專利名稱：制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子微球的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種納米藥物技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種用甘油法制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)微球的方法。
背景技術(shù)：
制藥行業(yè)從藥物發(fā)現(xiàn)，到臨床的應(yīng)用，最后一個環(huán)節(jié)是藥物制劑。其中有一部分藥物需要長期給藥才能治愈；還有一部分需要靶向等局部給藥。要達(dá)到這些目的，原料藥必須要制備成相應(yīng)的劑型。例如需要長期給藥但在體內(nèi)的半衰期短的藥物，宜制備成緩釋劑型； 對于一些腫瘤的治療，需要一些藥物靶向于病照，例如靶向于腫瘤血管的栓塞微球制劑等； 基因重組技術(shù)用于治療蛋白的表達(dá)和生產(chǎn)的20多年以來，到目前為止，已有30多個蛋白藥物產(chǎn)品投入臨床使用，近200個在審批和研發(fā)過程中，涌現(xiàn)出一批諸如安進(jìn)(Amgen)、基因技術(shù)(Genentech)等一批新的大型醫(yī)藥公司。相對于蛋白大分子藥物本身的快速發(fā)展，其劑型技術(shù)進(jìn)展緩慢。一方面，蛋白大分子藥物口服不吸收、體內(nèi)半衰期短，需要注射給藥；另一方面，許多何爾蒙、細(xì)胞因子類的蛋白藥物治療周期長，長期而頻繁地注射成為必須，也影響患者順應(yīng)性的主要原因。緩釋蛋白藥物的劑型的研發(fā)，由于在制備微粒過程導(dǎo)致活性的損失諸如W/0/W法、包封率不高的S/0/W法和易突釋的S/0/0法等。發(fā)展制備具有活性保護(hù)的蛋白微球又可以提高包封率和突釋的方法勢在必行。到目前還未見利用甘油法制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子微球的報道。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，[Lee E. S.，Kwon M. J.，Lee H.，and Kim J. J. , Stabilization of protein encapsulated in poly (lactide-co-glycolide) microspheres by novel viscous S/ff/0/ff method, International Journal of Pharmaceutics 331 (2007)27-371，(Lee E. S.，Kwon Μ. J.，LeeH.，and KimJ. J.，報道了利用新粘度S/W/0/W方法把蛋白穩(wěn)定的包封在PLGA微球里，國際藥學(xué)雜志，2007，331 :27-37)。 Lee E.S.等人在該文獻(xiàn)報道了利用S/W/0/W方法制備了微球。該文獻(xiàn)利用蛋白環(huán)糊精凍干然后磨碎，把磨碎的蛋白環(huán)糊精加到高粘度的多糖溶液及PLGA的二氯甲烷溶液乳化，最后到水相中硬化微球且只是針對蛋白類藥物，沒有見報道其他藥物。但是蛋白質(zhì)環(huán)糊精的顆粒與多糖水溶液接觸難免蛋白質(zhì)不溶解，溶解后的的蛋白水溶液很容易與PLGA的二氯甲烷接觸，存在油水界面而導(dǎo)致聚集。同樣致使包封率也不高，存在不完全釋放。[Morita Τ. , Sakamura Y. , Horikiri Y. , Suzuki Τ. , Yoshino H. , Protein encapsulation into biodegradable microspheres by a novel S/O/ff emulsion method using poly (ethylene glycol)as a protein micronization adjuvant, Journal of Controlled Release 69(2000)435-444] (Morita T. Sakamura Y.，Horikiri Y.，Suzuki Τ.，Yoshino H.，通過 PEG作為蛋白微?；淖魟┩ㄟ^S/0/W乳化法制備載蛋白微球，《控制釋放雜志》，2000,69 435-444)Morita T等人在該文獻(xiàn)報道了利用新S/0/W乳化法制備載蛋白微球。只是改變了表面活性劑以前報道較多的是用PVA，在這篇文獻(xiàn)改用PEG。但是仍然不能克服包封率低， 存在突釋和不完全釋放的缺點(diǎn)，到目前還未見利用甘油法制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子微球的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子微球的方法，制備得到的微球規(guī)整無粘連；包封率高，突釋小，載藥量高。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明通過將粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒分散在具有緩釋或控釋的功能材料的有機(jī)溶液中形成混懸液，然后將混懸液加到油相(0)中經(jīng)攪拌或漩渦形成微球，并將微球轉(zhuǎn)移到甘油修飾的水相(W)中形成復(fù)乳， 最后將復(fù)乳固化處理后得到粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子微球。所述的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒由粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子l_50wt%和葡聚糖為l-50wt%組成，其粒徑大小為0. 1-10 μ m ；該粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒通過水相-水相乳液法、低溫噴霧干燥法、相分離法、超臨界法或金屬離子與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子形成的復(fù)合物的方法制備得到。所述的油相(0)是指含有緩釋或控釋材料的有機(jī)溶液，該油相(0)通過把控釋或緩釋功能材料溶于有機(jī)溶劑制備得到，其重量百分比濃度為1-30% (w/w) 0所述的具有緩釋或控釋的功能材料采用聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)、PLA和PLGA的組合、聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG)、聚乙二醇-聚羥基乙酸 (PLGA-PEG)、聚羥基乙酸-聚乙二醇-聚羥基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)、聚乳酸和聚乳酸-聚羥基乙酸的組合、聚乙二醇-聚己內(nèi)酯 (PEG-PCL)、聚己內(nèi)酯聚-乙二醇-聚己內(nèi)酯(PCL-PEG-PCL)或聚己內(nèi)酯(PCL)；所述的有機(jī)溶液采用二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈或丙酮有機(jī)溶液。所述的具有緩釋或控釋的功能材料的有機(jī)溶液重量百分比濃度為1-30% (w/
W) O所述的甘油修飾的水相(W)是指含有表面活性劑、甘油、水和NaCl的組合，通過將重量百分比濃度為0. 5-10% (w/w)的表面活性劑、1.5-100% (w/w)甘油和0-10% (w/w) 的NaCl和0-98% (wt)水混勻得到。所述的表面活性劑采用聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 泊洛沙姆(polomer)、吐溫、聚三梨醇或乙基纖維素；所述的攪拌是指機(jī)械攪拌0. l-5min,形成10-500 μ m的微球；所述的固化處理是指復(fù)乳滴加到IOOOmL含(w/w)的氯化鈉溶液，并攪拌 1-4小時，離心收集微球并洗滌3-5次，然后凍干得微球。本發(fā)明涉及上述方法制備得到的微球，其組分及質(zhì)量百分比為葡聚糖顆粒 1-20 %、功能材料80-99 %，該微球的粒徑為1-500 μ m。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于克服了水溶性好的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子包封率不高、突釋嚴(yán)重的缺點(diǎn)；對于粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子藥物來說，克服了油水界面、高剪切力、界面、和交聯(lián)劑等，在溫和的條件下把生物活性物質(zhì)，能夠長期保持活性。大大的減少保存的費(fèi)用和提高療效，且比對照組的包封率高于40%、活性高于50%，體外的釋放曲線好于對照組。本發(fā)明選擇了合適的油相(0)和甘油修飾的水相(W)及合適控釋或緩釋的材料，使水溶性的藥物顆?；蛴腿苄缘乃幬锿ㄟ^制劑的方法制備成油不溶的顆粒，避免用常規(guī)的 W/0、W/O/W、S/0/W的包封率不高，和S/0/0的突釋嚴(yán)重，及造成的環(huán)境污染的缺點(diǎn)；采用該方法制備微球，其粒徑的大小可以根據(jù)不同需要，進(jìn)行控制，不污染環(huán)境；可以避免對藥物的治療的作用影響，尤其是那些物理化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的，對油水界面敏感的藥物，如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子藥物。微粒的表面光滑圓整，顆粒規(guī)整無粘連，粒徑可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)控從ι μ m到500 μ m,其凍干粉劑為白色細(xì)膩，疏松，不會塌陷，不粘連，再分散性良好?？梢赃\(yùn)用到各種藥物緩釋微球的制備及疫苗的佐劑。制備的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子緩釋微球的生物細(xì)胞活性高于對照組微球的20% ；體外釋放也好于對照組的。


圖1為甘油法制備的微球顯微鏡圖；圖中(A)m5-S/0/W :100% (w/w)甘油(B)m4_S/0/W 80% (w/w)甘油，(C)m3_S/0/ W 60% (w/w)甘油，(D)m2-S/0/W :40% (w/w)甘油，(E)ml_S/0/W :20% (w/w)甘油，(F)W/ 0/W對照組。圖2為甘油法制備的微球掃描電鏡圖；圖中(A)m5-S/0/W 100% (w/w)甘油(B)m4_S/0/W 80% (w/w)甘油，(C)m3_S/0/ W 60% (w/w)甘油，(D)m2-S/0/W :40% (w/w)甘油，(E)ml_S/0/W :20% (w/w)甘油，(F)W/ 0/W對照組。圖3為體外釋放曲線示意圖；圖中 :m4-S/0/W 80% (w/w)甘油，▲ :m3_S/0/W 60% (w/w)甘油；參m2_S/ 0/ff 40% (w/w)甘油；Δ :ml-S/0/ff 20% (w/w)甘油；W/O/W 對照組。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。實施例一一種用甘油法制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)微球的方法(1)取5 μ m的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒IOmg和重量百分比濃度為20%的分子量為4.7萬的聚乳酸-羥基乙酸(50 50，PLGA)的二氯甲烷溶液ImL攪拌、漩渦或超聲1-5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟⑴得乳液滴加到含有重量百分比濃度為20%的甘油修飾的水相(W) (W)并攪拌、漩渦或超聲0. 1-5分鐘形成復(fù)乳；(3)把步驟O)的復(fù)乳滴加到重量百分比濃度為5% (w/w)的IOOOmL氯化鈉溶液中并攪拌2-4小時；(4)把步驟(3)得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得到微球。(5)然后放在室溫和濕度為30%的環(huán)境下保存兩年，取出用細(xì)胞測定其生物活性； 把上述微球通過顯微鏡(如圖1A)、掃描電鏡(如圖2A)顯示粒徑約40 μ m-80 μ m ；包封率為90%而對照組僅為50%和細(xì)胞活性比對照組的活性高49%與用來制備的原料藥的活性僅少11% (新買的原料藥)。體外釋放曲線如圖3所示，比對照組降低了突釋。實施例二 一種用甘油法制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)微球的方法(1)取10 μ m的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒50mg和濃度為20% 的分子量為4. 7萬的聚乳酸-羥基乙酸(50 50，PLGA)的二氯甲烷溶液ImL攪拌、漩渦或超聲1-5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟⑴得乳液滴加到含有重量百分比濃度為40%的甘油修飾的水相(W) (W)并攪拌、漩渦或超聲0. 1-5分鐘形成復(fù)乳；(3)把步驟O)的復(fù)乳滴加到重量百分比濃度為10% (w/w)的IOOOmL氯化鈉溶液中并攪拌2-4小時；(4)把步驟(3)得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得到微球。(5)然后放在室溫和濕度為30%的環(huán)境下保存兩年，取出用細(xì)胞測定其生物活性；把上述微球通過顯微鏡(如圖1B)、掃描電鏡(如圖1B)顯示粒徑約40 μ m-80 μ m ； 包封率為90%而對照組僅為50%和細(xì)胞活性比對照組的活性高48. 7%與用來制備的原料藥的活性僅少11% (新買的原料藥)。體外釋放曲線如圖3所示，比對照組降低了突釋。實施例三一種用甘油法制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)微球的方法(1)取5 μ m的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒5mg和濃度為20%的分子量為8. 3萬的聚乳酸(PLA)的二氯甲烷溶液ImL攪拌、漩渦或超聲1_5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟(1)得乳液滴加到含有重量百分比濃度為60%的甘油修飾的水相(W) (W)并攪拌、漩渦或超聲0. 1-5分鐘形成復(fù)乳；(3)把步驟O)的復(fù)乳滴加到重量百分比濃度為(w/w)的IOOOmL氯化鈉溶液中并攪拌2-4小時；(4)把步驟( 得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得到微球。(5)然后放在室溫和濕度為30%的環(huán)境下保存兩年，取出用細(xì)胞測定其生物活性；把上述微球通過顯微鏡(如圖1C)、掃描電鏡(如圖1C)顯示粒徑約40 μ m-80 μ m ； 包封率為91%而對照組僅為50%和細(xì)胞活性比對照組的活性高49%與用來制備的原料藥的活性僅少11% (新買的原料藥)。體外釋放曲線如圖3所示，比對照組降低了突釋。實施例四一種用甘油法制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)微球的方法(1)取1 μ m的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒5mg和濃度為20%的分子量為8. 3萬的聚乳酸(PLA)的二氯甲烷溶液ImL攪拌、漩渦或超聲1_5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟(1)得乳液滴加到含有重量百分比濃度為80%的甘油修飾的水相(W) (W)并攪拌、漩渦或超聲0. 1-5分鐘形成復(fù)乳；
(3)把步驟⑵的復(fù)乳滴加到百分比濃度為5% (w/w)的IOOOmL氯化鈉溶液中并攪拌2-4小時；(4)把步驟( 得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得到微球。(5)然后放在室溫和濕度為30%的環(huán)境下保存兩年，取出用細(xì)胞測定其生物活性；把上述微球通過顯微鏡(如圖1D)、掃描電鏡(如圖1D)顯示粒徑約40 μ m-80 μ m ； 包封率為91%而對照組僅為50%和細(xì)胞活性比對照組的活性高49%與用來制備的原料藥的活性僅少11% (新買的原料藥)。體外釋放曲線如圖3所示，比對照組降低了突釋。實施例五一種用甘油法制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)微球的方法(1)取1 μ m的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒5mg和濃度為20%的分子量為8. 3萬的聚乳酸(PLA)的二氯甲烷溶液ImL攪拌、漩渦或超聲1_5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟⑴得乳液滴加到含有重量百分比濃度為100%的甘油修飾的水相(W) (W)并攪拌、漩渦或超聲0. 1-5分鐘形成復(fù)乳；(3)把步驟O)的復(fù)乳滴加到重量百分比濃度為8% (w/w)的IOOOmL氯化鈉溶液中并攪拌2-4小時；(4)把步驟(3)得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得到微球。(5)然后放在室溫和濕度為30%的環(huán)境下保存兩年，取出用細(xì)胞測定其生物活性；把上述微球通過顯微鏡(如圖1E)、掃描電鏡(如圖1E)顯示粒徑約20 μ m-80 μ m ； 包封率為92%而對照組僅為50%和細(xì)胞活性比對照組的活性高50%與用來制備的原料藥的活性僅少10% (新買的原料藥)。體外釋放曲線如圖3所示，比對照組降低了突釋。
權(quán)利要求
1.一種制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子微球的方法，其特征在于，通過將粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒分散在具有緩釋或控釋的功能材料的有機(jī)溶液中形成混懸液，然后將混懸液加到油相(0)中經(jīng)攪拌或漩渦形成微球，并將微球轉(zhuǎn)移到甘油修飾的水相(W)中形成復(fù)乳，最后將復(fù)乳固化處理后得到粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒由粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子l-50wt%和葡聚糖為l-50wt%組成，其粒徑大小為0. 1-10 μ m,該粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒通過水相-水相乳液法、低溫噴霧干燥法、相分離法、超臨界法或金屬離子與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子形成的復(fù)合物的方法制備得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的油相(0)是指含有緩釋或控釋材料的有機(jī)溶液，該油相(0)通過把控釋或緩釋功能材料溶于有機(jī)溶劑制備得到，其重量百分比濃度為1-30% (w/w)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的具有緩釋或控釋的功能材料采用聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸、PLA和PLGA的組合、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸、聚乳酸和聚乳酸-聚羥基乙酸的組合、聚乙二醇-聚己內(nèi)酯、聚己內(nèi)酯聚-乙二醇-聚己內(nèi)酯或聚己內(nèi)酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的具有緩釋或控釋的功能材料的有機(jī)溶液重量百分比濃度為1-30% (w/w) 0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的甘油修飾的水相(W)是指含有表面活性劑、甘油、水和NaCl的組合，通過將重量百分比濃度為0.5-10% (w/w)的表面活性劑、 1. 5-100% (w/w)甘油和 0-10% (w/w)的 NaCl 和 0-98% (wt)水混勻得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的表面活性劑采用聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、吐溫、聚三梨醇或乙基纖維素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的固化處理是指復(fù)乳滴加到IOOOmL 含1-10% (w/w)的氯化鈉溶液，并攪拌1-4小時，離心收集微球并洗滌3-5次，然后凍干得微球。
9.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述方法制備得到的微球，其特征在于，其組分及質(zhì)量百分比為葡聚糖顆粒1_20%、功能材料80-99%，該微球的粒徑為1-500 μ m。
全文摘要
一種納米藥物技術(shù)領(lǐng)域的制備粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子微球的方法，通過將粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子葡聚糖顆粒分散在具有緩釋或控釋功能材料的有機(jī)溶液中形成混懸液，然后將混懸液加到油相(O)中經(jīng)攪拌或漩渦形成微球，并將微球轉(zhuǎn)移到甘油修飾的水相(W)中形成復(fù)乳，最后將復(fù)乳固化處理后得到粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子微球。本發(fā)明制備得到的微球規(guī)整無粘連；包封率高，突釋小，載藥量高。
文檔編號A61K47/34GK102188391SQ201110107988
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者任甜甜, 馮艷, 洪曉蕓, 秦明杰, 袁偉恩, 鄭瑞媛 申請人:上海交通大學(xué)