專利名稱：一種制造重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用基因工程技術制造重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的方法，它包括以下幾個步驟1.利用PCR方法對GM-CSF cDNA進行改構；2.在大腸桿菌中進行高效表達；3.表達產物的復性；4.復性后表達產物的純化。
在以往的研究中(Greenberg R，Curr.Microbiol，1988；17321)，天然的粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)在大腸桿菌中表達量很低，難以復性、純化，不易達到臨床應用的要求，成本昂貴，不利于大量生產應用。
本發(fā)明的目的在于避免上述現(xiàn)有技術不足，提高GM-CSF在大腸桿菌中的表達水平，降低成本利于大量生產而提供的改構cDNA和GM-CSF的復性、純化的方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到利用計算機模擬改造GM-CSF cDNA成熟編碼區(qū)的5′端，使其形成的二級結構減弱，能量下降減少，有利于mRNA的解讀、翻譯，提高表達量。根據(jù)此設計合成引物，用PCR方法定向改造cDNA成熟編碼區(qū)的5′端，盡量采用大腸桿菌偏性密碼子，而不改變編碼氨基酸排列的順序。
改構后的cDNA插入到pBV220表達載體中，轉化受體菌HB101，經(jīng)熱誘導后，高效表達rhGM-CSF。表達的rhGM-CSF工程菌用超聲破碎，經(jīng)4,000～12,000rpm離心15～25分鐘后取包含體沉淀，用含有0～2M尿素、10～50mM Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液(pH8～9)洗滌；洗滌后包含體沉淀用8M尿素、10mM二硫蘇糖醇(DTT)溶解，可溶部分用由二硫蘇糖醇0.01～2mM、氧化型谷胱甘肽0.01～2mM組成的稀釋復性液在2～10℃溫度下復性。
復性后經(jīng)Q-Sepharose FF層析柱純化，洗脫液為含有0.3～1M NaCl的Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液(pH6.5～8.5)。收集蛋白峰過Sephacryl S-200柱除去多聚體，即得rhGM-CSF純品。
另一純化路線亦可得到相同結果8M尿素可溶部分先過Sephacryl S-200層析柱，部分收集rhGM-CSF蛋白峰，在上述稀釋復性液中復性，再過Q-Sepharose FF層析柱。
附圖的圖面說明如下

圖1.改構后的rhGM-CSF cDNA序列圖2.改構后的rhGM-CSF cDNA序列圖3.rhGM-CSF重組質粒構建圖。其中1.pUC/GM-CSF2.GM-CSF cDNA3.pBV2204.改構后的GM-CSF cDNA5.重組質粒J1本發(fā)明結合附圖實施例作進一步詳述實施例1根據(jù)文獻發(fā)表的cDNA核甘酸順序，設計并合成引物。從中國人外周血有核細胞中提取總RNA，用逆轉錄-PCR擴增克隆了hGM-CSF之cDNA，用DNA序列分析驗證。再根據(jù)大腸桿菌偏性密碼及能量最低原理，設計合成一對引物，盡量避免cDNA成熟編碼區(qū)5′端的二級結構，將終止密碼子換成TAA。引物如下上游引物5′CGGAATTCATGGCACCAGCACGTTCTCCATCTCCGTCTACTCAGCCCTGG 3′；下游引物5′CTGGATCCTTACTCCTGGACTGGCTC3′。
用PCR方法改構cDNA(如圖1)，以EcoRI和BamHI位點插入高效表達載體pBV220中(構建過程見圖3)，轉化受體菌HB101，篩選出重組質粒，命名為J1。
將工程菌J1/HB101接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜，再以5％擴大培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，立即轉42℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時。4,500rpm離心25分鐘收集菌體，以1/10懸浮于20mM磷酸鹽緩沖液中，超聲破碎，12,000rpm離心15分鐘，收集包含體沉淀，用1M尿素洗滌沉淀兩次，離心回收沉淀，用8M尿素10mM DTT溶解?？扇懿糠诌^凝膠過濾Sephacryl S-200層析柱，緩沖液為20mM Tris-HCl(pH8.0，含5M尿素)，分步收集rhGM-CSF峰，用含0.2mM DTT和0.1mM氧化型谷胱苷肽的緩沖液復性后過Q-Sepharose FF陰離子交換柱，用含1M NaCl的20mM Tris-HClpH8.0洗脫rhGM-CSF，其比活性＞1×107u/mg，純度＞98％。
實施例2將逆轉錄-PCR克隆的hGM-CSF之cDNA，根據(jù)能量最低原理并盡量采用大腸桿菌偏性密碼，設計引物用PCR方法改造之。
上游引物5′GAGAATTCATGGCACCGGCTCGTTCTCCATCTCCGTCTACTCAGCCCTGG3′；下游引物5′CTGGATCCTTACTCCTGGACTGGCTC3′構建重組質粒。
重組質粒轉化大腸桿菌HB101，工程菌在LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，快速升溫至42℃繼續(xù)培養(yǎng)3～4小時，用SDS-PAGE測定表達產物rhGM-CSF占菌體總蛋白的40％。
收集菌體8,000rpm離心15分鐘，經(jīng)超聲破碎后，離心8,000rpm15分鐘收沉淀，沉淀以20mM Tris-HCl，1mM EDTA緩沖液洗3次，用8M尿素10mM二硫蘇糖醇溶解包含體沉淀?？扇懿糠窒♂審托?，4℃20小時后過Q-Sepharose FF，用含0.3MNaCl的Tris-HCl pH8.0洗脫rhGM-CSF，收集蛋白峰，再過Sephacryl S-200柱，分步收集rhGM-CSF單體峰，所得純化的rhGM-CSF比活性＞1×107u/mg，純度＞98％。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有如下優(yōu)點1.用改構后的cDNA構建的工程菌表達rhGM-CSF的水平顯著提高，達到全菌總蛋白的40％以上；2.純化簡便，生產成本低，所得rhGM-CSF比活性高，＞1×107u/mg，純度＞98％；3.所得rhGM-CSF純品可以滿足臨床應用要求。
權利要求
1.一種利用基因工程技術制造重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子的方法，其特征在于用PCR方法對人粒-巨噬細胞集落刺激因子cDNA的改構，獲得重組質粒以及對此工程菌進行表達，經(jīng)離心、洗滌液洗滌、回收包含體、尿素溶解、稀釋復性液中復性，經(jīng)Q-Sepharose FF和Sephacryl S-200層析柱純化，分步收集可得重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子純品。
2.依據(jù)權利要求1所述之方法，其特征在于改構后的cDNA核苷酸序列如下所示ATGGCACCAG CACGTTCTCC ATCTCCGTCTACTCAGCCCT GGGAGCATGT GAATGCCATCCAGGAGGCCC GGCGTCTCCT GAACCTGAGTAGAGACACTG CTGCTGAGAT GAATGAAACAGTAGAAGTCA TCTCAGAAAT GTTTGACCTCCAGGAGCCGA CCTGCCTACA GACCCGCCTGGAGCTGTACA AGCAGGGCCT GCGGGGCAGCCTCACCAAGC TCAAGGGCCC CTTGACCATGATGGCCAGCC ACTACAAGCA GCACTGCCCTCCAACCCCGG AAACTTCCTG TGCAACCCAGACTATCACCT TTGAAAGTTT CAAAGAGAACCTGAAGGACT TTCTGCTTGT CATCCCCTTTGACTGCTGGG AGCCAGTCCA GGAGTAA。
3.依據(jù)權利要求1所述之方法，其特征在于改構后的cDNA核苷酸序列如下所示ATGGCACCGG CTCGTTCTCC ATCTCCGTCTACTCAGCCCT GGGAGCATGT GAATGCCATCCAGGAGGCCC GGCGTCTCCT GAACCTGAGTAGAGACACTG CTGCTGAGAT GAATGAAACAGTAGAAGTCA TCTCAGAAAT GTTTGACCTCCAGGAGCCGA CCTGCCTACA GACCCGCCTGGAGCTGTACA AGCAGGGCCT GCGGGGCAGCCTCACCAAGC TCAAGGGCCC CTTGACCATGATGGCCAGCC ACTACAAGCA GCACTGCCCTCCAACCCCGG AAACTTCCTG TGCAACCCAGACTATCACCT TTGAAAGTTT CAAAGAGAACCTGAAGGACT TTCTGCTTGT CATCCCCTTTGACTGCTGGG AGCCAGTCCA GGAGTAA。
4.依據(jù)權利要求1所述之方法，其特征在于離心轉速為4000～12,000rpm，時間為15～25分鐘。
5.依據(jù)權利要求1所述之方法，其特征在于洗滌液中含有0～2M尿素、10～50mM Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液，pH值8～9。
6.依據(jù)權利要求1所述之方法，其特征在于稀釋復性液中含有二硫蘇糖醇和氧化型谷胱甘肽，其濃度分別為0.01～2mM和0.01～2mM。
7.依據(jù)權利要求1所述之方法，其特征在于Q-SepharoseFF層析柱純化過程中洗脫重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子洗脫液為含有0.3～1M NaCl、pH6.5～8.5的Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用基因工程技術制造重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子方法，其目的在于提高粒-巨噬細胞集落刺激因子的表達水平，便于純化制備。利用PCR技術改構其cDNA成熟肽編碼區(qū)5′端，消除其強二級結構，將其插入高效表達載體，受熱誘導后得到高效表達，分離包含體、溶解、復性、純化后得到比活性＞1×10
文檔編號C12N15/63GK1129255SQ95101619
公開日1996年8月21日 申請日期1995年2月16日 優(yōu)先權日1995年2月16日
發(fā)明者汲言山, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所