專利名稱：新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組融合蛋白及其DNA編碼序列，尤其涉及人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)和人單核細(xì)胞趨化激活因子(hMCAF)的融合蛋白及其DNA編碼序列。
hGM-CSF與hMCAF都具有提高人體免疫能力及殺傷某些腫瘤的作用，并且兩種因子都可通過(guò)激活單核細(xì)胞來(lái)殺傷腫瘤。目前，兩種因子已分別通過(guò)基因重組技術(shù)獲得了表達(dá)，而某種細(xì)胞因子單獨(dú)用于臨床治療，往往存在以下不足，即缺乏特異性、應(yīng)用劑量較大和易引起較大的毒副作用。由基因重組技術(shù)重組的hGM-CSF與hIL-3的融合蛋白存在著特異性不強(qiáng)的缺點(diǎn)(Curtis，B.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，885809)。
本發(fā)明的目的在于提供一種hGM-CSF與具有趨化作用的hMCAF的融合蛋白，該融合蛋白具有協(xié)同或增強(qiáng)的生物功能，且能特異趨化單核細(xì)胞到病灶部位，從而可能降低臨床治療的使用劑量，減小毒副作用。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下方案得以實(shí)現(xiàn)。
分別合成含有hGM-CSF及hMCAF的DNA片段，由于引物序列設(shè)計(jì)的不同，所以兩種因子的基因片段在進(jìn)行連接時(shí)，產(chǎn)生兩種排列順序的連接反應(yīng)物，其中一種連接反應(yīng)物的排列順序?yàn)閔GM-CSF/MCAF；另一種連接反應(yīng)物的排列順序?yàn)閔MCAF/GM-CSF。分別構(gòu)建含有hGM-CSF/MCAF連接反應(yīng)物或含有hMCAF/GM-CSF連接反應(yīng)物的表達(dá)載體，將兩種表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)到受體菌或受體細(xì)胞中，得到能夠表達(dá)目的基因的重組菌或重組細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)表達(dá)，可分別得到兩種排列順序的新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF，培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行表達(dá)水平測(cè)定、提取、純化、復(fù)性，所得到的純品分別進(jìn)行MCAF的趨化特異性、GM-CSF的生物活性的測(cè)定，并且進(jìn)行體內(nèi)外抗腫瘤試驗(yàn)。本發(fā)明涉及真核或原核系統(tǒng)表達(dá)的hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白及其DNA編碼序列、引物DNA序列、表達(dá)載體、受體細(xì)胞或受體菌，還涉及有關(guān)生產(chǎn)的方法。
本發(fā)明所提供的新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白具有協(xié)同或增強(qiáng)的生物功能，由于hMCAF的趨化作用，使該融合蛋白具有較強(qiáng)的特異性，為降低臨床治療的使用劑量、減小毒副作用打下了良好基礎(chǔ)。


圖1、圖2分別為PCR擴(kuò)增hGM-CSF基因的上游引物序列；圖3、圖4分別為PCR擴(kuò)增hGM-CSF基因的下游引物序列；圖5、圖6分別為PCR擴(kuò)增hMCAF基因的上游引物序列；圖7、圖8分別為PCR擴(kuò)增hMCAF基因的下游引物序列；圖9為融合蛋白hGM-CSF/MCAF的DNA編碼序列圖10為融合蛋白hMCAF/GM-CSF的DNA編碼序列；hGM-CSF/MCAF融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建利用PCR技術(shù)擴(kuò)增hGM-CSF基因的上游引物序列(圖1)及下游引物序列(圖3)分別含有EcoRI及XbaI位點(diǎn)。提取質(zhì)粒pCD-hGM-CSF(Lee，F(xiàn).et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，824360)，并以其為模板，以上述合成的上、下游引物序列為引物，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)約400bp的含hGM-CSF基因的DNA片段。同樣利用PCR技術(shù)擴(kuò)增hMCAF的上游引物序列(圖5)以及下游引物序列(圖7)分別含有XbaI及BamHI位點(diǎn)，下游引物序列還含有雙串聯(lián)終止密碼子。提取質(zhì)粒pMCOl(葉棋濃等，中華微生物學(xué)與免疫學(xué)雜志，1994，1429)，并以其為模板，以上述合成的兩引物序列為引物，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)約250bp的含MCAF基因的DNA片段。電泳回收上述PCR合成的hGM-CSF及hMCAF基因的DNA片段(Sambrook、J.et al，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，含hGM-CSF基因的DNA片段以EcoRI和XbaI進(jìn)行酶切，含hMCAF基因的DNA片段以XbaI和BamHI酶切，選擇質(zhì)粒載體pBV220(張智清等，病毒學(xué)報(bào)，1990，6111)，并以EcoRI和BamHI酶切，將酶切后的含hGM-CSF和hMCAF基因的DNA片段及酶切后的pBV220進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。轉(zhuǎn)化子經(jīng)用hGM-CSF基因和hMCAF基因作探針進(jìn)行菌落原位雜位篩選、DNA酶切鑒定后得到欲表達(dá)hGM-CSF/MCAF的重組質(zhì)粒，命名為pGM。以雙鏈重組質(zhì)粒pGM為模板，按PharmaciaT7 Sequencing kit說(shuō)明書(shū)測(cè)定hGM-CSF/MCAF的編碼序列(圖9)，其中hGM-CSF編碼序列與hMCAF編碼序列間的接頭序列為GGTGGTTCTAGA。
hMCAF/GM-CSF融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建利用PCR技術(shù)擴(kuò)增hGM-CSF基因的上游引物序列(圖2)及下游引物序列(圖4)分別含有XbaI及BamHI酶切位點(diǎn)。提取質(zhì)粒pCD-hGM-CSF，并以其為模板，以上述合成的上、下游引物序列為引物，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)約400bp的含hGM-CSF基因的DNA片段。同樣利用PCR技術(shù)擴(kuò)增hMCAF基因的上游引物序列(圖6)及下游引物序列(圖8)分別含有EcoRI及XbaI酶切位點(diǎn)，提取質(zhì)粒pMC01，并以其為模板，以上述合成的上、下游引物序列為引物，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)約250bp的含hMCAF基因的DNA片段。電泳回收上述PCR合成的hGM-CSF及hMCAF基因的DNA片段，含hGM-CSF基因的DNA片段以XbaI和BamHI進(jìn)行酶切，含hMCAF基因的DNA片段以EcoRI和XbaI進(jìn)行酶切，選擇質(zhì)粒載體pBV220，并以EcoRI和BamHI酶切。將酶切后的含hGM-CSF及hMCAF基因的DNA片段和經(jīng)酶切的pBV220進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，轉(zhuǎn)化子經(jīng)用hGM-CSF基因和hMCAF基因作探針進(jìn)行菌落原位雜位篩選、DNA酶切鑒定后得到欲表達(dá)hMCAF/GM-CSF的重組質(zhì)粒，命名為pMG。以雙鏈重組質(zhì)粒pMG為模板，按Pharmacia T7 Sequencing kit說(shuō)明書(shū)測(cè)定hMCAF/GM-CSF的編碼序列(圖10)，其中hMCAF編碼序列與hGM-CSF編碼序列間的接頭序列為GGTGGTTCTAGA。
表達(dá)hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的菌株的構(gòu)建將E.coli DH5α培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，冰浴10min，離心后將細(xì)胞重懸在原初培養(yǎng)物體積一半的預(yù)冷的50mM CaCl2和10mM Tris·Cl溶液中，冰浴15min后離心，將細(xì)胞重懸在1/15原初體積的預(yù)冷的50mM CaCl2和10mM Tris·Cl溶液中，按0.2ml一份分裝在預(yù)冷的小管中，作為感受態(tài)細(xì)胞，向上述小管中加入重組質(zhì)粒pGM或pMG，冰浴30min，轉(zhuǎn)移到預(yù)熱至42℃的水浴中2min，然后加1.0ml LB培養(yǎng)基，在30℃保溫30℃min，取上述細(xì)胞涂布在瓊脂培養(yǎng)板上，30℃過(guò)夜培養(yǎng)即產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子即為能表達(dá)hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的重組菌株。
新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF在受體菌中的培養(yǎng)表達(dá)。
將含有pGM的重組菌或含pMG的重組菌分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)方法及條件如下重組菌于30℃振蕩培養(yǎng)繁殖，于42℃誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集菌體，用1XSDS樣品緩沖液懸浮(Sambrook，J.et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，煮沸5min，離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明含有pGM的重組菌表達(dá)出分子量約為26kD的hGM-CSF/MCAF融合蛋白，含有pMG的重組菌表達(dá)出分子量約為26kD的hMCAF/GM-CSF融合蛋白。經(jīng)薄層掃描分析，hGM-CSF/MCAF及hMCAF/GM-CSF的表達(dá)水平分別為33.4％和15.6％。
新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF的分離純化。
hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF在大腸桿菌中以包涵體形式存在，經(jīng)培養(yǎng)表達(dá)的重組菌離心收集后，超聲破碎，沉淀即為包涵體，用含2mol/L尿素的50mmol/L Tris·Cl、1mmol/L EDTA溶液洗滌，離心取沉淀，沉淀用6mol/L鹽酸胍、20mmol/L Tris·Cl、1mmol/LEDTA、5mmol/L DTT的溶液溶解，用20mmol/L Tris·Cl、lmmol/L EDTA、2mmol/L GSH、0.2mmol/L GSSG透析復(fù)性。透析產(chǎn)物上樣到用20mmol/L Tris·HCl、1mmol/L EDTA平衡的SephadexG-75層析柱(2×60cm)中，上樣后用上述溶液洗脫，流速為12ml/h，收集所需組分，用20mmol/L NaAc、1mmol/L EDTA透析后，上樣到CM-Sepharose FF層析柱(1.5×20)中，用含0-0.5mol/L NaCl的起始緩沖液樣度洗脫，hGM-CSF/MCAF約在0.18mol/L NaCl時(shí)被洗脫。
純化后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明純度達(dá)到電泳純。
hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的Western blot鑒定。
純化的hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF進(jìn)行SDS-PAGE后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用3％BSA封閉1h，再與GM-CSF抗體或MCAF抗體反應(yīng)1-2h，與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG反應(yīng)1h，用DAB顯色。結(jié)果表明，純化的hGM-CSF/MCAF和hMCAF/GM-CSF既能與GM-CSF抗體又能與MCAF抗體發(fā)生特異反應(yīng)。
hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的生物學(xué)活性測(cè)定采用以下方法分別測(cè)定hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的生物學(xué)活性，選用hGM-CSF依賴的細(xì)胞株TF1，以MTT染料摻入法測(cè)定GM-CSF活性。(Kitamura T et al.，J.Cell physiol.，1989，140323)。調(diào)整傳代培養(yǎng)的TF1細(xì)胞濃度為2×105/ml，取100μl加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，再加入按一定比例稀釋的樣品，置37℃ 5％CO2孵箱中培養(yǎng)48h后，每孔加20μl MTT(5mg/ml)染料，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入100μl裂解液(20％SDS，50％二甲基甲酰胺)，37℃過(guò)夜，在酶聯(lián)儀上測(cè)定OD490值，經(jīng)過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比較，測(cè)得純化的hGM-CSF/MCAF及hMCAF/GM-CSF融合蛋白的比活性約為1.8×107u/mg。
純化的hGM-CSF/MCAF及hMCAF/GM-CSF的MCAF單核細(xì)胞趨化活性采用瓊脂糖平板法進(jìn)行測(cè)定(Nelson，R.D.et al.，J.Immunol.，1975，1151650)，人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離按楊景山等的方法進(jìn)行(楊景山等，醫(yī)學(xué)細(xì)胞化學(xué)與細(xì)胞生物技術(shù)，1989，6)。取1.8％瓊脂糖與等體積的含小牛血清的2×RPMI 1640培養(yǎng)基混勻，澆注于滅菌平皿內(nèi)的載玻片上，凝固后用孔徑為2mm的打孔器打孔，每列分上、中、下三孔，取10μl單個(gè)核細(xì)胞懸液(含1×106細(xì)胞)加入中孔，上孔加10μl按一定比例稀釋的樣品，下孔加10μl RPMI 1640，在CO2孵箱中溫育12-14h，用甲醇固定30min，細(xì)心剝除瓊脂糖凝膠，Giemsa染色鏡檢，測(cè)得hGM-CSF/MCAF及hMCAF/GM-CSF融合蛋白表現(xiàn)出趨化活性的最小濃度為40ng/ml。
以上結(jié)果說(shuō)明，hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF中GM-CSF和MCAF的功能不但相容，而且都具有較高的生物學(xué)活性。
hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF融合蛋白的體內(nèi)外抗腫瘤試驗(yàn)取傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，取100μl加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，再加入按一定比例稀釋的樣品，培養(yǎng)板于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)3天，觀察純化的hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF分別對(duì)人早幼粒細(xì)胞白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、黑色素瘤Bowes和胃癌Kato3細(xì)胞株的直接毒性，結(jié)果表明，在濃度為0.002-20ng/ml范圍內(nèi)，hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF不能直接殺傷上述這些腫瘤細(xì)胞。鑒于此，我們又測(cè)定了hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF介導(dǎo)單核細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力(Matsushima，K.et al.，J.Exp.Med，1989，1691485)。從人外周血白細(xì)胞懸液分離單個(gè)核細(xì)胞后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3-5×106/ml，取100μl加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5％CO2中培養(yǎng)1h，洗去非貼壁細(xì)胞，換用新鮮培養(yǎng)基，用按一定比例稀釋的樣品刺激單核細(xì)胞12h后，加入腫瘤細(xì)胞100μl，于37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)(0.002-2ng/ml)，hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF能介導(dǎo)單核細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，且殺傷率隨濃度的增加而增加。hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF對(duì)HL-60、A549的殺傷率比單用相同劑量的GM-CSF、MCAF或聯(lián)合使用GM-CSF和MCAF具有更大的殺傷率(p＜0.01)。hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF對(duì)SMMC-7721，Bowes有一定殺傷率，但沒(méi)有表現(xiàn)出上述增強(qiáng)功能，另外，它對(duì)Kato3似乎沒(méi)有殺傷效應(yīng)。
上述結(jié)果表明，hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF中GM-CSF和MCAF具有協(xié)同或增強(qiáng)功能，激活單核細(xì)胞后可選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。
以裸鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，我們研究了hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。裸鼠背部皮下注射1×106的肺癌細(xì)胞A549，4天后實(shí)驗(yàn)組在注射腫瘤細(xì)胞周圍分別注射1μg和0.1μg純化的hGM-CSF/MCAF或hMCAF/hGM-CSF，每天一次，連續(xù)5天，對(duì)照組為注射生理鹽水，結(jié)果表明(兩只動(dòng)物的結(jié)果)，對(duì)照組兩只均長(zhǎng)出較大腫瘤，1μg的實(shí)驗(yàn)組二只未長(zhǎng)出腫瘤，0.1μg的實(shí)驗(yàn)組兩只均長(zhǎng)出較小腫瘤，由此可以看出，hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF在體內(nèi)也有一定程度的抗腫瘤作用，提示hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF有較大的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種用于表達(dá)新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的DNA序列，其特征在于所述融合蛋白的DNA序列同時(shí)含有人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和人單核細(xì)胞趨化激活因子的基因序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于表達(dá)新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的DNA序列，其特征在于所述融合蛋白的DNA序列如圖9或圖10所示。
3.一種DNA序列，其特征在于該DNA序列與權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的用于表達(dá)新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的DNA序列互補(bǔ)。
4.一種用于合成人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的上游引物DNA序列，其特征在于該上游引物序列具有如下DNA序列(如圖1或圖2所示)。
5.一種用于合成人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的下游引物DNA序列，其特征在于該下游引物序列具有如下DNA序列(如圖3或圖4所示)。
6.一種用于合成人單核細(xì)胞趨化激活因子的上游引物DNA序列，其特征在于該上游引物DNA序列具有如下DNA序列(如圖5或圖6所示)。
7.一種用于合成人單核細(xì)胞趨化激活因子的下游引物DNA序列，其特征在于該下游引物DNA序列具有如下DNA序列(如圖7或圖8所示)。
8.一種表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體含有如權(quán)利要求1所述的用于表達(dá)新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的DNA序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體含有如權(quán)利要求2所述的用于表達(dá)新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的DNA序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體含有質(zhì)粒載體pBV220。
11.一種轉(zhuǎn)化菌，其特征在于該轉(zhuǎn)化菌含有如權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化菌，其特征在于該轉(zhuǎn)化菌含有如權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化菌，其特征在于該轉(zhuǎn)化菌含有如權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化菌，其特征在于該轉(zhuǎn)化菌由E.coli DH5α構(gòu)建而成。
15.一種生產(chǎn)新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的方法，其特征在于該方法包括如權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體的構(gòu)建、權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化菌的構(gòu)建、培養(yǎng)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的提純、復(fù)性及生物活性的測(cè)定。
16.一種新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于該融合蛋白是按照權(quán)利要求15所述的生產(chǎn)新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的方法得到的目的基因產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白及其DNA編碼序列。該融合蛋白為人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)與人單核細(xì)胞趨化激活因子(hMCAF)的融合蛋白，其中包括兩種排列順序的融合蛋白，即為hGM-CSF/MCAF或hMCAF/GM-CSF。研究結(jié)果表明，本發(fā)明所涉及的融合蛋白的生物活性較高，具有協(xié)同或增強(qiáng)的生物功能，并且由于單核細(xì)胞趨化激活因子的趨化作用，提高了對(duì)人單核細(xì)胞發(fā)揮功能的特異性，這為將來(lái)減小臨床用藥劑量，減輕毒副作用打下了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1144845SQ95101538
公開(kāi)日1997年3月12日 申請(qǐng)日期1995年3月1日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月1日
發(fā)明者葉棋濃, 蘇國(guó)富, 黃翠芬 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所