專利名稱：粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子作為疫苗佐劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)，特別是人GM-CSF作為疫苗佐劑的用途。
自動(dòng)免疫接種是對(duì)動(dòng)物使用抗原以便在該動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答?？刮⑸锏囊呙缡且环N抗原制劑，將其接種到非免疫個(gè)體會(huì)產(chǎn)生對(duì)微生物的自動(dòng)免疫但不會(huì)致病。特異性和記憶力這兩個(gè)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵因素在接種中被利用，因?yàn)檫m應(yīng)性免疫系統(tǒng)對(duì)第二次接觸到的抗原有更強(qiáng)的應(yīng)答。該第二次免疫應(yīng)答較第一次應(yīng)答出現(xiàn)得更快并更有效。研制疫苗的原則是用使一種微生物或其毒素(天然抗原)變成無害的但不喪失抗原性的方法改變它們。另外，可通過重組方法或合成化學(xué)產(chǎn)生所說微生物的抗原多肽來制得有效的疫苗。
自動(dòng)免疫接種中經(jīng)常遇到的一個(gè)問題是在疫苗中使用的抗原沒有足夠的免疫原性，不能將抗體滴度提高到足夠高的水平以提供針對(duì)后續(xù)激發(fā)的保護(hù)作用，或者不能在整個(gè)持續(xù)的期間內(nèi)維持提高抗體水平的能力。另一個(gè)問題是所用疫苗可能不足以誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(它是抗細(xì)菌和病毒感染的初次免疫防御)。還有一個(gè)問題是個(gè)別病人可能是免疫抑制的。
為了獲得較強(qiáng)的體液和/或細(xì)胞應(yīng)答，疫苗通常以一種含有佐劑的制劑形式給藥。佐劑是非特異性地提高對(duì)抗原的應(yīng)答或者引起在沒有佐劑時(shí)對(duì)抗原無應(yīng)答的個(gè)體對(duì)抗原應(yīng)答的物質(zhì)。佐劑通常與抗原一起給藥，但也可以在抗原給藥之前或之后給藥。對(duì)哺乳動(dòng)物接種合適的佐劑包括但不限于佐劑65(含有花生油、二縮甘露醇單油酸酯和單硬脂酸鋁);福氏完全或不完全佐劑;礦物膠例如氫氧化鋁、磷酸鋁和礬;表面活性劑例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、二甲基雙十八烷基-溴化胺、N，N-雙十八烷基-N′，N′-雙(2-羥甲基)丙烯二胺、甲氧基十六烷基甘油和普盧蘭尼克多元醇(pluronicpolyols);聚陰離子例如吡喃、葡聚糖硫酸鹽、polyIC、聚丙烯酸和carbopol;肽類例如胞壁?；?、二甲基甘氨酸和tuftsin;和油乳狀液。抗原也可以摻入到脂質(zhì)體或其它微載體中給藥。
粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)被驚奇地發(fā)現(xiàn)是一種有效的疫苗佐劑。
因而，本發(fā)明提供了一種提高哺乳動(dòng)物對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予需要接種的哺乳動(dòng)物有效量的GM-CSF以及疫苗。
較好的是，被治療的哺乳動(dòng)物是人，所使用的GM-CSF是人的異型的一種。GM-CSF較好是在疫苗給藥之前或之后1-14天以每公斤體重約0.1-100微克(μg)的量給藥。
本發(fā)明還提供了含有有效量的GM-CSF，天然的、合成的或重組的抗原，和適于藥用的載體的藥用組合物。
本發(fā)明也要求了一種增強(qiáng)哺乳動(dòng)物對(duì)疫苗中抗原的致免疫應(yīng)答的試劑盒，該試劑盒包括具有其中含有GM-CSF的藥用組合物的第一容器，和具有其中含有疫苗的藥用組合物的第二容器。
本申請(qǐng)引用參考資料的技術(shù)內(nèi)容就其整體一并引入本文作為參考。
按照本發(fā)明，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中，尤其是在人中對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答可有效地被使用有效量的GM-CSF以及疫苗來提高。本文使用的“以及”一詞是指GM-CSF的給藥是與疫苗的給藥同時(shí)，或在其之前或之后。
本文使用的“GM-CSF”是指一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)(a)具有與Lee等人在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82∶4360(1985)中描述的成熟(即缺乏信號(hào)肽)人GM-CSF基本相同的氨基酸序列和(b)具有與天然GM-CSF相同的生物學(xué)活性。
氨基酸序列基本相同是指序列相同或由一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變(缺失、增加、取代)引起的不同，但這種改變基本上不降低生物學(xué)活性。在人的GM-CSFs中，核苷酸序列和氨基酸異質(zhì)性已被觀察到。例如，就氨基酸序列的N-未端位置來說，蘇氨酸和異亮氨酸兩者都在人GM-CSF的100位被觀察到。Schrims等人[Bioehem.J247∶195(1987)]也公開了一種人GM-CSF變異體，其中在80位的甲硫氨酸殘基被異亮氯酸殘基取代。其它種系例如小鼠、長(zhǎng)臂猿(其中僅含有3個(gè)甲硫氨酸)和鼠的GM-CSF也為該發(fā)明所關(guān)注。如本領(lǐng)域所公知，由原核生物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組GM-CSFs也可以含有一個(gè)額外的N-末端甲酰氨酸殘基。任何符合基本相同要求的GM-CSF均包括在本發(fā)明內(nèi)，無論它是糖基化的(即源于天然的或源于真核生物表達(dá)系統(tǒng)的)或是非糖基化的(即源于原核生物表達(dá)系統(tǒng)或化學(xué)合成的)。
用于本發(fā)明的GM-CSF可從天然來源獲得(美國專利No.4，438，032;Gasson等，同上;Burgess同上;Sparrow等，同上;Wu等，同上)。具有與天然產(chǎn)生的GM-CSF基本相同氨基酸序列和活性的GM-CSF可以用于本發(fā)明，編碼GM-CSF的互補(bǔ)DNA(cDNAs)已被許多實(shí)驗(yàn)室克隆和測(cè)序，例如Gough等，Nature，309∶763(1984)(小鼠);Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.usA82∶4360(1985)(人);Wong等，Science，228∶810(1985)(人和長(zhǎng)臂猿);Cantrell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82∶6250(1985)(人)Gough等，Nature，309∶763(1984)(小鼠);Wong等，Science，228∶810(1985)(人和長(zhǎng)臂猿);Cantrell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82∶6250(1985)(人)。
GM-CSF也可購自Immunex，Inc.ofSeattle，Washington、Schering-PloughCorporatinofKenilworth，NewJersey和GenzymeCorporationofBoston，MA.
佐劑活性由用在原本對(duì)疫苗根本不產(chǎn)生應(yīng)答的個(gè)體中產(chǎn)生了免疫應(yīng)答而使免疫-介導(dǎo)的保護(hù)作用的明顯增強(qiáng)來證明，體液免疫增強(qiáng)的典型證明是針對(duì)抗原產(chǎn)生的抗體的滴度明顯增加。
本發(fā)明提供GM-CSF以及疫苗給藥的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)待給疫苗中的總抗原量可被減少，因?yàn)樵贕M-CSF存在下較少的抗原可誘發(fā)至少與疫苗正常量給藥所達(dá)到的水平相當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。因?yàn)榘凑毡景l(fā)明給予GM-CSF每次接種需要較少的抗原，所以出現(xiàn)與現(xiàn)行所用的某些疫苗相關(guān)的不期望的副作用的可能性會(huì)減小。
對(duì)接種幾乎無應(yīng)答個(gè)體的某種類型的免疫應(yīng)答會(huì)被GM-CSF連同疫苗給藥所增強(qiáng)。將從本發(fā)明的方法受益的個(gè)體類別包括(1)具有削弱的免疫應(yīng)答性的那些類別，(2)一般表現(xiàn)正常但對(duì)某些疫苗無應(yīng)答的那些個(gè)體以及(3)正接受免疫抑制治療例如放療的個(gè)體。
因此，我們發(fā)現(xiàn)了有關(guān)以下內(nèi)容的有效方法(1)提高在哺乳動(dòng)物中提高對(duì)存在于疫苗中抗原的有效的第一次免疫應(yīng)答，(2)在哺乳動(dòng)物中提高接觸疫苗中抗原的抗體的有效水平，和(3)在哺乳動(dòng)物中提高對(duì)存在于疫苗中抗原的第一次免疫應(yīng)答，其中所說哺乳動(dòng)物在不給予GM-CSF時(shí)的免疫應(yīng)答不會(huì)足夠強(qiáng)或足夠快地預(yù)防疾病。
按照本發(fā)明，所研究使用的疫苗包括但不限于用于自動(dòng)免疫接種的細(xì)菌疫苗、類毒素疫苗(滅活的毒素)和病毒疫苗或其混合物。參見例如在Remington′sPharmaceuticalSciences14thEdition1990MackPublishingCo.P1426-1441中的題為“ImmunizingAgents”的第75章、由U.S.FoodandDrugAdministration認(rèn)可的并列入Physician′sDeskReference46thEd.1992P208-209表(產(chǎn)品分類素行)中的抗毒素、類毒素、疫苗和活疫苗。合適的細(xì)菌疫苗包括抗下列病種或病態(tài)的細(xì)菌疫苗霍亂、百日咳、鼠疫、猩紅熱、腦膜炎、肺炎球菌肺炎、β型流感桿菌、麻風(fēng)、淋病、β組腦膜炎雙球菌、β型鏈球菌、革蘭氏陰性膿毒血癥、大腸肝菌膿毒血癥、銅綠色極毛桿菌。合適的類毒素包括白喉毒素、肉毒毒素和破傷風(fēng)毒素。合適的病毒疫苗包括抗下列病種或病態(tài)的活的或滅活的病毒疫苗脊髓灰質(zhì)炎、麻疹風(fēng)疹、黃熱病、流型性腮腺炎、乙型肝炎、丙型肝炎和病毒性感冒。
合適的“復(fù)合抗原”包括白喉和破傷風(fēng)類毒素和白喉、百日咳和破傷風(fēng)類毒素三聯(lián)抗原，后者可從ConnaughtLaboratories，Inc.Swifevater，PA18370獲得。在不同國家使用的許多種類的病毒株和細(xì)胞底物以及各種免疫接種計(jì)劃在White，D.O.和FennerF.，MedicalVirologg3rdEdition(Acabemic1986)中被公開。
此外，GM-CSF將被典型地用于提高被認(rèn)為是“弱”的動(dòng)物或人的疫苗(即在程度上，廣度上和/或期限上提供弱的保護(hù))所具有的保護(hù)作用。這類疫苗的例子是菌苗例如搏代桿菌屬菌苗、大腸桿菌菌苗、嗜血桿菌屬菌苗、鉤端螺旋體病疫苗、牛摩氏桿菌菌苗、巴斯德菌菌苗和胎弧菌菌苗、肺炎球菌疫苗和減互活或殺滅病毒產(chǎn)品或重組抗原病毒產(chǎn)品例如乙型肝炎、A和B型流感、牛呼吸病疫苗、傳染性牛鼻氣管炎、副流感-3、呼吸合胞體病毒、牛病毒腹瀉疫苗、馬流感疫苗、貓白血病疫苗、貓呼吸病疫苗、rhinotracheitiscalicipneumonitis病毒、犬Parovovirus疫苗、傳染性胃腸炎疫苗、假性狂犬病疫苗和狂犬病疫苗。
本文使用的涉及按照本發(fā)明被給予的GM-CSF有效量的“有效量”一詞指引起抗體水平增加的GM-CSF的量，該抗體水平足夠提供比給予無GM-CSF的疫苗對(duì)傳染性因子更強(qiáng)的保護(hù)作用。然而，應(yīng)注意到抗體水平的明顯增加可以是相對(duì)小的。被給予的GM-CSF的有效量為每公斤體重0.1-500μgGM-CSF，給予的有效量更優(yōu)選的是每公斤體重1-100μg，最優(yōu)選的是每公斤體重5-50μg。
給藥量，頻度和用藥期依諸因素而變，這些因素例如特異性抗體滴度水平、被誘導(dǎo)的抗體類別、疫苗的類型以及病人的年齡和一般生理狀況。GM-CSF可在疫苗給藥之前或同時(shí)或在之后給藥。優(yōu)選的是一劑GM-CSF在疫苗給藥前1-14天給予病人。最好的是GM-CSF在疫苗給藥之前或之后約24小時(shí)給藥。
盡管GM-CSF可以是與疫苗一同給藥，但它通常是與疫苗分別給藥。當(dāng)GM-CSF與疫苗一同給藥時(shí)，所給予的組合物包含一種免疫原、一種適于藥用的載體和一種免疫有效量的GM-CSF，所說免疫原能有效激發(fā)對(duì)給定病原體或抗原體或抗原的特異應(yīng)答。GM-CSF的給藥可以是皮下的、靜脈內(nèi)的、非腸道的、肌內(nèi)的或其它可接受的方式。較好的是GM-CSF在疫苗給藥之前給藥并且在相同的給藥部位給予疫苗。上述劑型所期望的配方和藥用組合物可以習(xí)用的適于藥用物賦形劑和添加劑，采用常規(guī)技術(shù)制備。其它佐劑可與疫苗或與GM-CSF一起施用。
如果多劑疫苗在一定時(shí)期內(nèi)給藥，則附加的GM-CSF可與每劑后續(xù)的疫苗一同給藥。與后續(xù)各劑疫苗一同給藥的GM-CSF的量可以是多于或相同或少于與首劑疫苗一同給藥的GM-CSF的量。與后續(xù)各劑疫苗一同給藥的GM-CSF的量取決于第一劑疫苗使用后病人的抗體應(yīng)答情況。
待施用的GM-CSF溶液可由凍干粉末重新制備，它們還可含有防腐劑、緩沖劑、分散劑等。較好的是GM-CSF可用任何常用于皮下注射液的等滲介質(zhì)例如無防腐劑的無菌水制備。
可使用GM-CSF的持續(xù)釋放制劑，該制劑使藥物產(chǎn)生較長(zhǎng)的血清半衰期。這種配方的例子如下配方1成分凍干GM-CSF10-1000mcg乙酸鋅4.0mg硫酸魚精蛋白2.5mg氫氧化鈉0.6mg注射用水q.s.1ml
為了按配方1制備GM-CSF的持續(xù)釋放制劑，凍干的GM-CSF溶解在部分注射用水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.2，加入硫酸魚精蛋白，攪拌混合物，然后加入乙酸鋅，再次攪拌混合物。所得溶液用剩下的注射用水加至終體積。較好的是氫氧化鈉、硫酸魚精蛋白和乙酸鋅以濃縮的水溶液加入(例如，對(duì)魚精蛋白而言，可用100微升25mg/ml的水溶液)。
配方2成分凍干GM-CSF10-1000mcg為重新制備的注射用水0.2ml硫代琥珀酸鈉二辛基酯1mg乳化用花生油2ml凝膠用花生油2ml-硬酯酸鋁50mg為根據(jù)配方2制備GM-CSF制劑，-硬酯酸鋁與凝膠用花生油混合，并按公知的方法加熱至形成凝膠。
硫代琥珀酸二辛基酯溶解在注射用水中，凍干GM-CSF用硫代琥珀酸二辛基酯溶液重新溶解，所形成的溶液轉(zhuǎn)移到乳化用花生油中并用渦流法混合。所形成的乳化劑混合到前面制備的凝膠化花生油中并用渦流法混合。
配方3成分凍干GM-CSF10-1000mcg乙酸銅0.2mg磷酸鈉，二堿價(jià)的2.27mg磷酸鈉，一堿價(jià)的0.55mg氫氧化鈉0.6mg注射用水q.s.1ml為根據(jù)配方3制備GM-CSF的持續(xù)釋放制劑，一堿價(jià)的和二堿價(jià)的磷酸鈉溶解在部分注射用水中，凍干GM-CSF溶解在該溶液中，并用氫氧化鈉調(diào)pH至7.8。然后加入乙酸銅并攪拌溶液。用剩下的注射用水將溶液加至終體積。較好的是，氫氧化鈉和乙酸銅以濃縮的水溶液形式加入(例如，對(duì)乙酸銅而言，可以是100微升2mg/ml的水溶液)。
其它的持續(xù)釋放配方GM-CSF的其它持續(xù)釋放配方用使用由聚合物制備的GM-CSF微包囊或微球體制備，所說的聚合物例如聚酐類、polyphosphazenes、膠原蛋白、藻酸鹽、聚異丁烯酸(鹽或酯)、明膠、聚羥基丁酸(鹽或酯)、聚已內(nèi)酯、乙烯乙酸乙烯或聚交酯乙交酯。
持續(xù)釋放的GM-CSF也可以使用聚乙烯甘醇、葡聚糖聚氨基酸和其它類似聚合物制備成GM-CSF的化學(xué)軛合物。
GM-CSF在提高對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答方面的作用由下列非限制性人的臨床數(shù)據(jù)說明，這些并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明公開范圍的限制。
實(shí)施例1重組人GM-CSF表現(xiàn)出在對(duì)乙肝疫苗無應(yīng)答的透析病人中增強(qiáng)重組乙肝疫苗效率。
本實(shí)驗(yàn)的目的是確定GM-CSF與肝類疫苗聯(lián)合用藥是否能使先前對(duì)肝炎疫苗無應(yīng)答的腎衰竭病人恢復(fù)免疫應(yīng)答力。
對(duì)至少三次嘗試用乙肝疫苗接種面無應(yīng)答[由其抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗體滴度確定]的15個(gè)透析病人用GM-CSF處理。6個(gè)病人按每公斤病人體重皮下注射0.5微克(μg)GM-CSF(由Sehering-Plough Kenilworth，New Jersey，USA的大腸肝菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生)，5個(gè)病人以每公斤病人體重5μg GM-CSF，4個(gè)病人以每公斤病人體重10μg GM-CSF，標(biāo)記好注射部位。GM-CSF給藥24小時(shí)后，每個(gè)病人在相同的部位注射給予40μg乙肝疫苗HBVax
(Merck，Sharpe and Dohme，Gmbh，Darmstadt，F(xiàn)ederal Republie of Germany)。疫苗給藥4周后，從病人體內(nèi)抽取血樣，該血樣用于試驗(yàn)是否有抗乙肝抗體存在。結(jié)果示于下表中。
表1GM-CSF劑量抗HBsAg抗體滴度(μg/kgwt.) 單位*/升0.500.500.500.500.500.57105.005.0355.01255.09205.0260010.0010.0010.044010.07240＊一單位被定義為在標(biāo)準(zhǔn)ELESA中產(chǎn)生半數(shù)最大應(yīng)答的血清稀釋度的倒數(shù)。
從上面的數(shù)據(jù)可以看出，GM-CSF與乙肝疫苗協(xié)同使用是一種有效的佐劑。
實(shí)施例2重組人GM-CSF表現(xiàn)出在年老病人中提高病毒性流感疫苗效率。
在大流行病(流感A)和流行病(流感A和B)期間存在的人流感病毒能明顯引起年老者(不僅那些患慢性病者，而且那些貌似健康者)過高的發(fā)病率和死亡率。因?yàn)榱鞲幸呙缫扬@示出在減少發(fā)病率和死亡率兩方面所提供的益處，所以流感疫苗被極力推薦用于很有可能發(fā)生流感相關(guān)病發(fā)癥者，實(shí)際的情況是接種高危險(xiǎn)者的努力每年都在擴(kuò)大。
然而，盡管擴(kuò)大了免疫計(jì)劃，流感仍然是年老人發(fā)病和死亡的一個(gè)主要原因。幾種方法，例如使用兩到三倍標(biāo)準(zhǔn)疫苗劑量或者在第一次標(biāo)準(zhǔn)劑量后一個(gè)月再給予加強(qiáng)劑量均未顯示出在年老人中改善了對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。
因此，進(jìn)行了雙盲的、安慰劑對(duì)照的、累積劑量研究，以確定對(duì)流感疫苗的免疫應(yīng)答是否能被使用重組GM-CSF增強(qiáng)。試驗(yàn)了五種不同劑量的重組GM-CSF(由Schering-Plough，Kenilworth，NewJersey，USA的一種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生)，即0.25、0.5、1、2.5和5μg/Kg與安慰劑比較。六十個(gè)健康受試者參與試驗(yàn)，在他們的一只臂上肌內(nèi)注射法國1992-1993三價(jià)流感疫苗(A/Singapore/6/86[HLNL]，A/Beijing/353189[H3N2]和B/Yamagata/16/88)(Pasteur疫苗，Marnes-la-Coquette，F(xiàn)rance)之前于另一只臂上皮下注射重組GM-CSF或安慰劑。接種當(dāng)時(shí)及1、3和6周后測(cè)定了抗三個(gè)流感病毒性的特異性血凝素-抑制(HAI)抗體滴度。接受安慰劑和流感疫苗的15個(gè)病人中無一個(gè)表現(xiàn)出對(duì)流感疫苗的三個(gè)株的同時(shí)的血清轉(zhuǎn)化作用，而接受2.5和5μm/Kg重組GM-CSF的9個(gè)病人中的5個(gè)(56%)和3個(gè)(33%)對(duì)所有三個(gè)株有血清轉(zhuǎn)化作用。
所使用的技術(shù)方案更詳細(xì)描述如下材料和方法受試對(duì)象的選擇受試者為65歲以上的男女性健康年老者。自愿者由病史和試驗(yàn)室試驗(yàn)(包括全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、生物化學(xué)檢驗(yàn)、尿分析和血清學(xué)檢驗(yàn))篩選。受試者對(duì)1992-1993法國流感疫苗中的A-HLNL和B流感株必須具有≤1∶80的基線血凝素-抑制抗體滴度。具有嚴(yán)重的或反復(fù)發(fā)作慢性病或惡性腫瘤、服用抗腫瘤藥或免疫抑制藥、實(shí)驗(yàn)室篩選實(shí)驗(yàn)中結(jié)果明顯異常、對(duì)雞蛋過敏、在過去6個(gè)月中具有流感樣疾病病史或采樣期間患急性病的患者排除在實(shí)驗(yàn)之外。
研究方案研究設(shè)計(jì)為雙肓的、安慰劑對(duì)照的、尋找最佳劑量研究。
給藥和接種60個(gè)參予實(shí)驗(yàn)的受試者被分成每組12個(gè)人的5個(gè)劑量組。每組分別接受0.25、0.5、1、2.5或5μg/Kg單一劑量的rGM-CSF或安慰劑。重組GM-CSF或安慰劑在右臂的三角肌部位皮下給藥，此后每個(gè)受試者立即在左臂的三角肌部位肌內(nèi)接受含有A/Singapore/6/86(HLNL)、A/Beijing/353/89(H3N2)和B/Yamagata/16/88病毒各15μg的許可使用的1992-1993三價(jià)亞病毒粒子疫苗0.5ml(Pasteur疫苗，Marnes-la-Coquette，F(xiàn)rance)。
樣本采集在研究開始之前和接種后1、3和6周從每一個(gè)受試者獲取血清和喉部標(biāo)本供病毒學(xué)培養(yǎng)。
血清抗體采用標(biāo)準(zhǔn)血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定血清樣品中針對(duì)流感A/Singapore(NHLNL)A/Beijing(H3N2)和B/Yamaga病毒抗原的HAI抗體。通過在同一天使用相同的試劑測(cè)定所有的樣品獲得了直到第6周收集到的血清的初步分析結(jié)果。起始稀釋度為1∶20。HAI抗體滴度小于1∶20被定義為“不可測(cè)”滴度。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析根據(jù)抗體滴度，以兩種不同的方式對(duì)有效性進(jìn)行定義。
血清轉(zhuǎn)化作用在第6周HAI抗體滴度比基線增加4倍。
血清保護(hù)作用在第6周HAI抗體滴度大于基線并至少等于1∶40。
基于所定義的有效數(shù)目用Fisher′s精確試驗(yàn)進(jìn)行分析。不同劑量組的安慰劑組合并在一起。
結(jié)果受試者特點(diǎn)對(duì)所有參予試驗(yàn)的60個(gè)年老志愿者在第6周完成實(shí)驗(yàn)評(píng)估。表3報(bào)告了基線的HAI抗體滴度。大多數(shù)受試者具有低于保護(hù)性水平即低于1∶40的基線HAI抗體滴度。除了以0.5μg/Kg處理的實(shí)驗(yàn)組(該組中多數(shù)病人具有不可測(cè)抗體滴度)外，所有處理組基線滴度分布相似。
免疫應(yīng)答表4示出了給予GM-CSF/安慰劑和流感疫苗6周后對(duì)所有3個(gè)毒株都有血清轉(zhuǎn)化作用的病人數(shù)目。對(duì)每一株也分別報(bào)告了結(jié)果。
接受安慰劑和流感疫苗的15個(gè)受試者中無一人表現(xiàn)出對(duì)所有三個(gè)流感病毒株的同時(shí)有血清轉(zhuǎn)化作用，而以2.5和5μg/KgrGM-CSF處理的9個(gè)受試者中的5個(gè)(56%)和9個(gè)中的3個(gè)(33%)對(duì)所有3個(gè)株有血清轉(zhuǎn)化作用。此外，當(dāng)分別測(cè)定對(duì)每一個(gè)流感病毒株的結(jié)果時(shí)，用2.5和5μg/KgrGM-CSF的血清轉(zhuǎn)化率(從44%-67%)較用安慰劑所觀察到的(從13%到20%)均高。有趣的是，用最低劑量(0.25μg/Kg)時(shí)所觀察到的血清轉(zhuǎn)化率較用0.5和1μg/Kg所觀察到的更高。
如表5所示，用“血清保護(hù)作用”定義有效時(shí)不改變結(jié)果的結(jié)論。正如所預(yù)料的，在所有治療組中，血清保護(hù)率均高于血清轉(zhuǎn)化率，因?yàn)檠灞Ｗo(hù)較血清轉(zhuǎn)化容易完成。用rGM-CSF處理的病人還表現(xiàn)出較用安慰劑處理的病人對(duì)流感疫苗更高的免疫應(yīng)答。事實(shí)上用2.5和5μg/Kg處理的病人9個(gè)中有5個(gè)(56%)和9個(gè)中有3個(gè)(33%)對(duì)所有3個(gè)毒株有血清保護(hù)作用，而以安慰劑處理的15個(gè)受試者中只有一個(gè)(7%)對(duì)所有3個(gè)毒株有血清保護(hù)作用。
表2研究設(shè)計(jì)受試者數(shù)目CSF39300安慰劑組I:0.25μg/Kg93組II:0.5μg/Kg93組III:1.μg/Kg93組IV:2.5μg/Kg93組V:5.μg/Kg9權(quán)利要求
1.一種提高哺乳動(dòng)物對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予需要接種的哺乳動(dòng)物有效量的GM-CSF以及疫苗。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中的疫苗選自乙型肝炎疫苗和流感疫苗。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中給予的GM-CSF被包含在持續(xù)釋放配方中。
4.GM-CSF在提高哺乳動(dòng)物對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答方面的用途。
5.GM-CSF在制造提高哺乳動(dòng)物對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答藥物方面的用途。
6.如權(quán)利要求4或5的用途，其中的疫苗選自乙型肝炎疫苗和流感疫苗。
7.如權(quán)利要求4或5的用途，其中的GM-CSF被包含在持續(xù)釋放配方中。
8.一種藥用組合物，含有有效量的GM-CSF和疫苗。
9.如權(quán)利要求8的藥用組合物，其中的GM-CSF被包含在持續(xù)釋放配方中。
10.一種增強(qiáng)哺乳動(dòng)物對(duì)疫苗中抗原的致免疫應(yīng)答的試劑盒，包括GM-CSF的藥用組合物和其適于藥用的載體的容器，以及疫苗藥用組合物和其適于藥用的載體的容器。
11.如權(quán)利要求10的試劑盒，其中的GM-CSF被包含在持續(xù)釋放配方中。
全文摘要
本發(fā)明是一種提高哺乳動(dòng)物對(duì)疫苗免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的GM—CSF以及疫苗。本發(fā)明還提供了含有有效量的GM—CSF，天然的、合成的或重組的抗原和適于藥用載體的藥用組合物。
文檔編號(hào)A61K39/145GK1091978SQ9310988
公開日1994年9月14日 申請(qǐng)日期1993年7月8日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月8日
發(fā)明者E·M·邦尼姆, E·施圖帕克, I·A·喬德里 申請(qǐng)人:先靈公司