gè)或多個(gè)有機(jī)硅殘基的聚合紫外吸收劑的具體實(shí)例是在歐洲專利EP709080中公開的丙二酸亞芐酯聚硅氧烷衍生物，其中Rsub.15是H或OMe并且r約為7；和在WO 94/06404中描述的苯并三唑聚硅氧烷類型的聚合物。
肉桂酸酯的具體實(shí)例包括甲氧基肉桂酸辛酯(4-甲氧基肉桂酸2-乙基己基酯)，二乙醇胺甲氧基肉桂酸酯(4-甲氧基肉桂酸的二乙醇胺鹽)，對甲氧基肉桂酸異戊酯(4-甲氧基肉桂酸2-異戊酯)，甲基肉桂酸2，5-二異丙酯，在美國專利5,601,811中公開的肉桂酸衍生物和在WO 97/00851中公開的肉桂酸衍生物。
樟腦衍生物的具體實(shí)例是4-甲基-苯亞甲基樟腦[3-(4’-甲基)苯亞甲基-莰烷-2-酮]，3-苯亞甲基樟腦(3-苯亞甲基-莰烷-2-酮)，聚丙酰酰胺基甲基苯亞甲基樟腦{N-[2(和4)-2-oxyborn-3-亞基-甲基]芐基}丙烯酰胺聚合物}，三甲基銨苯亞甲基樟腦硫酸酯[3-(4’三甲基銨)-苯亞甲基-莰烷-2-酮硫酸二甲酯]，對苯二亞甲基二樟腦磺酸{3，3’-(1，4-苯二亞甲基)-雙-(7，7-二甲基-2-氧代-二環(huán)-[2.2.1]庚-1-甲烷磺酸}及其鹽和苯亞甲基樟腦磺酸[3-(4’-磺基)苯亞甲基-莰烷-2-酮]及其鹽。
三苯胺基-s-三嗪衍生物的具體實(shí)例包括辛基三嗪[2，4，6-三苯胺基-(對羰-2’-乙基-1’-氧)-1，3，5-三嗪，在美國專利5,332,568中公開的三苯胺基-s-三嗪衍生物，在歐洲專利517104中公開的三苯胺基-s-三嗪衍生物，在歐洲專利EP570838中公開的三苯胺基-s-三嗪衍生物，在美國專利5,252,323中描述的三苯胺基-s-三嗪衍生物，在WO93/17002-A1中描述的三苯胺基-s-三嗪衍生物和在WO97/03642-A1中公開的三苯胺基-s-三嗪衍生物。
苯并三唑的具體實(shí)例是2-(2-羥基-5-甲基-苯基)苯并三唑。
羥基苯基三嗪衍生物的具體實(shí)例包括例如在EP-A1-775,698中描述的那些，如2，4-雙-{[4--(2-乙基-己氧基)-2-羥基]-苯基}-6-(4-甲氧苯基)-1，3，5-三嗪。
雙間苯二酚二烷基氨基三嗪的具體實(shí)例是例如在EP-A1-780,382中描述的那些。
無機(jī)微細(xì)顏料UV吸收劑，新防曬劑的任選組分b)可以是例如鍍有氧化鋁或二氧化硅的二氧化鈦，鍍有氧化鋁或二氧化硅的氧化鋅，或云母。
聚合的空心球體組分，按照本發(fā)明的新防曬劑的組分c)可以是例如在EP-A-761,201中描述的那些。
方法公開一種治療方法，由此對患者給藥治療有效量的硝基氧化合物。硝基氧化合物由包含直接結(jié)合在一起的氮原子和氧原子和不成對電子(·NO)的第一部分，和提供負(fù)電荷的第二部分組成。第一部分和第二部分通過位于兩者之間的連接基團(tuán)直接或間接連接，并且與第一部分和第二部分以這樣的方式結(jié)合以致當(dāng)硝基氧存在于患者中時(shí)第二部分的負(fù)電荷穩(wěn)定第一部分的·NO。通過穩(wěn)定分子的·NO部分允許硝基氧與活性氧物質(zhì)長時(shí)間反應(yīng)和調(diào)節(jié)那些活性氧物質(zhì)的不良作用。
公開一種方法，由此對可以是人的患者的皮膚施用配方。該配方由載體和具有第一脂溶性和第一水溶性的化合物組成。允許該化合物滲透患者的皮膚和到達(dá)活細(xì)胞并在細(xì)胞的酶的存在下反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)生具有顯著小于第一脂溶性的第二脂溶性的化合物，并且還獲得顯著大于第一水溶性的第二水溶性，因此允許化合物滲透到活細(xì)胞和保持與那些細(xì)胞接觸?；衔锟梢允窍趸?，其幫助調(diào)節(jié)活性氧物質(zhì)的不良作用。
實(shí)施例提出下列實(shí)施例以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和利用本發(fā)明的完全的公開內(nèi)容和描述，而不是打算限制本發(fā)明人認(rèn)為的它們的發(fā)明的范圍，它們也不是表示以下的實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行的全部或唯一的實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)努力確保關(guān)于所用數(shù)字(例如量，溫度等)的準(zhǔn)確度，但應(yīng)當(dāng)考慮一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另外指出，份是重量份，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度數(shù)，壓力是在大氣壓下或接近大氣壓。
實(shí)施例1一和二羧酸和酯化的硝基氧物質(zhì)的合成和制備下列化學(xué)合成方案產(chǎn)生穩(wěn)定的硝基氧自由基，其作為膜滲透性和體內(nèi)清除的函數(shù)的生理隔室化被帶負(fù)電荷的陰離子如一或二羧酸調(diào)節(jié)。關(guān)于酯衍生物局部施用是特別有利的，所述酯衍生物提供跨越疏水屏障的差別滲透性，第一種硝基氧物質(zhì)具有相對于第二種物質(zhì)增加的膜滲透性，在通過胞內(nèi)脂酶水解后第二種物質(zhì)具有增加的胞內(nèi)保留和抗氧化治療效用。
(a)2，2，6，6，-四甲基-1-氧基-4-哌啶基琥珀酸一乙基酯(E-TOPS)和二乙基酯(DE-TOPS)的合成。
在氮?dú)鈿夥障聦⒀b備回流冷凝器和磁攪拌器的干燥雙頸燒瓶充滿45ml無水叔丁醇和6.72g叔丁醇鉀。在回流下煮沸和加熱混合物直至所有固體溶解。然后冷卻燒瓶并加入6.8g 4-氧代-[TPO]，12ml琥珀酸二乙酯和15ml叔丁醇。然后將反應(yīng)混合物加熱10分鐘。在用冰冷卻和用稀HCL中和后，在減壓下將大部分醇蒸餾掉。將殘?jiān)谷?50ml冰水中并用稀鹽酸酸化至pH3，用二氯甲烷萃取。用1％氨溶液將合并的萃取液洗滌幾次。溶液用冰冷卻，酸化并再次用二氯甲烷萃取。然后用硫酸鈉干燥產(chǎn)生的萃取液。在蒸發(fā)二氯甲烷后，用己烷研制剩余的紅色油狀液體。在多孔瓷板上壓濾單酯結(jié)晶，并從乙醚和己烷的混合物中再結(jié)晶。產(chǎn)物是黃色棱晶，熔點(diǎn)為103℃，預(yù)期產(chǎn)率為60-70％。
圖14顯示通過液相色譜分離TOPS，E-TOPS，和DE-TOPS。
實(shí)施例2
DE-TOPS水解成TOPS參考圖15，當(dāng)硝基氧化合物暴露于酯酶或任何胞內(nèi)酶或其它裂解酯基團(tuán)的生物化學(xué)反應(yīng)時(shí)，DE-TOPS水解成非酯化TOPS形式，將產(chǎn)生選擇性的細(xì)胞膜滲透性和增加的胞內(nèi)保留。將DE-EOPS作為疏水的前藥施用將角質(zhì)層(死細(xì)胞)滲透到代謝活性的基底膜層。DE-TOPS的酶促水解將允許產(chǎn)物TOPS保留在水相中并且主要在胞內(nèi)體積中。為了示范該反應(yīng)，顯示DE-TOPS的化學(xué)水解以產(chǎn)生化合物，與辛醇比較其優(yōu)選分配在水中。
將20mg DE-TOPS樣品加入1ml水和1ml辛醇的混合物并使其分配。在15分鐘后，取40μl水或油樣品用于EPR光譜分析。緊接著，將20mg DE-TOPS混合在1ml 10mM NaOH中并允許在室溫下溫育過夜。用鹽酸中和溶液并加至1ml水和2ml辛醇。允許混合物分離，在15分鐘后，取40μl水或油樣品用于EPR光譜分析。使用Varian E9分光光度計(jì)獲得EPR光譜。掃描寬度為100G，頻率為9.535GHz，微波功率為2mV并且調(diào)制頻率為100Hz。
在水解前，優(yōu)選將DE-TOPS分配在辛醇中。發(fā)現(xiàn)DE-TOPS的分配系數(shù)(LogP)為1.7。在水解后，假定產(chǎn)物TOPS分配在水相中。發(fā)現(xiàn)TOPS的分配系數(shù)(LogP)為0.9。這顯示在水解后，如此形成的產(chǎn)物是顯著親水的并且將更容易胞內(nèi)區(qū)室化。
實(shí)施例3TE-TOPS的合成該試驗(yàn)性研究是合成作為Tempol證明的TE-TOPS，裂解的化合物可以結(jié)合到TOPS-酯前藥構(gòu)建體中。從14N-E-TOPS和15N-Tempol合成TE-TOPS。合成是多步過程，包括氧代-Tempo(4-氧代-2，2，6，6-四甲基-哌啶-1-氧基)與琥珀酸二乙酯的縮合，接著14N-E-TOPS與15N-Tempol或乙醇的酯化，分別產(chǎn)生14N-DE-TOPS或14N-，15N-TE-TOPS。通過HPLC和EPR監(jiān)視形成雙游離基14N，15N-TE-TOPS的反應(yīng)。14N-E-TOPS產(chǎn)生三重峰的EPR光譜，如圖16A左圖所示。它的HPLC洗脫時(shí)間為6.3分鐘，如圖16B左圖所示。15N-Tempol的HPLC洗脫時(shí)間為5.3分鐘，如圖16B右圖所示。在3小時(shí)反應(yīng)后，在5.3和6.3分鐘處的HPLC峰的高度減小而在13.9分鐘處的新峰出現(xiàn)(參見圖16C，右圖)。在反應(yīng)6小時(shí)后，15N-Tempol和14N-E-TOPS峰幾乎消失(圖16D，右圖)。為了確保在13.9分鐘處的HPLC峰由14N-，15N-TE-TOPS組成，收集該峰然后通過EPR分析。EPR光譜在圖16D，左圖中顯示。新峰的加寬和出現(xiàn)是由于雙游離基之間自旋-自旋和自旋-自旋偶極相互作用。
實(shí)施例4TE-TOPS水解成TOPS和Tempol將20mg14N-15N-TE-ToPS混合在1ml 10mM KOH中并允許在室溫下溫育過夜。用鹽酸中和溶液。使用Varian E9分光光度計(jì)獲得EPR光譜。掃描寬度為100G，頻率為9.535GHz，微波功率為2mV并且調(diào)制頻率為100Hz。圖17A中更尖銳的EPR光譜顯示，與圖16D作圖的寬譜相比TE-TOPS完全水解。將局部乳膏中的15N-14N-TE-TOPS施用在小鼠皮膚上。尿樣顯示體內(nèi)酯酶裂解，參見圖17B。
實(shí)施例5DE-TOPS和Tempol的體內(nèi)血漿半衰期如上所述，現(xiàn)有基于硝基氧的組合物用于體內(nèi)治療或診斷用途的主要缺點(diǎn)是這些分子有限的半衰期和它們迅速的體內(nèi)生物還原(bioreduction)和清除。Tempol比較短的半衰期的結(jié)果是需要給藥越來越大的劑量以產(chǎn)生深刻的治療或診斷效果。如以下圖24所示，增加的硝基氧劑量可以產(chǎn)生急性和慢性毒性。然而，在化合物的血漿半衰期增加的地方，可以減小急性和慢性征候(indication)的總劑量。
通過每分鐘收集光譜共60至90分鐘測量血漿半衰期。從每個(gè)光譜計(jì)算15N Tempol或14N E-TOPS EPR信號的峰高。如圖18-21所示分別對腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，和口服畫出TempolL或E-TOPS的峰高對時(shí)間的曲線。圖18顯示i.p.給藥125mg/kgg E-TOPS和Tempol的體內(nèi)血漿半衰期的測量。對于化合物整個(gè)半衰期14N E-TOPS(上線)被顯著提高。盡管15N Tempol(下線)具有超過40分鐘的可測量的半衰期，E-TOPS具有至少80分鐘顯著更高的活性。劑量是摩爾比率1∶1的125mg/kg E-TOPS和80mg/kg Tempol。
圖19顯示靜脈內(nèi)給藥125mg/kg E-TOPS和Tempol的體內(nèi)血漿半衰期的測量。在靜脈輸注實(shí)施例中，Tempol(下線)在體內(nèi)迅速減少，以致通過在輸注后5分鐘標(biāo)記，極少的活性Tempol殘留在血管內(nèi)部。
如圖20所示，在肌內(nèi)共同給藥后，除了開始數(shù)分鐘以外E-TOPS的體內(nèi)血漿半衰期顯著延長，超過Tempol至少60分鐘。
參考圖21，顯示當(dāng)口服給藥兩種化合物時(shí)與Tempol相比E-TOPS的體內(nèi)血漿半衰期延長。如圖18-21，劑量是摩爾比率1∶1的125mg/kg E-TOPS和80mg/kg Tempol。
實(shí)施例6在人皮膚中的滲透和區(qū)室化參考圖22，將石油基中的DE-TOPS(100mM)施用在新鮮的人皮膚上。受體緩沖液是含有0.01％疊氮化鈉的PBS。持續(xù)攪拌緩沖液。用循環(huán)水浴將細(xì)胞保持在37℃。圖22顯示皮膚滲透的程度。小鼠皮膚(或供體人皮膚)覆蓋受體的頂部，將細(xì)胞DE-TOPS施用在皮膚之上。在皮膚之下，施用PBS緩沖液以保持皮膚活著。24小時(shí)后收集緩沖液用于EPR分析。清洗皮膚表面并檢驗(yàn)皮膚樣品的EPR信號。盡管在施用前Tempol和DE-TOPS具有相同的信號強(qiáng)度，在施用24小時(shí)后在緩沖液化合物中存在比DE-TOPS更強(qiáng)的Tempol信號。然而，在皮膚中E-TOPS信號強(qiáng)于Tempol。因此，與Tempol相比DE-TOPS局限在皮膚中。DE-TOPS將滲透到表皮和真皮細(xì)胞中，在那它將被酶促水解和變成區(qū)室化。與易溶解的Tempone相比，這將導(dǎo)致DETOPS在這些皮膚層中更均勻的分布。
在人志愿者的皮膚上進(jìn)行使用DETOPS的預(yù)備S-帶EPR光譜學(xué)和成象實(shí)驗(yàn)。用乙醇充分洗滌人志愿者的前臂皮膚，約6mm直徑的圓點(diǎn)，典型地在腕的月面(lunar surface)，并將3μL 100mM DE-TOPS溶液(約2×1017spins)施用到標(biāo)記的皮膚區(qū)域。5分鐘后，當(dāng)沉積的溶液干燥時(shí)，將特別設(shè)計(jì)的具有7mm直徑孔的定位支架和鎖定在共振器蓋的孔中的底盤附著在皮膚上以將該皮膚區(qū)域固定于表面共振器。參見“人皮膚中硝基氧自由基分布和代謝的體內(nèi)EPR成象，”He等，J.of Magnetic Resonance148，155-164(2001)。然后開始EPR和EPRI測量。進(jìn)行在志愿者上的測量15至20分鐘，其后有30分鐘的休息期，其中志愿者將臂從共振器和磁鐵移開。該支架固定皮膚定位并確保加載共振器恒定的填充系數(shù)。在持續(xù)達(dá)8小時(shí)的全部系列的測量中讓定位支架附著在臂上。
參考圖23，顯示CNO滲透和區(qū)室化的彩色-編碼圖象。在局部施用3μL或DE-TOPS(DMSO中100mM)后1小時(shí)和8小時(shí)，從相同的人志愿者的前臂皮膚獲得1-D空間圖象。使用帶有如He等，J.of MagneticResonance 148，155-164(2001)中所述的特別設(shè)計(jì)的表面共振器的S-帶(2.2GHz)EPR成象系統(tǒng)進(jìn)行測量。虛線表示皮膚表面。估計(jì)的皮膚深度標(biāo)記為表皮，真皮和皮下層。區(qū)室化導(dǎo)致DE-TOPS貫穿皮膚層的更擴(kuò)散的分布。經(jīng)過8小時(shí)，與tempone相比，DE-TOPS的1-D EPR空間圖象顯示增強(qiáng)的貫穿真皮和表皮的視覺分布。
實(shí)施例7Tempol和E-TOPS的急性毒性LD50以及E-TOPS的代謝。
如上所述，未結(jié)合的小分子硝基氧的實(shí)際的，臨床應(yīng)用已經(jīng)受體內(nèi)減小的活性和比較短的體內(nèi)半衰期限制。體內(nèi)減小的半衰期的結(jié)果是需要給藥更大的劑量以獲得相同的治療或診斷效果。用LD50模型測定在不同劑量下小鼠的存活率可以測量Tempol的毒性。圖24顯示關(guān)于Tempol的急性毒性曲線作為隨著增加的劑量生存率的函數(shù)。E-TOPS配方在可達(dá)3.5mmol/kg的劑量下基本上未顯示存活率的減小，而Tempol在2.0mmol/kg的較低劑量下顯示零存活率。在2.0-2.5mmol/kg的劑量之間出現(xiàn)存活率的顯著差異。圖25顯示來源于6小時(shí)后對于血漿尿化合物中DE-TOPS的更強(qiáng)的EPR信號(與濃度成比例)，顯示通過正常代謝的排泄和清除。
實(shí)施例8E-TOPS過氧化物歧化酶活性的抑制圖26顯示與Tempol相比的E-TOPS過氧化物歧化酶活性。通過電子順磁共振測量E-TOPS和Tempol的SOD-模擬活性。隨時(shí)間監(jiān)測高磁場EPR峰。不含NADH(-NADH)的E-TOPS和Tempol曲線顯示硝基氧與過氧化物催化反應(yīng)。含有NADH(+NADH)的E-TOPS和Tempol曲線顯示從氧銨至羥胺的2個(gè)電子的還原。結(jié)果顯示E-TOPS具有與Tempol類似的SOD活性。
實(shí)施例9培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元中的血紅蛋白毒性E-TOPS在中風(fēng)中的出血性轉(zhuǎn)化模型中是神經(jīng)保護(hù)性的。初級神經(jīng)元培養(yǎng)物是從胎大鼠崽(胚胎期第15天)的前腦制備的。通過在補(bǔ)充谷氨酰胺(2mM)，青霉素-鏈霉素(50單位/ml-0.05mg/ml)，熱失活的馬血清(10％)，胎牛血清(10％)，葡萄糖(0.5％或28mM)的神經(jīng)元培養(yǎng)基(MEM Eagle(Sigma，M4526))中重復(fù)機(jī)械研制分散細(xì)胞。在離心(900g；5分鐘)后，將細(xì)胞以5×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度放置在聚賴氨酸包被的96孔平板上。以10mM的終濃度加入血紅蛋白，以10μM，1μM和0.1μM的終濃度加入ETOPS。在溫育24小時(shí)后使用比色MTT定量測定神經(jīng)元的生存力。將MTT加入每個(gè)孔以使染料的終濃度為0.15mg/ml。然后將平板返回至培養(yǎng)箱1小時(shí)，此時(shí)去除未結(jié)合的MTT，讓平板風(fēng)干。然后通過加入酸化的異丙醇(里面含有0.1N HCl)溶解存在于活細(xì)胞中的紫色產(chǎn)物，并使用96孔平板讀出器測量吸光強(qiáng)度(540nm)。％對照＝(測試A540/對照平均值)×100％。圖27顯示E-TOPS樣品增加的神經(jīng)元生存力。
實(shí)施例10暴露于過硝酸鹽發(fā)生器(generator)SIN-1的皮層神經(jīng)元的TOPS或TOPS-酯神經(jīng)保護(hù)。
基于過硝酸鹽的產(chǎn)生在培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元中研究SIN-1的毒性。在該模型中TOPS或TOPS-酯是神經(jīng)保護(hù)性的證明表現(xiàn)為硝基氧依賴性地阻斷由SIN-1導(dǎo)致的EGFR激活。
初級神經(jīng)元培養(yǎng)物是從胎大鼠崽(胚胎期第15天)的前腦制備的。通過在補(bǔ)充谷氨酰胺(2mM)，青霉素-鏈霉素(50單位/ml-0.05mg/ml)，熱失活的馬血清(10％)，胎牛血清(10％)，葡萄糖(0.5％或28mM)的神經(jīng)元培養(yǎng)基(MEM Eagle(Sigma，M4526))中重復(fù)機(jī)械研制分散細(xì)胞。在離心(900g；5分鐘)后，將細(xì)胞以5×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度放置在聚賴氨酸包被的96孔平板上。按照公開的方法(Carroll等2000)在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。剛好在使用前將SIN-1(3-嗎啉基悉尼酮亞胺，Sigma)，PN發(fā)生器加入每個(gè)孔以產(chǎn)生1mM的終濃度。在SIN-1之前15分鐘以指示的濃度將TOPS，E-TOPS或DE-TOPS加入每個(gè)培養(yǎng)物。使用比色MTT定量測定神經(jīng)元的生存力。將MTT加入每個(gè)孔以使染料的終濃度為0.15mg/ml。然后將平板返回至培養(yǎng)箱1小時(shí)，此時(shí)去除未結(jié)合的MTT，讓平板風(fēng)干。然后通過加入酸化的異丙醇(里面含有0.1N HCl)溶解存在于活細(xì)胞中的紫色產(chǎn)物，并使用96孔平板讀出器測量吸光強(qiáng)度(540nm)。％對照＝(測試A540/對照平均值)×100％。
參考圖28，TOPS或TOPS-酯以劑量依賴的方式防止SIN-1的毒性。通過防止受體的共價(jià)二聚化和隨后的自磷酸化，神經(jīng)保護(hù)濃度的這些化合物將防止依賴過硝酸鹽的EGFR激活。
實(shí)施例11通過抑制硝化的抗氧化活性為了證明DE-TOPS，E-TOPS和TOPS的體外抗氧化活性，將這些化合物與作為金標(biāo)準(zhǔn)的Tempol相比較。顯示Tempol防止體內(nèi)通過過硝酸鹽的4-羥基苯乙酸(HPA)的硝化。在該預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，測量通過Tempol，DE-TOPS，E-TOPS或TOPS的過硝酸鹽依賴的HPA硝化的％抑制。
通過先前所述的方法制備過硝酸鹽。在100mM磷酸鈉pH6.5中制備1mM 4-羥基苯乙酸(HPA，Sigma)溶液。將一定量的TOPS，E-TOPS和DE-TOPS加入1ml上述HPA溶液以產(chǎn)生0.98，3.91，15.5，62.5和250M的硝基氧終濃度。以1mM的終濃度加入過硝酸鹽開始硝化。還使用非活性過硝酸鹽作為空白和零硝基氧作為陽性對照進(jìn)行反應(yīng)。硝化后接著在405nm下分光光度測量。在用NaOH將反應(yīng)混合物的pH增加到10-11以后分光光度測定4-羥基-3-硝基苯乙酸酯的濃度。
參考圖29，通過1mM過硝酸鹽的40％-60％的HPA硝化被3μM本發(fā)明的硝基氧抑制。通過硝基氧的抑制機(jī)制是催化的。因?yàn)檫^硝酸鹽被提示在照射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中起重要作用，TOPS-酯具有作為暴露于活性氧物質(zhì)如過硝酸鹽的皮膚治療的功效。
實(shí)施例12通過暴露于TNF-α測量細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡通過其中通過暴露于腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的模型可以測量紫外光誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。如圖30所示，針對對照測量關(guān)于細(xì)胞隨時(shí)間的編程性細(xì)胞死亡嚴(yán)重性的測量結(jié)果。將培養(yǎng)的人Y-79細(xì)胞保持在pH7.4下培養(yǎng)瓶中的兩性霉素/青霉素/鏈霉素處理的(1％v/v)RPMI 1640培養(yǎng)基與L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的混合物中，在10％-CO2/90％-空氣的孵育條件下37攝氏度和20％濕度的培養(yǎng)箱中。將E-TOPS制備成10mg/ml配方。從該原液，將10μl加入1ml細(xì)胞懸浮液以使ETOPS的終濃度為100μg/ml ETOPS。使用人TNF-α(10μg/ml)來制備連續(xù)的培養(yǎng)基稀度以獲得5.0ng/ml的TNF-α濃度。在細(xì)胞計(jì)量測定之前在Zeiss倒置顯微鏡上通過錐蟲藍(lán)排除測定(exclusion assay)測定細(xì)胞密度和生存力以確保細(xì)胞濃度。在小瓶設(shè)定在給定濃度下溫和混合TNF-α6，24，和48小時(shí)，將細(xì)胞因子處理的細(xì)胞再懸浮于PBS中。將細(xì)胞再懸浮在膜聯(lián)蛋白V-FITC偶聯(lián)物的溶液中并在室溫下黑暗中溫育15分鐘。然和將結(jié)合緩沖液加至每個(gè)樣品以產(chǎn)生可達(dá)1.0×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。通過混合下列各項(xiàng)制備結(jié)合緩沖液10ml 1M HEPES/NaOH，ph7.4，30ml 5M NaCl，5ml 1M KCl，1ml 1M MgCl2，1.8ml 1M CaCl2和52.2ml DDW。
采用流式細(xì)胞計(jì)量方法以利用膜聯(lián)蛋白V與帶負(fù)電的磷脂酰絲氨酸(PS)殘基以1∶50膜聯(lián)蛋白對PS的比率的可逆和依賴于鈣的結(jié)合。然后對來源于培養(yǎng)物小瓶的細(xì)胞進(jìn)行在Becton-Dickinson FACStar流式細(xì)胞儀上的488nm測定，以確定不能存活的細(xì)胞的相對比例。使用二維x-y等高線圖來顯示早期編程性細(xì)胞死亡事件與晚期編程性細(xì)胞死亡事件分開的群體。在細(xì)胞計(jì)量試驗(yàn)之前設(shè)定補(bǔ)償，通過使用僅用膜聯(lián)蛋白染色的群體，和未染色的群體來限定在各個(gè)FL-1/F1-2象限中檢測的最高限度。使用CellQuest軟件為每組樣品象限提供的統(tǒng)計(jì)學(xué)和回歸分析，平均5000個(gè)細(xì)胞事件(event)的總?cè)影哑骄蟠蟾哂?.0×106個(gè)細(xì)胞/ml的樣品群體不算在內(nèi)。僅僅熒光素染色的群體區(qū)分編程性細(xì)胞死亡檢測，而使用二碘化丙錠的二重對染顯示壞死群體。
實(shí)施例13當(dāng)在照射前施用DE-TOPS時(shí)防止紫外線誘導(dǎo)的皮膚損傷的保護(hù)參考圖32，與沒有UVB曝露的正常小鼠皮膚相比，曝露UVB 11天導(dǎo)致顯著的皮膚加厚。組織病理學(xué)皮膚切片顯示DE-TOPS的局部施用顯著地減少了由UVB誘導(dǎo)的皮膚加厚。局部施用是在UVB照射前每日10分鐘。UVB劑量為在15分鐘的期間200mJ/cm2。UVB燈光譜分布為290-310nm 80％，低于310nm 20％。DE-TOPS配方為在石油基中100mM。參考圖31，以類似的方案，通過DE-TOPS急性抑制皮膚燒傷。參考圖33，飼養(yǎng)相同的小鼠4個(gè)月，通過DE-TOPS慢性抑制皮膚損傷。在該實(shí)例中在UVB照射前2小時(shí)施用DE-TOPS。
實(shí)施例14當(dāng)在照射后施用DE-TOPS時(shí)防止紫外線誘導(dǎo)的皮膚損傷的保護(hù)如實(shí)施例13使用相同的方案，除了在照射后15分鐘施用DE-TOPS。在圖34中顯示DE-TOPS的保護(hù)作用，在圖35中顯示組織病理學(xué)變化。
實(shí)施例15與Tempol比較的防止紫外線誘導(dǎo)的皮膚損傷的保護(hù)將與實(shí)施例13相同的方案用于本研究。當(dāng)在照射前10分鐘或2小時(shí)施用試驗(yàn)樣品時(shí)，與Tempol比較測試DE-TOPS在保護(hù)UVB誘導(dǎo)的皮膚損傷中的作用。圖36的結(jié)果顯示DE-TOPS提供比Tempol更長的治療窗(參見圖36B和C)。
實(shí)施例16BE-TOPS在Rhino小鼠中的防皺效果為了確定CGN相對于可商購的局部治療的優(yōu)勢，將BE-TOPS，Retin-A和空白對照劑施用到曝露于每隔日的UVB照射的小鼠皮膚上。與對照動物相比用Retin-A治療導(dǎo)致皮膚起皺的減少(參見圖37)。盡管Retin-A的光敏性導(dǎo)致背部皮膚的脫色和剝落，背部皮膚的皮膚組織切片還顯示Retin-A治療導(dǎo)致顯露的和深層的囊腫密度的減少。
BE-TOPS還優(yōu)于Retin-A的是DE-TOPS處理的皮膚不是UVB敏感的。
盡管根據(jù)其具體實(shí)施方案已經(jīng)描述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以不背離本發(fā)明的真實(shí)精神和本發(fā)明的范圍進(jìn)行各種變化和替代等價(jià)物。另外，可以進(jìn)行許多修改以將具體的情況，材料，物質(zhì)組成，方法，過程步驟或多個(gè)步驟適合于本發(fā)明的目的，精神和范圍。所有的這些修改都在此后附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式I的化合物 其中R1是硝基氧；其中R2和R3各自獨(dú)立地選自Na，K，氫，烷基，鏈烯基，?；?，芳烷基，烷芳基和硝基氧；并且其中“n”為0-18的整數(shù)。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R2和R3各自獨(dú)立地選自包含1-4個(gè)碳原子的烷基。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R2和R3各自獨(dú)立地選自乙基，叔丁基和氫，并且“n”是1-3的整數(shù)。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R2是氫，R3是乙基，并且“n”為1。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中R1是2，2，6，6，四甲基-4-哌啶-1-氧基。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中R2和R3都是乙基，“n”為1，并且R1是2，2，6，6，四甲基-4-哌啶-1-氧基。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中所述硝基氧選自在氮原子周圍具有至少一個(gè)不成對電子的直鏈，支鏈，環(huán)狀硝基氧。
8.結(jié)構(gòu)式II的化合物 其中R1是硝基氧；其中R2和R3各自獨(dú)立地選自Na，K，氫，烷基，鏈烯基，?；纪榛?，烷芳基和硝基氧；并且其中“n”為1-6的整數(shù)。
9.權(quán)利要求8的化合物，其中R2和R3各自獨(dú)立地選自包含1-4個(gè)碳原子的烷基。
10.權(quán)利要求8的化合物，其中R2和R3各自獨(dú)立地選自Na，K，乙基，叔丁基和氫，并且“n”為1-4的整數(shù)。
11.結(jié)構(gòu)式III的化合物 其中R1是硝基氧；其中R2和R3各自獨(dú)立地選自Na，K，氫，烷基，鏈烯基，?；纪榛?，烷芳基和硝基氧；并且其中“n”為1-6的整數(shù)。
12.權(quán)利要求12的化合物，其中R2和R3各自獨(dú)立地選自包含1-4個(gè)碳原子的烷基。
13.權(quán)利要求12的化合物，其中R2和R3各自獨(dú)立地選自乙基，叔丁基和氫，并且“n”為1-4的整數(shù)。
14.權(quán)利要求11的化合物，其中R3是乙基，“n”為1，并且與-OR2基團(tuán)連接的-NH-與銅三肽結(jié)合。
15.結(jié)構(gòu)IV的硝基氧化合物 其中R1和R2各自獨(dú)立地為烷基，并且環(huán)是包含碳原子的環(huán)狀部分。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中R1和R2各自為不同的1-12個(gè)碳原子的烷基，并且所述環(huán)為選自五元環(huán)和六元環(huán)的環(huán)狀部分。
17.權(quán)利要求15的化合物，其中R1和R2各自為相同的1-4個(gè)碳原子的烷基，并且所述環(huán)為六元環(huán)。
18.權(quán)利要求15的化合物，其中R1和R2各自為乙基。
19.權(quán)利要求15的化合物，其中R1和R2各自為叔丁基。
20.一種組合物，其包含藥用載體；和權(quán)利要求1的化合物。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述藥用載體選自凝膠，乳膏，軟膏，乳劑，霜劑，固體惰性粉末和鹽溶液。
22.權(quán)利要求20的組合物，其另外包含多硝?；宓鞍?。
23.權(quán)利要求20的組合物，其另外包含多硝酰基淀粉。
24.權(quán)利要求20的組合物，其另外包含非甾體抗炎藥。
25.權(quán)利要求20的組合物，其另外包含抗生素。
26.權(quán)利要求20的組合物，其另外包含銅三肽。
27.一種治療方法，其包含對哺乳動物細(xì)胞給藥治療有效量的用羧酸門控的硝基氧化合物；并且使硝基氧化合物調(diào)節(jié)氧化反應(yīng)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述硝基氧化合物是雙酯化的硝基氧化合物，并且另外其中兩個(gè)酯基團(tuán)在給藥后被去除，由此產(chǎn)生兩個(gè)羧酸基團(tuán)。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述硝基氧化合物存在于為施用于人的皮膚而配制的組合物中。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述硝基氧化合物存在于為注射到人中而配制的組合物中。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述硝基氧化合物存在于為口服給藥而配制的組合物中。
32.權(quán)利要求27的方法，其中所述硝基氧化合物存在于為眼部給藥而配制的組合物中。
33.權(quán)利要求27的方法，其中所述硝基氧化合物存在于為氣溶膠給藥而配制的組合物中。
34.權(quán)利要求27的方法，其中所述硝基氧化合物存在于為直腸給藥而配制的組合物中。
全文摘要
發(fā)現(xiàn)和作為組合物公開羧酸門控的硝基氧(CGN)化合物和它們的酯化衍生物，并且顯示治療多種由活性氧物質(zhì)(ROS)損傷導(dǎo)致的急性和慢性病和障礙的潛力。描述在適當(dāng)?shù)乃幬?，化妝品，和診斷配方中用于治療源于ROS損傷的組織損傷的包含CGN或其活性衍生物組合物。
文檔編號A61K31/445GK1553797SQ02817534
公開日2004年12月8日 申請日期2002年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月6日
發(fā)明者夏任長, 馬力 申請人:辛西姆技術(shù)有限公司