專利名稱：使用造血生長因子治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過給予造血生長因子治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，所述 造血生長因子例如粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)和 /或其他造血因子，例如除促紅細(xì)胞生成素(EPO)外的MCSF。本發(fā)明也提供了用于篩選與 神經(jīng)元細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的GCSF或GMCSF受體結(jié)合的化合物的方法；所述化合物提供了神經(jīng)保 護(hù)、神經(jīng)增殖和/或STAT基因激活活性。
背景技術(shù)：
生長因子是實(shí)質(zhì)上涉及調(diào)節(jié)發(fā)育神經(jīng)元細(xì)胞生存、增殖、成熟和向外生長的蛋白 質(zhì)。例如，許多生長因子的表達(dá)能增加對(duì)各種腦損傷的應(yīng)答。許多因子顯示了內(nèi)源性神經(jīng)保 護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)作用(參見 Arvidsson A 等.，Neuroscience 2001 ； 106 :27_41 Larsson E, 等.，JCereb Blood Flow Metab 1999 ；19 1220-8 :Mattson MP.等.，JNeurotrauma 1994 ； 11 3~33 :Semkova I,等Brain Res Brain Res Revl999 ;30 176-88)。在腦外傷和中 風(fēng)后，在體外和體內(nèi)進(jìn)行外源性給藥后也報(bào)道了這些效應(yīng)(參見Semkova I.，等.，Brain Res. Rev. 1999 ；30 176-88 :Fisher Μ,等· , J. Cereb. Blood Flow Metab. 1995 ；15 953-9 ； SchabitZ W.等.，Stroke 2001;32:1226-33; SchSbltz WR,等.，Stroke2000 31
2212-7)。在結(jié)合到高親和力膜受體后，通過胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件級(jí)聯(lián)介導(dǎo)了生長因子的效應(yīng) (Kernie SG,等.，Arch Neurol 2000 ；57 :654_7)，其誘導(dǎo)細(xì)胞生長并分化；或提供用于細(xì) 胞生存的營養(yǎng)支持。粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)，一種20kDa蛋白質(zhì)，與腫瘤壞死因子α (TNF- α )以 及白介素都是生長因子-細(xì)胞因子家族成員。GCSF是嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的重要生長因子。GCSF通過激活屬于促紅細(xì)胞生成素受體超家族的膜受體(GCSF受體)從而發(fā)揮功 能，所述膜受體稱為I類細(xì)胞因子受體(de Koning和Touw, Curr. Opin. Hemato.，1996，3， 180-4)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)許多淋巴因子、造血生長因子和生長激素相關(guān)分子的受體具有共同的結(jié) 合域。這些受體稱為促紅細(xì)胞生成素受體，相應(yīng)的配體稱為促紅細(xì)胞生成素。此外，業(yè)已 將促紅細(xì)胞生成素分為兩種主要的結(jié)構(gòu)群大/長以及小/短的促紅細(xì)胞生成素。特有 受體鏈的一個(gè)亞型，即大的促紅細(xì)胞生成素受體復(fù)合物一部分，在其的胞外部分包含共同 的結(jié)構(gòu)成分免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)構(gòu)域以及3個(gè)粘連蛋白III結(jié) 構(gòu)域(2個(gè)位于來普汀受體中)。這一亞類稱為“gpl30家族受體” (Moslev.等.，J. Biol Chem. 1996，271，32635-43)并包括來普汀受體(LPTR)、粒細(xì)胞集落刺激因子受體(GCSFR)、 白介素-6/-11/LIF/0SM/CNTF共有的β鏈(GP130)、白血病抑制因子受體(LIFR)、制瘤素-M受體β鏈(OSMR)、白介素-12受體β -1鏈(IL12RB1)、白介素-12受體β -2鏈 (IL12RB2)。當(dāng)結(jié)合同類細(xì)胞因子時(shí)，這些受體鏈同源二聚體化(GCSFR、GP130、LPTR)或異 源二聚體化(GP130與LIFR或0SMR、IL12RB1與IL12RB2)。此外，這些受體家族具有Prosite 共有模式的特點(diǎn)，其為N-x (4) -S-X (28 , 35) - [LVIM] -x-ff-x (O，3) -Ρ-χ (5，9) - [YF] -χ (1， 2)-[VILM] -x-ff(SEQ ID NO 1)GCSF刺激細(xì)胞增殖、生存及成熟，所述細(xì)胞通過結(jié)合特異的GCSF受體(GCSFR)而 提呈至嗜中性粒細(xì)胞系(參見 Hartung T 等.，Curr. Opin. Hemato. 1998 ；5 :221_5)。GCSFR 介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)蛋白家族信號(hào)激活，該STAT蛋白易位至細(xì)胞核并調(diào) 節(jié)轉(zhuǎn)錄(Darnell TE Tr. ,Science 1997 ；277 1630-5)。通常將GCSF用于治療人中各種中 性白細(xì)胞減少癥。其是屈指可數(shù)的被批準(zhǔn)用于臨床使用的生長因子之一。具體而言，其用于 緩解化學(xué)療法(CT)-誘導(dǎo)的血細(xì)胞減少癥(Viens等·，J of Clin. Oncology, Vol. 20, No. 1， 2002 24-36)。作為可能的輔助劑，也包括將GCSF用于治療傳染性疾病(Hiibel等，J. of Infectious Diseases, Vol. 185 1490-501，2002)。據(jù)報(bào)道GCSF 已結(jié)晶至一定程度(EP 344 796)，業(yè)已推測(cè)出GCSF的總體結(jié)構(gòu)，但僅是大體水平推測(cè)(Bazan, Immunology Today 11: 350-354(1990) Parrv 等.R Molecular Recognition 8 :107N 110(1988))。近年來臨床研究業(yè)已測(cè)試了許多生長因子諸如bFGF、血小板粘連阻滯劑樣抗-GP Ilb/IIa等藥學(xué)上所期望物質(zhì)以及Abcizimab的神經(jīng)保護(hù)功效。不幸的是，它們都無法成功 地提供神經(jīng)保護(hù)功效。具體而言，NMDA拮抗劑、自由基清除劑和谷氨酸鹽拮抗劑無法提供 神經(jīng)保護(hù)功效或表現(xiàn)出嚴(yán)重副作用。諸如抗ICAM或谷氨酸鹽介導(dǎo)的NO-合成酶抑制劑的 一組物質(zhì)不具備神經(jīng)生長能力(De Keyser 等.(1999)，TrendsNeurosci，22，535-40)。大多數(shù)關(guān)于腦缺血的研究和體內(nèi)的藥用物質(zhì)測(cè)試僅集中于所述藥物或正在研究 中的模系的瞬即效應(yīng)(即在誘發(fā)中風(fēng)24小時(shí)后的梗塞面積)。然而，特定物質(zhì)更有效的真 正有效參數(shù)是對(duì)機(jī)能恢復(fù)的長期效應(yīng)，其在人中風(fēng)研究中也得到反映，在此臨床分級(jí)(如， 斯堪的納維亞人中風(fēng)分級(jí)、NIH分級(jí)、巴塞爾(Barthel)指數(shù))也反映了進(jìn)行日?；顒?dòng)的能 力。在局部性病變后開始幾天內(nèi)的恢復(fù)可能是因?yàn)槿毖胗皡^(qū)水腫或再灌注消退之故。在 急性期后大部分機(jī)能恢復(fù)有可能是因?yàn)槟X可塑性之故，利用鄰近皮層區(qū)接管所述受損區(qū)以 前所行使的功能(Chen R,Cohen LG,Hallett Μ. Neuroscience 2002 ；111(4) :761_73)。提 議用于解釋組織再生的兩種主要機(jī)制早已公開，但不包括功能上失活的連接以及諸如側(cè)索 生芽的新連接的生長(Chen R, Cohen LG, Hallett Μ. 2002 Neuroscience 2002 ；111 (4) 761-73)。去除對(duì)興奮性突觸的抑制介導(dǎo)了短期塑性變化，其有可能是因?yàn)镚ABA能的抑制 緩解之故(Kaas JH. Annu Rev Neurosci. 1991 ；14 137-67 [Tones EG. CerebCortex. 1993 Sep-Oct ；3 (5) :361-72)。在一段較長時(shí)間后，所發(fā)生的可塑性變化涉及除諸如長程增強(qiáng)效 應(yīng)(LTP)的隱藏突觸暴露之外的機(jī)制，其需要NMDA受體激活并增加胞內(nèi)鈣濃度(Hess和 DonoRhue,.! Neurophysiol. 199471(6) :2543_7)。長期變化也涉及軸突再生和突觸形狀、數(shù) 量、大小以及類型具有改變的生芽(Kaas JH. Annu RevNeurosci. 1991 ；14 :137_67. 3 )。中風(fēng)是位列第三的死因，在西方世界中還是導(dǎo)致殘疾的主因。其帶來了巨大的社 會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。其病因可能是局部缺血(在大多數(shù)情況下)或出血。局部缺血中風(fēng)的誘因通 常是栓塞或血栓形成。迄今為止，對(duì)于大多數(shù)中風(fēng)病人而言尚無有效療法。目前為止，臨床上有效的藥物僅有組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)和阿斯匹林。由于缺乏葡萄糖和氧， 在接近梗塞核心的大量細(xì)胞壞死后，因諸如谷氨酸鹽興奮性中毒、細(xì)胞凋亡機(jī)制和自由基 產(chǎn)生等次要機(jī)制，梗塞面積在一段時(shí)間內(nèi)不斷擴(kuò)大。肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS ；Lou-Gehrig氏病；Charcot氏病)是一種神經(jīng)變性障礙， 年發(fā)病率為 0. 4-1. 76/10 萬人(Adams 等 ，Principlesof Neurology,第 6 版 ，New York, PP 1090-1095)。其是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病變的最常見類型，典型表現(xiàn)為全身性肌束震顫、進(jìn)行 性萎縮和骨骼肌無力、痙攣狀態(tài)和錐體束征、發(fā)音困難、吞咽困難和呼吸困難。其病理主要 包括脊髓前角和下腦干運(yùn)動(dòng)核中神經(jīng)細(xì)胞的損失，但也可包括所述皮層中一級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 的損失。該破壞性疾病的發(fā)病機(jī)理基本上還不清楚，雖然在家族病例中業(yè)已十分徹底地研 究出超氧化物歧化酶(S0D1)突變體的作用，其援引了氧化應(yīng)激假說。迄今為止，在S0D1蛋 白中已經(jīng)描述了超過90種可導(dǎo)致ALS的變體(Cleveland和Rothstein (2001)，Nat Rev Neurosci，2，806-19)。并且，顯示了神經(jīng)絲在該疾病中所起的作用。通過過量谷氨酸鹽刺激 誘發(fā)興奮性中毒的機(jī)制也是一個(gè)重要因素，其為利魯唑在人類患者中的有益作用所例證。 在S0D1突變體中的表現(xiàn)最具說服力，在ALS中凋亡蛋白酶和細(xì)胞凋亡激活似乎是常見的最 終途徑(Ishigaki.等.(2002)，J Neurochem, 82, 576-84.，Li,等.(2000)，Science, 288, 335-9)。因此，似乎ALS也屬于相同的普遍致病類型，即在其他神經(jīng)變性疾病和中風(fēng)中也發(fā) 揮作用，如谷氨酸鹽介入、氧化應(yīng)激和程序性細(xì)胞死亡。帕金森氏癥是最常見的運(yùn)動(dòng)障礙，在北美洲大約有1百萬病人；在超過65歲年 齡的人群中大約有感染此病。該疾病核心癥狀是僵直、震顫和運(yùn)動(dòng)不能(Adams等 , Principles of Neurology，第 6 版 ，NewYork，pp 1090-1095)。帕金森氏癥病因未知。然 而，來自人腦尸體解剖研究的重要尸體生化數(shù)據(jù)和動(dòng)物模型指出在黑質(zhì)中氧化應(yīng)激的進(jìn)行 過程，其可能啟動(dòng)多巴胺能神經(jīng)變性。為神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺和MPTP(N-甲基4-苯 基-1，2，3，6-四氫吡啶)所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激業(yè)已被用于動(dòng)物模型來研究神經(jīng)變性過程。 雖然存在繼發(fā)性療法(如，L-D0PA加脫羧酶抑制劑；溴麥角環(huán)肽，甲基多巴激動(dòng)劑培高利 特(pergolide)；以及諸如三己芬迪(安坦)的抗膽堿能藥)，但很清楚需要針對(duì)病因的 療法，如神經(jīng)保護(hù)療法，其真正地阻止了該病癥的發(fā)展。這些動(dòng)物模型業(yè)已用于測(cè)試自由 基清除劑、鐵螯合劑、多巴胺激動(dòng)劑、一氧化氮合酶抑制劑以及某些鈣離子通道拮抗劑的 有效性。在動(dòng)物模型以及患者中清楚可見細(xì)胞凋亡機(jī)制起作用(Mochizuki，等.(2001)， Proc. Natl. Acad. Sci. USA,98，10918-23，Xu 等.(2002)，Nat. Med.，8，600-6，Viswanath, 等.(2001)，J Neurosci.，21，9519-28，Hartmann，等.(2002)，Neurology，58，308-10)。這 些病理生理學(xué)涉及氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，也將帕金森氏癥置于另一種神經(jīng)變性病癥和中風(fēng) 之間。腦缺血可由多種原因引起，其減少腦血流量(CBF)并導(dǎo)致氧和葡萄糖喪失。另一 方面，外傷性腦損傷(TBI)涉及一種原發(fā)性機(jī)械撞擊，其通常導(dǎo)致顱骨骨折和腦軟組織突 然破裂，即血管和腦組織切斷并撕裂。這樣，依次觸發(fā)以分子和細(xì)胞反應(yīng)激活作用為特征的 級(jí)聯(lián)事件，導(dǎo)致繼發(fā)性損傷。上述繼發(fā)性損傷的進(jìn)展是一種活動(dòng)進(jìn)程，其中涉及許多生物化 學(xué)途徑(Leker和Shohami (2002), Brain Res. Rev.，39，55-73)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)在該導(dǎo)致半影局 部缺血區(qū)繼發(fā)性細(xì)胞死亡的有害途徑和在該區(qū)暴露于繼發(fā)性外傷后的損傷之間具有許多 相似點(diǎn)(如，過量谷氨酸鹽釋放所導(dǎo)致的興奮性中毒、一氧化氮、活性氧簇、炎癥以及細(xì)胞凋亡(Leker 和 Shohami (2002) ,Brain Res. Rev.，39，55-73))。此外，報(bào)道了在外傷性腦損 傷后早期局部缺血發(fā)作的偶發(fā)事件，對(duì)于原發(fā)性機(jī)械損傷而言增加了局部缺血癥狀。心血管疾病在西方工業(yè)化國家是主要的致死原因。在美國，每年大約有1百萬 人死亡，其中約50%是在醫(yī)院外發(fā)生的突發(fā)性事件(Zheng.等(2001)，Circulation, 104, 2158-63) ο每年，在每100，000個(gè)居住者中進(jìn)行了 40-90例心肺復(fù)蘇(CPR)，這些患 者中25-50%實(shí)現(xiàn)了自發(fā)循環(huán)恢復(fù)(R0SC)。然而，進(jìn)行成功的ROSC后出院率僅有2-10% (Bottiger,等.(1999)，Heart，82，674-9)。因此，每年在美國絕大多數(shù)心臟停搏患者無法 得到成功治療。在成功進(jìn)行CPR后，低生存率(即住院病人心臟停搏后的死亡率)的主要 原因是持續(xù)性腦損傷。在心循環(huán)停止后，腦損傷與缺氧負(fù)荷的短期耐受性以及特異性再灌 注病癥相關(guān)(Safar (1986), Circulation, 74, IV138-53, Hossmann (1993), Resuscitation, 26，225-35)。最初，更多患者在心循環(huán)停止后在血流動(dòng)力學(xué)上可能是穩(wěn)定的；然而，他們 中很多人由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷而死亡。在心臟停搏后腦損傷的個(gè)人、社會(huì)以及經(jīng)濟(jì)后 果是具有破壞性的。因此，在心臟停搏以及復(fù)蘇(“全身缺血和再灌注”)研究中一個(gè)最 重要結(jié)果是大腦復(fù)蘇和心臟停搏后大腦損害(Safar (1986), Circulation，74，IV138-53， Safari (2002), Crit Care Med，30，p. 140-4)。目前，無法減少對(duì)神經(jīng)元的原發(fā)性損傷， 即使用任何心臟停搏后的治療方法在心臟停搏期間由缺氧所引起的原發(fā)性損傷。主要的 病理生理學(xué)結(jié)果包括缺氧和繼發(fā)性壞死、具有自由基形成的再灌注損傷和細(xì)胞鈣流入、興 奮性氨基酸釋放、腦微循環(huán)再灌注病癥以及程序性神經(jīng)元死亡或細(xì)胞凋亡(Safar (1986)， Circulation, 74, IV138-53, Safar 等.(2002)，Crit Care Med，30，140-4)。一些臨床試驗(yàn)試圖改善心臟停搏后神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)果，但不成功。測(cè)試了巴比妥 酸鹽(增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用)或鈣通道阻滯劑(減少局部缺血再灌注損傷)的治療用途 (Group (1986)，Am. J. Emerg. Med.，4，72-86，Group (1986)，N. Engl. J. Med.，314，397-403， Group (1991)，ControlClin.Trials,12,525-45, Group (1991)，N. Engl. J.Med.，324， 1225-31)。迄今為止，在臨床條件下尚未有可用于改善心循環(huán)停止后神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)果的特效 心臟停搏后治療方案(可能的例外是輕度低溫以及溶栓，渴望期待其大量的、以及受控的 臨床試驗(yàn)結(jié)果(Safar等(2002)，Crit. Care Med.，30，140—4)。因此，關(guān)鍵在于要有一種用 于改善心臟停搏后神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)果的創(chuàng)新療法。多發(fā)性硬化癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性自身免疫性疾病原型，具有1/400的風(fēng)險(xiǎn) 率，在年輕的成年人中可能是神經(jīng)失能的最常見原因。在世界范圍內(nèi)，約有2-5百萬患者患 此病(Compston和Coles (2002), Lancet，359，1221-31)。如同所有的復(fù)雜疾病一樣，該病 癥起因于至今尚未鑒定的環(huán)境因素與易感基因之間的相互作用。這些因素共同觸發(fā)了級(jí)聯(lián) 事件，包括啟動(dòng)免疫系統(tǒng)、軸突和神經(jīng)膠質(zhì)的急性炎癥性損傷、功能恢復(fù)和結(jié)構(gòu)修復(fù)、炎癥 后神經(jīng)膠質(zhì)過多癥以及神經(jīng)變性。這些過程的相繼涉及構(gòu)成臨床過程的基礎(chǔ)，具有發(fā)作機(jī) 能性恢復(fù)、保留持續(xù)性缺陷發(fā)作以及繼發(fā)性進(jìn)展的特征。治療目的是要降低發(fā)生頻度和限 制復(fù)發(fā)的持續(xù)效果、減輕癥狀、預(yù)防起疾病發(fā)展為殘疾并促進(jìn)組織修復(fù)作用。抑郁癥是一種 常見的精神錯(cuò)亂，具有憂愁、喪失活動(dòng)興趣和精力減少的特點(diǎn)。抑郁癥區(qū)別于正常情緒的改 變是在于其嚴(yán)重程度、癥狀和病癥持續(xù)時(shí)間。自殺屬于抑郁癥一種常見的和常常不可避免 的結(jié)果。如果抑郁發(fā)作交替著夸張的情緒高漲或興奮增盛，則稱為雙相性精神障礙。在所 有自殺者中60%是由抑郁癥和精神分裂癥所引起。抑郁癥的原因眾多。社會(huì)心理因素，例如不利的生活條件，可能影響其發(fā)病和抑郁發(fā)作的持久性。遺傳和生物因素也起作用。估計(jì)當(dāng)前有1. 21億人患抑郁癥。抑郁癥是殘疾的主要誘因，可通過YLDs (勞力 喪失的壽命年)得到測(cè)定，并是2000年全球排名第四的疾病負(fù)擔(dān)(DALYs =殘疾修正壽命 年；由于早產(chǎn)兒死亡導(dǎo)致的可能的壽命損失和由于殘疾導(dǎo)致的生產(chǎn)壽命年限損失的總和年 限)。估計(jì)5. 8%的男子和9. 5%的婦女在一生中會(huì)經(jīng)歷抑郁發(fā)作。到2020年，估計(jì)抑郁癥 排到對(duì)所有年齡男女所計(jì)算的DALYs的第二位。在發(fā)展中國家，抑郁癥將是造成疾病負(fù)擔(dān) 的最主要原因。當(dāng)今對(duì)于大多數(shù)抑郁癥患者而言，最主要的療法包括抗抑郁藥物療法、心理療法 或兩者相結(jié)合的方法。興奮劑對(duì)于大部分的嚴(yán)重抑郁發(fā)作是有效的。當(dāng)前，有效的抗抑郁 療法與5-羥色胺能神經(jīng)傳遞的調(diào)節(jié)或細(xì)調(diào)密切相關(guān)。增加腦中5-羥色胺水平的藥物是已 知的最有效抗抑郁藥(例如氟苯氧丙胺、Prozac 或Fhictin )。此外，在患者中具有 抗抑郁效果的療法也包括諸如鋰的藥理學(xué)上抗抑郁藥、電驚厥治療和體育鍛煉。其他的干 預(yù)包括對(duì)于脆弱個(gè)體、家族和群組建立支援性的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。關(guān)于抑郁癥預(yù)防的數(shù)據(jù)資料無 法讓人確信，只有少數(shù)獨(dú)立的研究表明所建議的干預(yù)對(duì)于預(yù)防抑郁癥是有效的。重要的是 要考慮藥物存在的目的是在于減輕該疾病癥狀，而非針對(duì)最初所提出的引起該疾病的基本 病理生理學(xué)機(jī)制。因此，一種新療法必須能具體針對(duì)新發(fā)現(xiàn)的抑郁癥病因。精神分裂癥是一種最常見的精神疾病。每100人中約有1人(1%的人口)患精神 分裂癥。該病癥在全世界都有發(fā)現(xiàn)，并存在于所有種族和文化中?；季穹至寻Y的男性和女 性數(shù)量相等，雖然平均起來，男性看來似乎較女性更早產(chǎn)生精神分裂癥。一般來說，男性在 25、6歲時(shí)就顯示精神分裂癥的最初癥狀，而女性則在28、9歲時(shí)才顯示該最初癥狀。對(duì)于社 會(huì)而言精神分裂癥代價(jià)巨大，估計(jì)美國每年損失325億美元。精神分裂癥具有部分如下癥 狀錯(cuò)覺、幻覺、思維及言語紊亂、陰性癥狀(回避社交、缺少感情和表情、精力衰退、動(dòng)力和 活力降低)、緊張癥。對(duì)于精神分裂癥而言，其主要療法是基于神經(jīng)安定(neuropl印tics) 的療法，例如氯丙嗪、氟哌丁苯、奧氮平、氯氮平、甲硫噠嗪等等。然而，神經(jīng)安定療法常常 無法緩解所有精神分裂癥癥狀。而且，神經(jīng)安定療法可能具有嚴(yán)重副作用，例如遲發(fā)性運(yùn) 動(dòng)障礙。精神分裂癥的病因?qū)W尚不清楚，雖然好像是一種強(qiáng)遺傳作用。近來，其已明朗化， 即精神分裂癥至少具有神經(jīng)變性疾病的某些特征。具體而言，代謝率(MR)研究已顯示在 精神分裂癥患者中快皮層灰質(zhì)損失(Thompson，等.(2001)，Proc Natl Acad Sci USA，98， 11650-5 ； Cannon，等.(2002)，Proc Natl Acad Sci USA.，99，3228-33)。因此，批準(zhǔn)了使 用諸如GCSF或GMCSF或其他造血因子的神經(jīng)保護(hù)藥物療法來醫(yī)治精神分裂癥。在人類中存在著對(duì)增加認(rèn)知能力和提高智力方法的需要。相信在現(xiàn)代社會(huì)中“智 力”不局限于純粹的邏輯或語義能力。例如，HowardGardner的復(fù)雜智力理論從發(fā)展和人類 學(xué)的觀點(diǎn)來評(píng)價(jià)智力，給出了一種更廣泛的觀點(diǎn)，即包括運(yùn)動(dòng)、音樂、藝術(shù)和感情移入能力 以及語言/邏輯能力，也就是說更通常地與智力相關(guān)，并通過智商(IQ)測(cè)試得到測(cè)定。廣 義的智力也擴(kuò)展到創(chuàng)造力智力領(lǐng)域。此外，已知在人類中存在著非病理病癥，如ARML (與年 齡相關(guān)的記憶損失)或MCI (輕度認(rèn)知缺損)或ARCD (與年齡相關(guān)的認(rèn)知衰退)，通常開始 于大約40歲，不同于阿爾茨海默氏病早期癥狀。在整個(gè)成人期神經(jīng)元存在著生理學(xué)上損失，估計(jì)一天損失多達(dá)100，000個(gè)。在整 個(gè)成人期，腦重量和體積逐漸減小。每十年下降約2%。與早先所持有的看法相反，在50歲后該下降沒有加快，但是從成年早期起就延續(xù)著大約相同的速度。其累積效應(yīng)通常直到老 年期才受注意。雖然腦大小在收縮，但并非均勻收縮。某些結(jié)構(gòu)更易收縮。舉例來說，海馬和額葉， 這兩種涉及記憶的結(jié)構(gòu)常常變得更小。部分是因?yàn)樯窠?jīng)元損失，還有部分是因?yàn)槟承┥窠?jīng) 元萎縮。許多其他腦結(jié)構(gòu)在大小上并沒有受損。精神過程的減慢可能是由神經(jīng)元退化所引 起，不是它們損失、收縮就是失去聯(lián)系。其完全耗盡了神經(jīng)元功能，使得需要補(bǔ)充額外的神 經(jīng)元網(wǎng)狀構(gòu)造以應(yīng)付腦力工作，否則將簡單化或無意識(shí)化。因此，該過程減慢了。額葉的一部分，稱為前額皮層，涉及思維和行動(dòng)的監(jiān)測(cè)和控制。在該腦區(qū)域出現(xiàn)的 萎縮可用于解釋許多老年人所經(jīng)歷的言語困難。也可用于解釋忘記汽車鑰匙放在哪里或常 有的心不在焉。額葉和海馬的收縮被認(rèn)為是造成記憶困難的原因。因此，尚需改善或增強(qiáng) 個(gè)體的認(rèn)知能力。鑒于以上所述，需要對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病和/或精神疾病進(jìn)行治療，例如涉及可塑性 和機(jī)能恢復(fù)增強(qiáng)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞死亡。具體而言，需要通過對(duì)所涉及的神 經(jīng)細(xì)胞提供神經(jīng)保護(hù)作用來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明一個(gè)目的是提供一種治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病和/或精神病的方 法，該方法通過給予哺乳動(dòng)物造血因子，例如GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物及它 們組合物，或分泌GCSF或GMCSF或衍生物的細(xì)胞以治療所述疾病。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，該方法通過使 用諸如GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物及它們組合物的造血因子處理神經(jīng)干細(xì)胞 組合物，隨后將所述神經(jīng)干細(xì)胞給予哺乳動(dòng)物用于治療所述疾病。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種方法，用于鑒定能結(jié)合神經(jīng)元細(xì)胞上粒細(xì)胞集落刺 激因子受體(GCSFR)的化合物及，通過將神經(jīng)元細(xì)胞與所述化合物接觸激活神經(jīng)元細(xì)胞中 的STAT;并相對(duì)于沒有與所述化合物接觸的神經(jīng)元細(xì)胞中STAT激活作用，測(cè)量增加的STAT 激活作用，以及相對(duì)于例如GCSF介導(dǎo)的STAT激活作用，測(cè)定其激活作用。此外，通過該方 法獲得的化合物和使用所述化合物來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法也是本發(fā)明的額外目的。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種方法，用于鑒定能結(jié)合神經(jīng)元細(xì)胞上粒細(xì)胞巨噬細(xì) 胞集落刺激因子受體(GMCSFR)的化合物和/或，將通過將神經(jīng)元細(xì)胞與所述化合物接觸激 活神經(jīng)元細(xì)胞中STAT基因表達(dá)；并相對(duì)于沒有與所述化合物接觸的神經(jīng)元細(xì)胞中的STAT 基因激活作用，測(cè)量增加的STAT激活作用。此外，通過該方法獲得的化合物和使用所述化 合物來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法也是本發(fā)明的額外目的。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種方法，用于鑒定具有改良的神經(jīng)保護(hù)活性的GCSF 受體激動(dòng)劑，該方法通過將所述化合物與具有GCSF受體的神經(jīng)細(xì)胞接觸，測(cè)量所述化合物 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)效果，并將所述化合物的效果與GCSF的效果進(jìn)行比較。此外，通過 該方法獲得的化合物和使用所述化合物來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法也是本發(fā)明的額外目 的。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種方法，用于鑒定具有改良的神經(jīng)保護(hù)活性的GMCSF 受體激動(dòng)劑，通過將所述化合物與具有GMCSF受體的神經(jīng)細(xì)胞接觸，測(cè)量所述化合物對(duì)神
8經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)效果，并將所述化合物的效果與GMCSF的效果進(jìn)行比較。此外，通過該方 法獲得的化合物和使用所述化合物來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法也是本發(fā)明的額外目的。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種方法，用于鑒定具有改良的GCSF受體激動(dòng)劑活性 的化合物，通過將所述化合物與具有GCSF受體的神經(jīng)細(xì)胞接觸，比較所述神經(jīng)細(xì)胞和另一 種與GCSF接觸的神經(jīng)細(xì)胞中STAT基因表達(dá)水平。此外，通過該方法獲得的化合物和使用 所述化合物來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法也是本發(fā)明的額外目的。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種方法，用于鑒定具有改良的GMCSF受體激動(dòng)劑活性 的化合物，通過將所述化合物與具有GMCSF受體的神經(jīng)細(xì)胞接觸，比較所述神經(jīng)細(xì)胞和另 一種與GMCSF接觸的神經(jīng)細(xì)胞中STAT基因表達(dá)水平。此外，通過該方法獲得的化合物和使 用所述化合物來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法也是本發(fā)明的額外目的。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種通過激動(dòng)在細(xì)胞上存在的GCSF或GMCSF受體刺激 GCSF或GMCSF表達(dá)和/或在內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞中釋放的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì) 胞與能增加GCSF或GMCSF表達(dá)和/或釋放的物質(zhì)接觸。上述方法可使用用于如在神經(jīng)細(xì) 胞培養(yǎng)物中檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞中GCSF和/或GMCSF釋放或表達(dá)增加的測(cè)定法(如，PCR和/或 ELISA測(cè)定法)。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，該方法通過激 動(dòng)GMCSF受體、GCSF受體或兩者以治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高移植入哺乳動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞的生存率的方 法，該方法在將該細(xì)胞移植入哺乳動(dòng)物體內(nèi)之前，將一種或多種編碼GMCSF、GMCSF衍生物、 GCSF、GCSF衍生物和/或它們組合的多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，與導(dǎo)入所述多核苷酸前細(xì)胞生存 率相比，該細(xì)胞表達(dá)了足夠數(shù)量的造血因子從而提高了該細(xì)胞的生存率。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物生存力的方法，相對(duì)于在提供 所述造血因子之前的培養(yǎng)物，該方法通過提供GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF、GCSF衍生物和/ 或它們的組合增強(qiáng)了神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物生存力。在該方法中，所述造血因子可用于接觸所述 培養(yǎng)物細(xì)胞或可通過使用編碼并表達(dá)所述造血因子的多核苷酸來提供之。


圖1顯示了在體內(nèi)和體外GCSF有效的神經(jīng)保護(hù)作用。A，在局部腦缺血后GCSF 的神經(jīng)保護(hù)程度(肌原纖維細(xì)絲模型；大腦中動(dòng)脈閉塞，MCA0)，通過TTC染色測(cè)定。Y軸 值系所有大腦半球梗塞形成的百分?jǐn)?shù)(數(shù)據(jù)為均值士SD) ；T-檢驗(yàn)；p<0.05)。B，在通過 H202 (0 u M、400 u M、750 u M)提高氧化應(yīng)激下，在NGF處理的PC12細(xì)胞中進(jìn)行的細(xì)胞生存試 驗(yàn)。GCSF處理導(dǎo)致細(xì)胞生存率突出增加。比較起來，用一種已知的神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)——促紅 細(xì)胞生成素(EP0)處理所述細(xì)胞后的細(xì)胞生存率是給定的。Y軸相對(duì)的(Rel.)細(xì)胞生存 (熒光素酶活力光單位)。圖2A顯示了特異于小鼠GCSFR的RT-PCR。在腦組織中檢測(cè)出的GCSF-R RNA具有 期望的567bp大小。通過對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證該鑒定。圖2B顯示了 GCSF受體存在于PC12 細(xì)胞上。圖3具有代表性的GCSF-R免疫印跡。使用GCSF-R抗血清，在大鼠皮層中約130kDa 處檢測(cè)到條帶(泳道1)。另外的低分子量條帶最有可能反映了產(chǎn)物的斷裂。在抗血清與各自肽預(yù)吸收后，沒有條帶能被檢測(cè)到(泳道2)。圖4免疫組化顯示了 GSCF受體在小鼠不同腦區(qū)域(石蠟切片，2i!m)中的分布。 a-d 海馬中GCSF-R的定位。注意抗體主要染色了 CA3區(qū)域中的神經(jīng)元(a. b)，在CA3和CA2 區(qū)域具有光滑邊界(c，箭頭)。GCSF-R分布在體細(xì)胞和神經(jīng)元突起上(b，箭頭)。注意在齒 狀回的門和基底細(xì)胞層中存在受體(d，箭頭)。也在皮層區(qū)域檢測(cè)到GCSF-受體，如實(shí)施例 所述的梨狀皮層(e)和鼻周皮層(f)。在小腦中，標(biāo)記了浦肯野細(xì)胞(g，箭頭)。同樣，嗅 球中一些大僧帽細(xì)胞是GCSF-R陽性的(h，箭頭)。在脊髓前索中展示了強(qiáng)染色(i，j)，通 過高倍放大鑒定了大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元為GCSF-R陽性(k，1)。注意到神經(jīng)元突起被強(qiáng)標(biāo)記。在 中腦中，黑質(zhì)神經(jīng)元顯示了 GCSF-R陽性(m)。特別是，黑質(zhì)密部(SNC)所有神經(jīng)元都被標(biāo) 記(m和n中箭頭)。也同樣，在網(wǎng)質(zhì)部中，一些神經(jīng)元表達(dá)GCSF-R(o)。除神經(jīng)元外，白質(zhì) 束少突膠質(zhì)細(xì)胞也被染色，例如，在前連合(P，箭頭)中。令人驚奇的是，GCSF配體(抗體 scl3102, Santa Cruz)的染色與其受體(抗體sc694，Santa Cruz)的表達(dá)共區(qū)域化的(圖 4q-u)。證明了神經(jīng)元自身內(nèi)分泌機(jī)制作為一種保護(hù)性手段對(duì)抗傷害性刺激。在海馬中，觀 察到針對(duì)GCSF配體的相同子區(qū)域特異性(q :GCSFR, r :GCSF，箭頭指向子區(qū)域CA 2-3間邊 界，ca3和ca2標(biāo)記指出了該子區(qū)域)。該特異性與已知的這些區(qū)域抗局部缺血損傷的易感 性差異一致，并再次證明了 GCSF系統(tǒng)神經(jīng)保護(hù)作用。同樣，在齒狀回的門和顆粒下層中，觀 察到了同樣感興趣的表達(dá)譜(圖4s，GCSF受體；圖4t，GCSF;箭頭指向顆粒下層中一個(gè)神 經(jīng)元，標(biāo)記s 齒狀回的顆粒下層，h 齒狀回的門)，其強(qiáng)調(diào)了 GCSF系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)發(fā)生的重要 性，漂亮地類似于神經(jīng)球上受體和配體的表達(dá)(參見圖13)。感興趣的是，GCSF也在脊髓的 大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)(圖4u)，其受體也在那里表達(dá)(圖4i-l)。圖5顯示了對(duì)皮層(a，b)及海馬培養(yǎng)的神經(jīng)元(c，d)上GCSFR的染色。在體細(xì)胞 和神經(jīng)元突起上都存在該受體。并不是所有載玻片上的神經(jīng)元都被標(biāo)記?？贵w與各自肽預(yù) 溫育，或省略一級(jí)抗體時(shí)，將無法產(chǎn)生特異性染色(未顯示)。圖6和7顯示了使用抗STAT3抗體所獲得的免疫組化結(jié)果。圖6 :STAT3免疫組化。 注意，相比較安慰劑處理的動(dòng)物皮層梗塞周圍區(qū)域(a，箭頭；左梗塞；右半影；最初放大 倍率x 200)，GCSF處理的大鼠皮層半影中許多神經(jīng)元細(xì)胞核是陽性染色(b，箭頭)。圖7: 在GCSF處理的動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物中，對(duì)梗塞形成(IL)附近未受影響的對(duì)側(cè)(CL)和同側(cè)皮層 神經(jīng)元定量。通過計(jì)數(shù)具有STAT3核易位的神經(jīng)元定量，在GCSF處理組中梗塞形成附近神 經(jīng)元中存在STAT3明顯激活(p < 0. 05，t檢驗(yàn))。圖8顯示了在腦缺血的光誘導(dǎo)血栓形成孟加拉玫瑰紅模型中GCSF處理的效果。A， 旋轉(zhuǎn)行為；B，神經(jīng)學(xué)得分，包括beam平衡；C，D 膠帶移除測(cè)試，在同側(cè)(C)和對(duì)側(cè)⑶上 測(cè)定。圖例局部缺血大鼠局部缺血組，未處理；局部缺血+GCSF 用GCSF處理的大鼠局 部缺血組；模擬手術(shù)(sham)+GCSF 模擬手術(shù)動(dòng)物，用GCSF處理；sham 模擬手術(shù)動(dòng)物，未處 理。L:對(duì)左爪的膠帶移除測(cè)試；R:對(duì)右爪的膠帶移除測(cè)試。注意在膠帶移除測(cè)試(C，D)中 兩側(cè)都有影響，當(dāng)膠帶位于工作側(cè)時(shí)，可能是顯性運(yùn)動(dòng)缺陷所致，以及當(dāng)膠帶位于對(duì)側(cè)時(shí)， 為顯性傳感缺陷所致。圖9顯示了在孟加拉玫瑰紅模型中，在光誘導(dǎo)血栓形成誘導(dǎo)了對(duì)側(cè)局部缺血48小 時(shí)后，GCSF-受體的上調(diào)。A，大鼠腦冠狀縫切面圖解，相較于來自模擬手術(shù)大鼠相同的組織 樣本，在組織樣本3和4中定量GCSF受體mRNA。B，在皮層半影樣本(來自A的樣本3和
104)中定量GCSF受體mRNA。在局部缺血誘導(dǎo)6小時(shí)后，工作側(cè)出現(xiàn)了上調(diào)；接著在梗塞48 小時(shí)后，對(duì)側(cè)出現(xiàn)上調(diào)。該對(duì)側(cè)上調(diào)也見于GMCSF受體(見下)。圖10顯示了來自不同物種的GCSF的序列比對(duì)，使用了 ClustalW算法(SEQ ID NOS 28-33) (MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin)。圖11顯示了小鼠和人GCSF受體及大鼠GCSF受體片段的序列比對(duì)，使用了 ClustalW 算法(SEQ ID NOS :34_36) (MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin)。圖12通過RT_PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)證實(shí)了在成體神經(jīng)元干細(xì)胞(nsc)上存在GCSF 受體。所顯示的是瓊脂糖凝膠。泳道1:分子量標(biāo)記；泳道2:來自神經(jīng)元干細(xì)胞(nsc)的 PCR產(chǎn)物，可見大鼠GCSFR特異性條帶(279bp)；泳道3:陰性對(duì)照。圖13證實(shí)了在神經(jīng)干細(xì)胞上存在GCSF受體和GCSF。A.神經(jīng)球的DAPI染色，在 所有細(xì)胞中均可見，B.用抗GCSF受體的抗體進(jìn)行相同的神經(jīng)球染色，C.D.用DAPI (C)和 GCSF抗體(D)的神經(jīng)球染色。圖14證實(shí)了在向小鼠腹膜內(nèi)注射后，生物素化GCSF快速吸收。A.來自在注射 7. 5yg GCSF/小鼠后1、2、4、6、20、28小時(shí)處死的小鼠血清的蛋白質(zhì)印跡。B.在腹腔注射 GCSF后，血清的ELISA。GCSF從腹膜快速吸收，在2小時(shí)處具有血清峰值水平，證實(shí)了其給 藥途徑的適用性。圖15顯示了在局部缺血的同側(cè)和對(duì)側(cè)上，在光誘導(dǎo)血栓形成(孟加拉玫瑰紅模 型)后，證實(shí)GMCSF受體的上調(diào)mRNA。A顯示了示意性的小鼠腦冠狀縫切面，感興趣區(qū)域用 灰色標(biāo)記；B顯示了 RMDD凝膠切片，鑒定了 GMCSF受體轉(zhuǎn)錄物正受調(diào)節(jié)。泳道代表小鼠腦 RNA樣品上的RT-PCR產(chǎn)物。樣品取自在中風(fēng)后不同時(shí)間點(diǎn)的皮層半影(分別為A中的3和 4)。圖16顯示了通過應(yīng)用LightCycler系統(tǒng)的RT-PCR驗(yàn)證GMCSF受體在孟加拉玫瑰 紅模型中48小時(shí)處的上調(diào)。樣品取自光誘導(dǎo)血栓形成后6小時(shí)、48小時(shí)和21天，并與模擬 手術(shù)動(dòng)物誘導(dǎo)水平進(jìn)行比較。在同側(cè)半球上，在皮層局部缺血初期GMCSF受體上調(diào)最大并 穩(wěn)定下降直至第21天。在相應(yīng)的對(duì)側(cè)皮層樣品上，在梗塞2天后很明顯上調(diào)最多，其仍然 適度地下調(diào)直至第21天。該對(duì)側(cè)調(diào)節(jié)圖使人聯(lián)想到GCSF受體(見前)。圖17顯示了人、小鼠GMCSF受體和鑒定為上調(diào)轉(zhuǎn)錄物的大鼠序列的序列比對(duì)(SEQ ID NOS :22、23 禾口 24) (ClustalW 算法，MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin。從該同源性結(jié) 果推斷出所鑒定的序列是大鼠GMCSF受體。圖18顯示了人、小鼠和大鼠GMCSF的序列比對(duì)(SEQ ID NOS :25、26和27) (ClustalW 算法，MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin)。圖19免疫組化顯示了 GMCSF受體α (a-d)和GMCSF (e_g)在小鼠不同腦區(qū)域(石 蠟切片，2μπι)中分布，a:在小腦中，標(biāo)記了浦肯野細(xì)胞(箭頭)。b-d:海馬中GMCSF受體 α定位。注意在齒狀回的門中存在該受體(b，箭頭)?？贵w主要地染色了 CA3區(qū)(c)中 的神經(jīng)元，在CA3和CA2區(qū)之間具有的光滑邊界(c，箭頭)。GMCSF受體α分布在體細(xì)胞 (CA3)和神經(jīng)元(CA2)突起上。也在內(nèi)嗅區(qū)皮層(d)中檢測(cè)到GMCSF受體。GMCSF顯示與 GMCSF受體α相似的分布。注意GMCSF抗體也染色浦肯野細(xì)胞(e，箭頭)，CA3區(qū)中神經(jīng)元 (f)，在CA3和CA2區(qū)之間具有的光滑邊界(f，箭頭)和內(nèi)嗅區(qū)皮層神經(jīng)元(g)。圖19h-m 顯示了于此令人驚奇的神經(jīng)元中GMCSF受體及其配體的共區(qū)域化。h. GMCSF受體(抗體
11sc690, SantaCruz)在海馬子區(qū)CA3神經(jīng)元中的定位，箭頭指向鄰接CA2區(qū)的光滑表達(dá)邊界。 i.GMCSF配體(抗體SC13101)顯示了相同的子區(qū)表達(dá)特異性，箭頭指向CA3區(qū)中的神經(jīng) 元。j.齒狀回的門和顆粒下層中GMCSF受體的表達(dá)。箭頭指向顆粒下層神經(jīng)元。k.在該 區(qū)域中GMCSF配體的表達(dá)。在這里，配體顯示了與其受體略有不同的表達(dá)。在CA3區(qū)中具 有明顯的表達(dá)(箭頭)，但在齒狀回區(qū)中很少表達(dá)。l，m:GMCSF受體⑴和配體(m)在脊髓 大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)。該令人驚奇的表達(dá)清楚地指出GMCSF系統(tǒng)用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的治 療適用性，特別是對(duì)于肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。圖20顯示了對(duì)神經(jīng)元皮層培養(yǎng)物上GMCSF受體a的染色。該受體在體細(xì)胞和神 經(jīng)元突起上都存在(通過用抗核表位NeuN的抗體和抗突觸素抗體雙標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，其不包 括在該圖中)。將抗體與各自肽預(yù)溫育，或省略一級(jí)抗體不會(huì)產(chǎn)生特異性染色(未顯示)。圖21通過RT-PCR證實(shí)了在成體神經(jīng)元干細(xì)胞(nsc)和PC12細(xì)胞(PC12)上存在 GMCSF受體a。所示的是瓊脂糖凝膠。泳道1 分子量標(biāo)記(M)；泳道2 對(duì)神經(jīng)元干細(xì)胞 (nsc)PCR ；泳道3 對(duì)PC12細(xì)胞(PC12)PCR ；泳道4 陰性對(duì)照(neg)。在泳道2和3可見大 鼠GM-CSF受體a特異性條帶(176bp)。圖22通過免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)了在成體神經(jīng)元干細(xì)胞(nsc)上存在GMCSF受體a。 所顯示的是一種用DAPI染色的神經(jīng)球(A.染色所有細(xì)胞核)，及特異于GMCSF受體的抗體 ⑶(放大倍率10x)。圖23證實(shí)了體外GMCSF有效的神經(jīng)保護(hù)作用。在H202 (0 u M、400 u M、750 u M)誘導(dǎo) 增加的氧化應(yīng)激條件下，在NGF處理的PC12細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞生存測(cè)定。GMCSF處理后細(xì)胞 生存產(chǎn)生驚人增加。相比較，給出了用一種特定的已知神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)促紅細(xì)胞生成素(EP0 ； 0. 5U/ml)處理后細(xì)胞生存情況Y-軸相對(duì)細(xì)胞生存(熒光素酶活性光單位)。圖24顯示了與未給予G-CSF相比(對(duì)照)當(dāng)在局部缺血發(fā)作后120分鐘，由靜脈 內(nèi)給予G-CSF對(duì)大鼠MAC0模型梗塞體積的效果。圖25顯示了在海馬和皮層中對(duì)G-CSF受體和G-CSF進(jìn)行TTC-染色。數(shù)據(jù)顯示在 海馬(a_c齒狀回，d-f門)和皮層(g-i)中，GCSF受體(a，d，g)顯示了與其配體(b，e, h) 的共區(qū)域化。圖26顯示了在海馬的齒狀回(a-c)、門(d_f)以及皮層(g_i)中，G-CSF和GM-CSF 受體共表達(dá)于神經(jīng)元上。在海馬和皮層(c，f，i)中GCSF受體(a，d，g)和GMCSF受體(b， e,h)在相同的神經(jīng)元上表達(dá)。圖27顯示了神經(jīng)元中G-CSF通過激活stat3具有抗細(xì)胞凋亡活性。圖28 (部分I和部分II) A在同側(cè)和對(duì)側(cè)局灶性缺血2和6小時(shí)后，GCSF顯示了 十分強(qiáng)的上調(diào)，而6小時(shí)后受體則適度調(diào)節(jié)(B)，誘導(dǎo)的GCSF表達(dá)并不特異于MCA0模型，但 在全腦缺血中可見，盡管程度較小(C)。圖29顯示了梗塞半影中的G-CSF及其受體(孟加拉玫瑰紅)。圖30顯示了 GCSF受體(a，d，g)和雙皮質(zhì)激素(b，e, h)在海馬齒狀回(a_f)和 門(g-i)的神經(jīng)元上表達(dá)。圖31顯示了在GCSF處理4天后，神經(jīng)元標(biāo)記物NSE和0 III-微管蛋白強(qiáng)烈和濃 度依賴性的上調(diào)。依賴于GCSF-濃度，PLP和GFAP適度調(diào)節(jié)。誤差條顯示了標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算 了 3倍連續(xù)稀釋的cDNA樣品，反映了測(cè)量的可靠性。
圖32顯示了在腦中GMCSF及其受體的共區(qū)域化。GMCSF受體(a，d，g)和GMCSF(b， e,h)在齒狀回(a-c)、門(d-f)和皮層(g-i)的神經(jīng)元上共區(qū)域化。圖33顯示了通過腦缺血上調(diào)GMCSF及其受體。圖34顯示了 GMCSF受體(a，d，g)和雙皮質(zhì)激素(b，e, h)在海馬的齒狀回(a_c) 和門(d-i)的神經(jīng)元上表達(dá)。圖35顯示了神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能和分化細(xì)胞的特異性標(biāo)記物表達(dá)，以及用10mg/ ml GMCSF處理神經(jīng)干細(xì)胞引起0 III-微管蛋白顯著的誘導(dǎo)表達(dá)(n = 3 ;p < 0. 05，雙側(cè)t 檢驗(yàn))并導(dǎo)致更低程度的NSE，一種用于成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物(B)。圖36顯示了 G-CSF通過血腦屏障(BBB)。圖37顯示了 GM-CSF通過血腦屏障(BBB)。圖38顯示了 G-CSF用于治療肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)的功效。圖39顯示了在嚙齒動(dòng)物帕金森氏癥(PD)模型中GSR；的功效。圖40顯示了在神經(jīng)元中GMCSF通過激活stat3途徑產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡活性，部分I 顯示了 GMCSF抑制PARP裂解，該裂解是細(xì)胞凋亡中特異性發(fā)生的。通過使用NO-供體N0R-3 在初級(jí)神經(jīng)元中誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡。部分II顯示了 GMCSF并不導(dǎo)致增加的STAT1 (“pSTATl”) 或STAT5(“pSTAT5”)磷酸化，盡管該蛋白自身在神經(jīng)元中有表達(dá)。部分III A顯示了 GMCSF 導(dǎo)致STAT3時(shí)間依賴性激活，在GMCSF刺激后5分鐘達(dá)到最大。B,三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的量化。C， 通過磷酸化激活的STAT3可為JAK2抑制劑AG490所抑制。部分IV顯示了 GMCSF強(qiáng)烈誘導(dǎo) stat3靶基因Bcl2和Bel XI表達(dá)。已知這些基因是抗細(xì)胞凋亡的。圖41證實(shí)了在GMCSF處理的動(dòng)物中，既在窗口早期(部分I)，也在3小時(shí)的窗口 晚期(部分II)，梗塞體積明顯減小。
具體實(shí)施例方式GCSF眾所周知粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)是一種生長因子?？捎糜诒疚拿枋龅陌l(fā)明 方法的GCSF是那些已知并可獲得的全長編碼序列、蛋白質(zhì)序列和多種功能變體、突變蛋白 及模擬物。在如下討論中，這些稱為GCSF衍生物。編碼DNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及用于重組生產(chǎn)哺乳動(dòng)物多能性粒細(xì)胞集落刺激因 子的方法業(yè)已清楚(TO 87/01132 ；美國專利4，810，643)。例如，一些相應(yīng)于G-CSF的氨基 酸序列示于圖10和序列表中，即SEQID N0S :28、29、30、31、32和33。在一個(gè)實(shí)施方案中，與此處描述的全長人GCSF氨基酸序列具有至少70%，優(yōu)選至 少80%，更優(yōu)選至少90%的同一性的蛋白質(zhì)可用于本發(fā)明，如SEQ ID N0:28。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述可被使用的GCSF由是那些與野生型全長人GCSF編碼序列具有至少70 %， 優(yōu)選80%，更優(yōu)選至少90%、95%和97%的同一性的多核苷酸序列，如編碼SEQ ID NO 28 的多核苷酸所編碼的，這些多核苷酸可在嚴(yán)格條件下與編碼野生型全長人GCSF的多核苷 酸序列雜交。術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”包括在多核苷酸與其靶序列雜交下所 涉及的條件，較與其他序列雜交具更高的可檢測(cè)程度(如，至少超過背景2倍)。嚴(yán)格條 件可以是那些在PH 7. 0-8. 3及對(duì)于短探針(如，10-50個(gè)核苷酸)溫度為至少約30°C和 對(duì)于長探針(如，多于50個(gè)核苷酸)溫度為至少約60°C下，其中鹽濃度低于約1. 5M鈉離子，通常約0.01-1. OM鈉離子濃度(或其他鹽)的條件。例如，高嚴(yán)格條件包括于37°C在 50%甲酰胺、IM NaCl、l% SDS中雜交，并于60-65°C在0. IX SSC中洗滌(參見Tijssen， Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology__Hybridization with nucleic Probes, Part I, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicprobe assays，，，Elsevier, New York(1993)；禾口 Current Protocols inMolecular Biology,Chapter 2, Ausubel,等·，編·，Greene Publishingand ffiley-Interscience, New York(1995))。氨基酸和多核苷酸同一性、同源性和/或相似性 的測(cè)定可使用 ClustalW 算法(MEGALIGN ，Lasergene, Wisconsin)。多種GCSF功能變體、突變蛋白和模擬物的實(shí)例包括功能片段和變體(如， 結(jié)構(gòu)和生物學(xué)上類似于野生型蛋白質(zhì)的和具有至少一個(gè)生物學(xué)上等價(jià)結(jié)構(gòu)域的)、 GCSF的化學(xué)衍生物(如，包含額外化學(xué)部分的，例如聚乙二醇和其聚乙二醇衍生物， 和/或諸如Lenogastrim 的糖基化形式)和GCSF的肽模擬物(如，在結(jié)構(gòu)和/或 功能上模擬肽的低分子量化合物(參見，如，Abell, Advances in Amino Mimetics andPeptidomimetics, London JAI Press (1997) ；Gante, Peptidrraimetica-massgesch neiderte Enzyminhibitoren Angew. Chem. 106 1780-1802(1994)和 Olson 等.,Τ. Med. Chem. 36 :3039_3049(1993))。GCSF衍生物的額外實(shí)例包括白蛋白和GCSF的融合蛋白(Albugranin )，或諸如 那些描述于美國專利6261250號(hào)的融合修飾物；PEG-GCSF綴合物和其他的聚乙二醇化形 式那勝描述于 W000/44785 和 Viens 等.，J :of Clin. Oncology, VI.，Nr. 1,2002 24-36 的；GCSF的正亮氨酸類似物，那些描述于美國專利5，599，690號(hào)的；GCSF模擬物，諸如那 些描述于 WO 99/61445、WO 99/61446 和 Tian 等·，Science, Vol. 281，1998 :257_259 的； GCSF突變蛋白，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸已被修飾、缺失或插入，如美國專利5，214，132號(hào)和 5，218，092號(hào)所描述；那些描述于美國專利6，261，550號(hào)和4，810，643號(hào)的GCSF衍生物；以 及嵌合分子，其包含全長或部分GCSF和其他序列片段，如來可司亭(Leridistim)-參見， 例如，Streeter,等.(2001)Exp. Hemato. ,29,41-50, Monahan.等.(2001)Exp. Hematol.， 29,416-24.，Hood,等.(2001)Biochemistry,40,13598-606, Farese 等.(2001)Stem Cells, 19,514-21, Farese.等.(2001) Stem Cells, 19, 522-33, MacVittie,等.(2000) Blood, 95，837-45。此外，GCSF衍生物包括那些在第17、36、42、64和74位具有半胱氨酸 的具有174個(gè)氨基酸的種類(SEQ ID NO :37)或具有175個(gè)氨基酸的那些，額外的氨基酸 是N-末端甲硫氨酸(SEQ IDNO 38)為其他氨基酸所取代的，(諸如絲氨酸)，如美國專 利6，004，548所描述的，在第1位(N-末端)具有丙氨酸的GCSF ；如EP 0 335 423所述 具有GCSF活性的但在多肽中至少一個(gè)氨基基團(tuán)被修飾的；如EPO 272 703所述的在蛋白 的N-末端具有氨基酸取代或缺失的GCSF衍生物；如EP 0 459 630所述的具有天然存在 GCSF的至少一種生物學(xué)特性的天然存在的GCSF衍生物，其在5mg/ml下溶液穩(wěn)定度至少為 35%，所述衍生物中，至少天然序列的Cys17為Ser17殘基所取代，天然序列的Asp27為Ser27 殘基所取代；如EP 0 459 630所述一種修飾的編碼GCSF的DNA序列，其中N-末端被修飾 用于增強(qiáng)蛋白在重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)，而不改變蛋白的氨基酸序列；如EP 0 243 153所 述一種通過對(duì)至少一個(gè)酵母KEX2蛋白酶加工位點(diǎn)失活而修飾的GCSF用于增加使用酵母的 重組產(chǎn)物的產(chǎn)率；如美國專利號(hào)4，904，584所述賴氨酸改變的蛋白質(zhì)；如TO/9012874 (US5，166，322)所述半胱氨酸改變的蛋白質(zhì)變體；如AU-A-10948/92所述向GCSF分子任一末 端添加氨基酸用于幫助分子在原核表達(dá)后折疊；如AU-A-76380/91所述在GCSF的第50-56 位 Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile(SEQ ID NO 11)序列用 174 個(gè)氨基酸取代(SEQ ID NO: 37)，在GCSF的第53-59位用177個(gè)氨基酸取代(SEQ ID NO :39)，或/和在成熟GCSF的四 個(gè)組氨酸殘基位置43、79、156和170至少之一用174個(gè)氨基酸取代(SEQID N0:37)，或在 成熟 GCSF 的位置 46、82、159 或 173 用 177 個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 39)；如 GB 2 213 821 所 述以及將合成的GCSF-編碼核酸序列摻入限制性酶切位點(diǎn)以促進(jìn)所選擇區(qū)域的盒式誘變， 摻入側(cè)面限制性酶切位點(diǎn)以促進(jìn)將該基因整合入期望的表達(dá)系統(tǒng)。G-CSF類似物的更多實(shí) 例包括SEQ ID N0S:64和65，以及其他描述于美國專利號(hào)6，632，426中的。上述內(nèi)容在此 并入作為參考。所述各種GCSF的功能衍生物、變體、突變蛋白和/或模擬物優(yōu)選保留野生型哺乳 動(dòng)物GCSF活性的至少20 %，優(yōu)選50 %，更優(yōu)選至少75 %和/或最優(yōu)選至少90 %的生物活 性——生物活性的量包括 25%、30%、35%、40%、45%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%, 95% ；以及所有它們之間的所有值和子區(qū)間。此外，相對(duì)于野生型哺乳動(dòng)物GCSF活 性，所述功能衍生物、變體、突變蛋白和/或GCSF模擬物也可具有100%或更高的生物活 性——生物活性的量包括至少105%、至少110%、至少125%、至少150%和至少200%。一些已知測(cè)定法可單獨(dú)或結(jié)合用于測(cè)定GCSF生物活性。一個(gè)測(cè)定GCSF功能的 實(shí)例闡述于實(shí)施例1中。其他用于測(cè)定GCSF功能的方法也是已知的，包括使用鼠骨髓 細(xì)胞的集落形成測(cè)定法；通過G-CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞的增殖刺激；基于G-CSF生長或依 賴于 GCSF 的細(xì)胞系(如 AML-193、32D、BaF3、GNFS-60、HL-60、MI、NFS-60、OCI/AMLla 和 WEHI-3B)的特異性生物測(cè)定法。這些及其他測(cè)定法描述于Braman等.Am. J Hematology 39:194-201 (1992) ;CloRston CL 等 Anal Biochem 202:375-83(1992) ;Hattori K 等 Blood 75 1228-33 (1990) ;Kuwabara T^.Journal of Pharmacobiodyn 15:121—9(1992)； Motoiima H 等 Journal of Immunological Methods 118:187-92(1989); Sallerfors B 禾口 Olofsson European Journal of Haematology 49 199-207(1992) :Shorter SC 等 Immunology 75 468-74 (1992) ；Tanaka H 禾口 Kaneko Journal of Pharmacobiodyn. 15 359-66(1992) ;Tie F 等 Journal of Immunological Methods 149 115-20(1992)； ffatanabe M 等 Anal. Biochem. 195 :38_44(1991)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述GCSF被修飾或設(shè)計(jì)，或作為GCSF模擬物，以增加其通過 血腦屏障的能力，或改變其在腦組織中的分配系數(shù)。上述修飾的一個(gè)實(shí)例是添加PTD或 TAT 序列(Cao 等.(2002) J. Neurosci. 22 :5423_5431 ；Mi 等 (2000)Mol. Ther. 2 :339_347 ； Morris 等.(2001)Nat Biotechnol 19 1173-1176 ；Park 等,(2002)J Gen Virol83 1173-1181)。也可使用這些序列的突變形式，并在蛋白質(zhì)氨基或羧基末端添加額外的氨基 酸。除此之外，將緩激肽或類似物添加到任何靜脈內(nèi)施用的GCSF制備物中將有助于其遞 送至腦或脊髓(Emerich 等.(2001)Clin Pharmacokinet 40 105-123 ;SieRal 等(2002) CIinPharmacokinet 41:171—186)。GM-CSF眾所周知，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)是一種生長因子(參見，如圖 18、SEQ ID N0S :25、26和27)。此處描述的可用于本發(fā)明方法中的GMCSF是那些全長編碼序列、蛋白質(zhì)序列和各種功能變體、嵌合蛋白、突變蛋白及已知并可獲得的模擬物，例如聚 乙二醇化形式或白蛋白偶聯(lián)形式。編碼DNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和用于重組生產(chǎn)哺乳動(dòng)物多能 性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的方法是已知的(美國專利5，641，663)。所述GMCSF受體 也已知并描述于，例如，美國專利5，629，283中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)與可應(yīng)用于本發(fā)明中的全長人GMCSF氨基酸序列 具有至少70 %，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可使 用的GMCSF是由那些與野生型全長人GMCSF編碼序列具有至少70 %、優(yōu)選80 %、更優(yōu)選至 少90%、95%、97%和98%同一性的多核苷酸序列，如編碼SEQ ID NO :25的多核苷酸所 編碼的，這些多核苷酸可在嚴(yán)格條件下與野生型全長人GMCSF編碼多核苷酸序列雜交。術(shù) 語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”涉及包括多核苷酸與其靶序列雜交的可檢測(cè)程度遠(yuǎn)大 于其他序列(如，至少超過背景2倍)的條件。嚴(yán)格條件可以是那些在pH 7. 0-8. 3及對(duì) 于短探針(如，10-50個(gè)核苷酸)溫度為至少約30°C，和對(duì)于長探針(如，多于50個(gè)核苷 酸)溫度為至少約60°C下，其中鹽濃度低于約1. 5M鈉離子，通常約0. 01-1. OM鈉離子濃 度(或其他鹽)的條件。例如，高嚴(yán)格條件包括于37°C在50%甲酰胺、IM NaClU % SDS 中雜交，并于 60-65 °C 在 0. IX SSC 中洗滌(參見，Tiissen, Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with nucleticProbes, Part I, Chapter 2" Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic probe assays " , Elsevier, New York(1993)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel,等.，編·，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York (1995))。氨基酸和多核苷酸同一性、同源性和/或相似性的測(cè)定可使用ClustalW 算法(MEGALIGN ，Lasergene，Wisconsin)。多種GMCSF功能衍生物、變體、突變蛋白和/或模擬物優(yōu)選保留至少20%、優(yōu)選 50%、更優(yōu)選至少75%，和/或最優(yōu)選至少90%的野生型哺乳動(dòng)物GMCSF生物活性，所述生 物活性的數(shù)量包括 25%,30%,35%,40%,45%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%, 95%和它們之間所有的值和子區(qū)間。此外，相對(duì)于野生型哺乳動(dòng)物GMCSF活性，所述GMCSF 功能衍生物、變體、突變蛋白和/或模擬物也可具有100%或更高的生物活性，所述生物活 性的數(shù)量包括至少105%、至少110%、至少125%、至少150%和至少200%。GMCSF衍生物、更優(yōu)選GMCSF-模擬物用于實(shí)施本發(fā)明，優(yōu)選保留其神經(jīng)元保護(hù)潛 力并也減少對(duì)白細(xì)胞的作用，因此減少了潛在的不利效應(yīng)。GMCSF衍生物，優(yōu)選GMCSF-模擬 物，可在體外神經(jīng)保護(hù)測(cè)定法中受測(cè)試，如實(shí)施例17所描述。在該測(cè)定法中證明具有陽性 神經(jīng)保護(hù)效果的物質(zhì)可進(jìn)一步測(cè)試其免疫調(diào)節(jié)活性。一些已知的測(cè)定法可單獨(dú)或結(jié)合用于測(cè)定GMCSF的生物活性。那些GMCSF功能包 括其已知的免疫調(diào)節(jié)功能和與其在神經(jīng)保護(hù)中所起作用相關(guān)的一種或多種功能。其他用于 測(cè)定GMCSF功能的方法包括，例如通過開發(fā)包含巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和巨 核細(xì)胞的集落測(cè)定法；在使用細(xì)胞系的特異性生物測(cè)定法中，細(xì)胞系取決于它們?cè)贕M-CSF 存在下的生長能力或?qū)υ撘蜃拥膽?yīng)答(如，細(xì)胞系A(chǔ)ML-193、B6SUt-A、BACl. 2F5、BCLl、Da、 FDCP1、GF-D8、GM/S0、IC_2、M07E、NFS-60、PT-18、TALL-103、TF-1、UT-7)。這些和其他測(cè)定 法描述于 Cebon J 等 Blood 72 1340-7 (1988) ;KatzenNA 等 European Cytokine Network 3:365-72(1992) Lewis CE 等 Journal of Immunological Methods 127:51-9(1990);
16Mortensen BT 等 Experimental Hematology 21 1366-70(1993) :0ez S 等 Experimental Hematology 18 :1108-11 (1990) :Roncaroli F 等 Tournal of Immunological Methods 158:191-6(1993) ;Sallerfors B 禾口 OlofssonEuropean Journal of Haematology 49: 199-207(1992) :Zenke G 等 Tournal of Immunoassay 12 185-206 (1991)中。也優(yōu)選的是GMCSF的修飾或制劑，或能增加其通過血腦屏障能力的模擬物，或改 變其在腦組織中分配系數(shù)的模擬物。上述修飾物的一個(gè)實(shí)例是添加蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD) 或 TAT 序列(Cao G,等(2002)T Neurosci. 22 :5423_5431 ；Mi Z 等(2000)Mol. Ther. 2 339-347 ； Morris 等(2001)Nat Biotechnol 19 1173-1176 Park 等(2002)JGen Virol 83 :1173-1181)。這些序列也可在突變型中使用，將附加的氨基酸添加至蛋白的氨基或羧 基末端處。除此之外，向任何靜脈內(nèi)應(yīng)用的GMCSF制備物中添加緩激肽或類似物質(zhì)會(huì)有助 于將其遞送至腦或脊髓(Emerich 等(2001)Clin Pharmacokinet 40:105-123 :Siegal 等 (2002)Clin Pharmacokinet 41:171-186)。不同適合形式和衍生物的實(shí)例是沙格司亭( Leukine ; Prokine w), Leucotropin 或莫拉司亭(Leucomax ).業(yè)已在分離的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中檢測(cè)到 GMCSFR mRNA(Sawada,等.(1993), Neurosci Lett，160，131-4) :Baldwin,等 (1993)， Blood，82，3279-82)。業(yè)已顯示GMCSF刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖(Guillemin,等.(1996)， Glia，16，71-80)。GMCSF也誘導(dǎo)來自小膠質(zhì)細(xì)胞的白介素6的釋放(Suzumura,等.(1996)， Brain Res，713，192-8)。近來，有出版物顯示了白介素1能增加神經(jīng)元細(xì)胞系NT2中GMCSF 蛋白產(chǎn)量(Dame，等.(2002)，Eur Cytokine Netw，13，128-33)。在來自人胎兒的材料中， 對(duì)胎兒中GMCSF受體表達(dá)進(jìn)行的全面搜索顯示了 GMCSFR在腦中存在(Dame!. (1999)， Pediatr Res，46，358-66)。Dame等從他們的發(fā)現(xiàn)中推斷，GMCSF在胎兒神經(jīng)發(fā)育中可起作 用，并在成人腦中起免疫監(jiān)視作用。重要的是，他們并沒有提及任何可能相關(guān)的疾病，特別 是沒有涉及神經(jīng)保護(hù)作用。GMCSF在體外增加膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性(SN6. 10. 2. 2細(xì)胞系 和培養(yǎng)的小鼠中隔神經(jīng)元)以及在體內(nèi)增加傘-穹隆切斷后大鼠膽堿能中隔神經(jīng)元損害的 生存率(Kamegai，等.(1990), Brain Res，532，323-5.) (Konishi.等.(1993), Brain Res, 609，29-35)。重要的是，該發(fā)現(xiàn)僅適合某一亞型的神經(jīng)元，根據(jù)作者描述并不能推廣用于其 他類型神經(jīng)元或神經(jīng)細(xì)胞。從這些數(shù)據(jù)中，他們并沒有推出GMCSF的普遍神經(jīng)保護(hù)特性，也 沒有提及任何可能的治療適用性。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中添加高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)后， GMCSF上調(diào)(Li，等.(1998)，Mol Med，4，46-60)。業(yè)已顯示了 GMCSF能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞體 外增殖(Lee，等.(1994)，Glia，12，309-18)。近來，業(yè)已發(fā)現(xiàn)在患阿爾茨海默氏病的患者腦 脊液(csf)中 GMCSF 水平提高(Tarkowski，等.(2001)，Acta Neurol Scand, 103，166-74)。 也已在中風(fēng)患者的 GSF 中研究了 GMCSF(Tarkowski，等.(1999)，Stroke，30，321-7.)。在稍 后的研究中，F(xiàn)AS配體和細(xì)胞凋亡前蛋白水平與在21-26天和遲至3個(gè)月的中風(fēng)患者腦脊 液中GMCSF水平正相關(guān)。但是，沒有結(jié)論給出在中風(fēng)患者中所發(fā)現(xiàn)的上述結(jié)果的任何治療 用途，且也沒有提及GMCSF任何可能的神經(jīng)飽和作用。在中風(fēng)后自身所釋放的GMCSF可能 有許多原因，無法允許進(jìn)行任何功能性的預(yù)測(cè)。GMCSF能通過血腦屏障(McLay，等.(1997)， Brain, 120，2083-91.)。該研究并沒有以顯示任何GMCSF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療適用性的 目的來進(jìn)行，且其在上下文中亦沒有提及GMCSF在神經(jīng)變性疾病或中風(fēng)中的可能作用?？偠灾?，上述提及的參考文獻(xiàn)所提供了 GMCSF受體和配體在神經(jīng)系統(tǒng)中存在的
17證據(jù)，但沒有顯示GMCSF任何常規(guī)的神經(jīng)保護(hù)特性。這些研究當(dāng)然不能暗示GMCSF在治療 神經(jīng)變性和諸如中風(fēng)的局部缺血病癥中的應(yīng)用。其他造血生長因子在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用支持其治療作用，優(yōu)選其神經(jīng)保護(hù)作用的 GMCF和/或GMCSF制備物的組合物。由這些組合物所產(chǎn)生的效力可累加、超累加/協(xié)同。 在一個(gè)實(shí)施方案中，各種GCSF和/或GMCSF衍生物彼此結(jié)合使用。同樣地，GCSF和/或 GMCSF可與一種或多種諸如促紅細(xì)胞生成素及其衍生物的額外造血生長因子結(jié)合使用，近 來業(yè)已顯示了上沭結(jié)合能介導(dǎo)強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)特件(如，Brines等(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97 10526-10531 Cerami 等(2002) Nephrol Dial Transplant 17 8~12 :Siren AL,Ehrenreich H(2001)EurArch Psychiatry Clin Neurosci 251 :179-184.)。此外，GMCSF 和/或GCSF可與下列物質(zhì)結(jié)合使用，例如，各種集落刺激因子(如M-CSF)、SCF(干細(xì)胞 因子)、SCPF(干細(xì)胞增殖因子)、各種白介素(IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、ILlU IL12)、LIF、 TGF-β、MIP-I-α、TNF-α以及許多其他低分子量因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除了促紅細(xì)胞生成素外的多種造血生長因子可在缺少 GMCSF和/或GCSF條件下單獨(dú)使用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如，在上下文的中風(fēng)中，GCSF 和/或GMCSF可與具有溶栓活性的物質(zhì)結(jié)合使用，如組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)、鏈 激酶、尿激酶和/或蝮蛇抗栓酶(Ancrod)。GCSF和/或GMCSF也可與乙酰水楊酸(阿司匹 林)或肝素、褪黑激素和/或干擾細(xì)胞凋亡信號(hào)的物質(zhì)(如半胱天冬酶抑制劑)結(jié)合使用。 除此之外，特別是，但不限于，在治療肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)中，GCSF和/或GMCSF也可 與科魯唑(Riluzole) (Rilutek ),諸如維生素Ε、QlO的維生素或抗氧化物質(zhì)結(jié)合使 用。對(duì)于治療帕金森氏癥而言，GCSF和/或GMCSF可與已知用于治療帕金森氏癥的藥物結(jié) 合使用，所述藥物例如苯海索(Trihexyphenidyl)、司來吉蘭(Selegiline)、L-D0PA、培高 利特(Pergolide)及其他可用藥物。其他可與諸如G-CSF和/或GM-CSF的造血生長因子 結(jié)合使用的物質(zhì)，包括bFGF、抗-GPIIb/lia、抗-ICAM、氧化氮抑制劑、溶栓劑、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶 抑制劑、神經(jīng)鈣蛋白抑制劑和環(huán)孢菌素。此外，當(dāng)治療神經(jīng)變性障礙時(shí)，也包括給予一種或 多種影響神經(jīng)遞質(zhì)水平的試劑。此外，當(dāng)治療認(rèn)知病癥時(shí)，也可給予一種或多種膽堿能劑、 兒茶酚胺再攝取抑制劑等。與現(xiàn)有的抗抑郁藥結(jié)合使用可有利于，如治療個(gè)體抑郁癥?？挂钟羲幍姆窍拗菩?實(shí)例包括SSRI ‘ s (選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑、Paxil (帕羅西汀)>Prozac (氟西汀)、 Zoloft (舍曲林)、Celexa (西酞普蘭)、Lexapro (依他普侖草酸鹽)、Luvox (氟伏沙明)、 MOAI ‘ s (單胺氧化酶抑制劑)、Nardil (苯乙胼)、Parnate (強(qiáng)內(nèi)心百樂明)、TCA' s (三環(huán) 抗抑郁藥)、Adapin (多慮平),Anafranil (氯米帕明)、Elavil (阿米替林)>Endep (阿米替 林),Ludiomil (馬普替林),Norpramin (地昔帕明),Pamelor (去甲替林),Pertofrane (地 昔帕明)、Sinequan (多慮平)、Surmontil (曲米帕明)、Tofranil (丙米嗪)、Vivactil (普 羅替林)或其他類型藥物=EfTexor (文拉法辛)、Cymbalta(度洛西汀)、DesyreK曲唑 酮)、Buspar ( 丁螺環(huán)酮)、Edronax (瑞波西汀)、Vestra (瑞波西汀)、Remeron (米氮平)、 Serzone (奈法唑酮)、Wellbutrin ( 丁氨苯丙酮)。神經(jīng)系統(tǒng)疾病根據(jù)本發(fā)明要被治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病可通常分為三類具有局部缺血或缺氧機(jī)制的那些疾病、神經(jīng)變性疾病(參見Adams等，Principlesof Neurology, 1997，第6版 ，New York，pp 1048ff)以及與神經(jīng)細(xì)胞死亡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和精神病。根據(jù)本發(fā)明可被治 療的其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病也包括增強(qiáng)認(rèn)知能力和治療腦腫瘤，例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞 瘤、腦膜瘤及神經(jīng)細(xì)胞瘤。具有局部缺血或缺氧機(jī)制的疾病可進(jìn)一步分為金身病和腦缺血。上述涉及局部缺 血或缺氧機(jī)制的全身病的實(shí)例包括心肌梗塞、心機(jī)能不全、心肌衰竭、充血性心力衰竭、心 肌炎、心包炎、心包心肌炎、冠心病(冠狀動(dòng)脈狹窄)、心絞痛、先天性心臟病、休克、末端局 部缺血、腎動(dòng)脈狹窄、糖尿病性視網(wǎng)膜病、與瘧疾相關(guān)的血栓癥、人工心臟瓣膜、貧血癥、脾 功能亢進(jìn)、肺氣腫、肺纖維化及肺水腫。腦缺血疾病的實(shí)例包括中風(fēng)(及出血性中風(fēng))、大腦 微血管病(小血管病)、產(chǎn)時(shí)腦缺血、心臟停搏或復(fù)蘇期間/后的腦缺血、由于手術(shù)中問題的 腦缺血、在頸動(dòng)脈外科手術(shù)過程中的腦缺血、用由于腦部供血?jiǎng)用}狹窄、靜脈竇血栓形成或 腦靜脈血栓形成的慢性腦缺血、大腦血管畸形及糖尿病性視網(wǎng)膜病。神經(jīng)變性疾病的實(shí)例包括肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、帕金森氏癥、亨延頓 (氏)舞蹈病、威爾遜(氏)病、多系統(tǒng)萎縮、阿爾茨海默氏病、皮克(氏)病、路易士 體病、哈勒沃登-施帕茨病、變形性肌張力不全、遺傳性感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變(HMSN)、 Gerstmann-Strauss 1 er-Schanker病、克-雅氏病、馬-約病、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、非弗里 德賴希共濟(jì)失調(diào)、日勒德拉圖雷特綜合征、家族性震顫、橄欖體腦橋小腦變性、類腫瘤性大 腦綜合征、遺傳性痙攣性截癱、遺傳性視神經(jīng)病(Leber)、視網(wǎng)膜色素變性、眼底黃色斑點(diǎn) 癥，及卡恩斯-塞爾綜合征。與神經(jīng)細(xì)胞死亡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和精神病的實(shí)例包括感染性休克、大腦內(nèi)出 血、蛛網(wǎng)膜下出血、多梗塞癡呆、炎性疾病(諸如血管炎、多發(fā)性硬化癥和格-巴二氏綜合 征)、神經(jīng)外傷(諸如脊髓外傷和腦外傷)、周圍神經(jīng)病變、多發(fā)性神經(jīng)病、癲癇、精神分裂 癥、抑郁癥、代謝性腦病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染(病毒、細(xì)菌、真菌)。“治療”指減緩、中斷、抑制或停止疾病或病癥的進(jìn)展，并不需要完全消除所有 疾病癥狀和征兆?！邦A(yù)防(Preventing)”意在包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防，其中“預(yù)防 (prophylaxis)，，理解為在疾病或病癥發(fā)作或具嚴(yán)重征兆或癥狀時(shí)所要被抑制的任何程度， 包括，但不限于，完全預(yù)防疾病或病癥。因?yàn)樵诩顾柚写筮\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)GCSF受體和GMCSF受體強(qiáng)表達(dá)(參見圖 4i_l)，以及GCSF對(duì)局灶性腦缺血有效(參見圖1)，其中及ALS和其他神經(jīng)變性疾病中相 同的基本發(fā)病機(jī)制在起作用，例如谷氨酸鹽受累、氧化應(yīng)激和程序性細(xì)胞死亡，所以GCSF 特別適合于諸如ALS的慢性病癥的長期治療，因?yàn)楫?dāng)長期給藥時(shí)，其在人體中耐受良好 (Ozer等.(2000)，J :Clin. Oncol.，18，3558-85)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，諸如 GCSF和GMCSF的造血生長因子可單獨(dú)使用或彼此結(jié)合使用，和/或與一種或多種可用于治 療ALS的附加因子結(jié)合使用。與帕金森氏癥相關(guān)的病理生理學(xué)，諸如氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，也將帕金森氏癥置 于其他神經(jīng)變性障礙和中風(fēng)之間。在H202引起的PC12細(xì)胞系細(xì)胞死亡過程中，GCSF其強(qiáng)有 力的神經(jīng)保護(hù)作用(圖lb)。PC12細(xì)胞具有多巴胺能細(xì)胞特征，例如存在功能性多巴胺轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白(Maruyama.等.(2001)，Arch Toxicol，75，209-13)，并作為體外模型用于研究帕金 森氏癥的一些重要現(xiàn)象，例如MPTP代謝物MPP+的毒性(Bai等.(2002),Nezlrosci Lett,
19321，81-4)。H2O2是作用于PC12細(xì)胞的有害刺激物，其能明確地在PC12細(xì)胞中模擬帕金森 氏癥的一些現(xiàn)象。例如，H2O2是MPTP-誘發(fā)細(xì)胞事件媒介物之一 (Fabre等1999.TPhySiol Biochem 55(4) :325_31))。值得注意的是細(xì)胞事件級(jí)聯(lián)中的交迭和涉及MPTP-及H2O2介導(dǎo) 的多巴胺能神經(jīng)元中細(xì)胞死亡的信號(hào)機(jī)制(Chun, HS,等·，JNeurochem 2001 Feb ；76 (4) 1010-21 Lai 等·，Biochem Pharmacol 1993Feb 24 ；45(4) :927_33)。H2O2 通過產(chǎn)生活性氧 簇(ROS)起作用，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。氧自由基的損害是帕金森氏癥主要的病理生 理學(xué)事件之一 (Bonnet 和 Houeto (1999), Biomed Pharmacother, 53,117-21. ,Beal (2001), Nat Rev Neurosci, 2, 325-34),以及抗氧化療法在患者中有效(Beal (2002), Free Radic Res, 36,455-60.，Shults，等.(2002) ,Arch Neurol, 59,1541-50)。因此，在H2O2 引發(fā)的PC12 細(xì)胞死亡，即一種用于預(yù)測(cè)在帕金森氏癥(PD)中有效性的重要氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡病理 生理機(jī)制模型中，GCSF能起效。令人驚奇的是，證實(shí)了 GCSF受體在受帕金森氏癥影響的區(qū) 域，即黑質(zhì)(SN)表達(dá)，具體而言是黑質(zhì)密部(SNC)(參見圖4m-o)。在細(xì)胞模型中的功效、 受體體內(nèi)定域化以及病理生理機(jī)制與腦缺血(氧自由基/細(xì)胞凋亡)的交迭提供了令人注 目的證據(jù)，表明GCSF和/或諸如GMCSF的其他生長因子可用于治療帕金森氏癥?？稍趪X 動(dòng)物模型中進(jìn)行功效測(cè)試，如實(shí)施例5所例證。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，諸如 GCSF和GMCSF的造血生長因子可單獨(dú)使用，彼此結(jié)合使用，和/或與一種或多種可用于治 療帕金森氏癥的附加因子結(jié)合使用。通過于此所包含的討論，本發(fā)明人已經(jīng)證明GCSF和GMCSF具有增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生的能 力和改善局部缺血損傷后行為結(jié)果的能力。神經(jīng)發(fā)生是一種能導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可塑性增加的 機(jī)制，并能逐漸取代神經(jīng)元的損失。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是按照于此所討論的給藥 方案，通過給予個(gè)體一種或多種如本文所描述的組合物，以提供給患有、顯示和/或據(jù)信在 某種程度上認(rèn)知損失的個(gè)體，使之認(rèn)知能力得到增強(qiáng)、改善或增加。在一個(gè)可選的實(shí)施方案 中，認(rèn)知增強(qiáng)也可有助于那些個(gè)體，甚至在非病理?xiàng)l件下也有用處，如那些并沒有表現(xiàn)處認(rèn) 知缺損的個(gè)體。測(cè)定認(rèn)知能力及因此增強(qiáng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。在此測(cè)量增加或增強(qiáng) 的認(rèn)知能力，并在給予本發(fā)明的組合物前及給予后(以及在某些實(shí)施方案中也可在給予過 程中進(jìn)行測(cè)量)使用同樣的測(cè)試方法以比較結(jié)果，如使用一些標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)等。此外，根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容，組合物在認(rèn)知增強(qiáng)中的用途不限于精神能量的非病理減 退，也可用提高正常認(rèn)精神能量的生理學(xué)所有組成成分，例如記憶增強(qiáng)、精細(xì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的增 強(qiáng)和/或邏輯能力的增強(qiáng)。抑郁癥具有悲傷、喪失活動(dòng)興趣和精力減少的特點(diǎn)。其他癥狀包括喪失信心和自 尊、不當(dāng)內(nèi)疚、死亡想法和自殺、注意力減少及睡眠和食欲紊亂。也出現(xiàn)了許多軀體癥狀。雖 然，抑郁情緒常見，特別是在生活經(jīng)歷挫折后，當(dāng)癥狀達(dá)到閾值并持續(xù)至少兩周后抑郁癥才 被診斷。抑郁癥嚴(yán)重程度可從中度到十分嚴(yán)重。雖然在中年時(shí)死亡率是最高的，但抑郁癥可影響個(gè)體生命期內(nèi)任何階段。然而，在 青春期和青年期增加了對(duì)抑郁癥的識(shí)別(Lewinsohn，等。(1993)，J Abnonn Psychol, 102, 110-20)。抑郁癥本質(zhì)上是一種插曲式的復(fù)發(fā)病癥，每次發(fā)作通常持續(xù)幾個(gè)月至幾年，正常 的持續(xù)時(shí)間介于二者之間。但是，在約20%的病例中，抑郁癥跟隨著長期的病程，而無緩解 (Thornicroft 和 Sartorius (1993)，Psychol Med, 23,1023-32)，特別是當(dāng)無法獲得適當(dāng)?shù)?治療時(shí)。對(duì)于那些從第一次發(fā)作痊愈過來的而言，2年內(nèi)復(fù)發(fā)率在35%左右，在第12年復(fù)發(fā)率為約60%。在那些超過45歲的中間，復(fù)發(fā)率更高。抑郁癥獨(dú)特的悲劇性結(jié)果之一是自 殺。約15-20%的抑郁患者通過自殺結(jié)束自己的生命。自殺成為抑郁癥常見和不可避免的 結(jié)果之一。總的來說，抑郁癥是一種常見的精神障礙，導(dǎo)致非常高水平的疾病負(fù)擔(dān)，預(yù)期在 就要來到的20年間具有上升趨勢(shì)。抑郁癥可不斷地傷害患者(單級(jí))或具有雙相性(狂躁或雙相性抑郁癥)。雙相 性抑郁癥特征在于極端的心境不穩(wěn)，從格外精神和情緒高漲的“高潮”到完全絕望和昏睡無 力的“低潮”。通常使用鋰來治療狂躁性抑郁癥，其能使心境不穩(wěn)恢復(fù)平靜。所述抑郁癥可以是一種季節(jié)性情感障礙(SAD)。其是抑郁癥的一種類型，通常在快 到冬天、帶來更長白天和更多日照的開始于9月持續(xù)到春天的時(shí)段發(fā)生。所述抑郁癥可以是一種出生后抑郁癥，其出現(xiàn)開始于出生后約2周，至多到2歲 時(shí)。業(yè)已嘗試進(jìn)行抑郁癥嚴(yán)重程度的分類，如(Abdel-Khalek(2003), Psychol Rep, 93，544-60)確定了如下8種基礎(chǔ)要素，即悲觀、注意力差、睡眠不好、快感缺乏、疲勞、孤獨(dú)、 自尊心低和身體疾病，來定義兒童和青春期抑郁癥的類型。抑郁癥可作為一種特發(fā)性疾病發(fā)生(沒有與其相關(guān)的身體疾病)，或可以是一種 身體失調(diào)的精神癥狀，特別是許多的神經(jīng)變性障礙。抑郁癥(DDs)是時(shí)常發(fā)生的神經(jīng)障礙 的精神并存病，所述神經(jīng)障礙如同多發(fā)性硬化癥、中風(fēng)、癡呆、偏頭痛、帕金森氏癥和癲癇。 在這些神經(jīng)障礙中DDs的臨床表現(xiàn)與特發(fā)性心境障礙類似。神經(jīng)變性障礙在最初顯露該疾 病時(shí)，通常具有“典型的”精神癥狀。在上下文神經(jīng)變性障礙中抑郁癥的癥狀學(xué)可不同于抑 郁癥自身。在某些神經(jīng)變性障礙中，所具有的抑郁癥狀如下所列1.多發(fā)性硬化癥2.外傷性腦損傷抑郁癥也影響外傷性腦損傷(TBI)患者；30% -38%的TBI患者 可歸類為抑郁的(Seel和Kreuzer 03)3.中風(fēng)約30%的中風(fēng)患者臨床上表現(xiàn)為抑郁(Williams 86)4.癡呆和阿爾茨海默病5.偏頭痛6.帕金森病約在一半的PD患者中出現(xiàn)抑郁癥狀，對(duì)于PD患者而言，是功能障礙 的主要誘因。有許多證據(jù)提出PD中抑郁癥是繼發(fā)的潛在神經(jīng)解剖學(xué)惡化，更勝于對(duì)心理社 會(huì)應(yīng)激和殘疾的簡單反應(yīng)。抑郁癥的發(fā)病率與中樞5-羥色胺能功能改變及特定皮層和亞 皮層通路的神經(jīng)變性相關(guān)。對(duì)PD中同病性抑郁癥的了解可進(jìn)一步增加對(duì)抑郁癥神經(jīng)解剖 學(xué)基礎(chǔ)的了解。7.癲癇癲癇是一種慢性病癥，對(duì)社會(huì)、職業(yè)和心理功能具有復(fù)雜影響。業(yè)已顯 示相對(duì)于普通人，在癲癇患者中一些精神障礙具有增加的患病率。抑郁癥看來是最常見的 精神并存病，而焦慮癥及其他診斷尚未廣泛調(diào)查。然而，在癲癇中，抑郁癥所出現(xiàn)的臨床 特性常常與特發(fā)性抑郁癥的那些特性不盡相同，且并不符合Diagnostic andStatistical Manual of Psychiatric Disorders第4版所包括的標(biāo)準(zhǔn)。一些研究已發(fā)現(xiàn)抑郁癥或心理 苦惱可以是健康相關(guān)的生活質(zhì)量、甚至包括是癲癇發(fā)作頻率和嚴(yán)重程度、就業(yè)或駕駛體質(zhì) 的最佳預(yù)報(bào)器(Gilliam，等.(2003)，Epil印sy Behav，4 Suppl 4，26-30)。據(jù)報(bào)道，臨床上 抑郁的人士較沒有抑郁的人士在類似的癲癇發(fā)作時(shí)，具有更高水平的認(rèn)知嚴(yán)重性并為癲癇
21發(fā)作所煩惱，以及總體癲癇發(fā)作康復(fù)更為困難。據(jù)報(bào)道，抑郁癥狀的普遍影響是癲癇發(fā)作頻 繁，暗示患癲癇人士應(yīng)篩查抑郁癥。這些數(shù)據(jù)突出了在患癲癇人士中間檢測(cè)和治療抑郁癥 的重要性(Gilliam，Hecimovic 和 Sheline (2003)，Epikpsy Behav, 4 Suppl4，26-30)8.亨延頓(氏)舞蹈病亨延頓(氏)舞蹈病(HD)是一種神經(jīng)變性過程，其征候 是人運(yùn)動(dòng)控制、認(rèn)知和情緒穩(wěn)定性的惡化。情緒不穩(wěn)定通過多種癥狀得到反應(yīng)，所述癥狀例 如人格改變、焦慮和興奮增盛。在亨延頓(氏)舞蹈病(HD)中認(rèn)知減退可處于運(yùn)動(dòng)癥狀出 現(xiàn)之前。抑郁癥在HD中常見，也已經(jīng)與認(rèn)知缺損聯(lián)系起來。情感低落及通過使用DNA突變 距離所評(píng)估的疾病發(fā)作時(shí)間，兩者皆為重要的工作記憶能力的預(yù)測(cè)器。HD個(gè)體繼發(fā)前的檢 查結(jié)果與現(xiàn)有研究相一致，并有助于現(xiàn)有研究，確定對(duì)于認(rèn)知減退(即情感低落)潛在的可 治療方法(Nehl，等.(2001)，J Neuropsychiatry Clin Neurosci，13，342-6)。抑郁癥狀也 可出現(xiàn)相關(guān)的未列于此的其他身體疾病。最近，對(duì)抑郁癥的發(fā)病機(jī)理研究業(yè)已得到新的令人激動(dòng)的進(jìn)展，暗示抑郁癥與腦 結(jié)構(gòu)中神經(jīng)變性事件相關(guān)，并有可能缺乏海馬結(jié)構(gòu)中正確的成體神經(jīng)發(fā)生。因此，于此所述 的造血生長因子，如G-CSF和/或GM-CSF，使用兩者的抗細(xì)胞凋亡作用和促進(jìn)再生作用(包 括刺激內(nèi)源性成體神經(jīng)干細(xì)胞)進(jìn)行處理可用于治療抑郁癥。下列描述了與抑郁癥的神經(jīng)變性概念相關(guān)的研究(Kempermarm和 Kronenberg(2003)，Biol Psychiatry,54,499-503 的 平)。對(duì)抑郁癥患者形態(tài)學(xué)改變的研究已經(jīng)揭示了在海馬中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變，包括灰質(zhì)改 變(Sheline (2000)，Biol Psychiatry，48，791-800)。對(duì)早發(fā)性再發(fā)性抑郁癥、伴隨神經(jīng) 系統(tǒng)障礙的晚期抑郁癥及雙相性疾病的研究已經(jīng)揭示了在神經(jīng)解剖學(xué)回路中結(jié)構(gòu)性腦改 變。該回路已被命名為緣_皮層-紋狀體_蒼白球_丘腦束，由廣泛互連的結(jié)構(gòu)組成。在 情感疾病的三維磁共振成像研究中，業(yè)已發(fā)現(xiàn)許多包含該束的結(jié)構(gòu)具有體積損失或結(jié)構(gòu)異 常。建議用于解釋抑郁癥中體積損失的機(jī)制包括神經(jīng)毒性導(dǎo)致的神經(jīng)元損失、減少的神經(jīng) 發(fā)生以及可塑性損失?？赏ㄟ^激活GCSF或GMCSF來治療這些癥狀。一個(gè)可能的假說是在 成體海馬神經(jīng)發(fā)生過程中發(fā)生失調(diào)(Kempermann和Kronenberg (2003)，BiolPsychiatry, 54,499-503, Jacobs，·。 (2000)，Mol Psychiatry, 5, 262-9, Jacobs (2002), Brain Behav Immun，16，602-9)。因此，抑郁和其他心境障礙是‘干細(xì)胞障礙’。近來有研究對(duì)成體海 馬神經(jīng)發(fā)生如何進(jìn)行調(diào)節(jié)提出了新觀點(diǎn)。其中能有力抑制成體神經(jīng)發(fā)生的因素之一是壓 力，或許是由于增加的糖皮層激素釋放(Jacobs，Praag和Gage (2000)，MolPsychiatry, 5, 262-9)。成體海馬神經(jīng)發(fā)生最初在1965年為Altman和Das所描述，并經(jīng)歷了一些重新發(fā) 現(xiàn)。更令人備感興趣的現(xiàn)象首先是起于80年代早期的對(duì)金絲雀成體腦中活性相關(guān)的神經(jīng) 發(fā)生的報(bào)告。用溴脫氧尿苷(BrdU)與共聚焦激光掃描顯微鏡法結(jié)合制備增殖的腦細(xì)胞，代 替了更麻煩的使用氚化胸腺嘧啶和放射自顯影技術(shù)的方法，使得成體神經(jīng)發(fā)生定量方法愈 加簡單明了。該新細(xì)胞亞型存活，遷移入顆粒細(xì)胞層并分化進(jìn)入神經(jīng)元。與所有其他顆粒 細(xì)胞層中顆粒細(xì)胞一樣，它們沿著苔狀纖維束將軸突發(fā)射至CA3區(qū)，并事實(shí)上與周圍衰老 細(xì)胞無法分辨。發(fā)現(xiàn)慢性抗抑郁藥治療能減緩成體神經(jīng)發(fā)生的減少，因此強(qiáng)化了上述假說 (Benninghoff，等.(2002)， J Neural Transm，109，947-62， Dremencov,等.(2003)，Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,27,729-39, D ' Sa 禾口 Duman(2002)， Bipolar Disord，4，183-94，Duman，等.(2001)，J Pharmacol Exp Ther，299，401-7，Duman， 等.(1999)，Biol Psychiatry，46，1181-91)。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，例如。通過給予被誘發(fā)抑郁或預(yù)期發(fā)展為抑 郁癥的患者所述造血生長因子，如G-CSF和GM-CSF，可單獨(dú)給予或與聯(lián)合給予，或與本文所 描述的附加因子聯(lián)合給予，可用于治療抑郁和/或提供抑郁的預(yù)防性療法。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑郁可用具有更長血漿半衰期的GCSF和/或GMCSF配 方來治療，如上文所描述的，例如聚乙二醇化形式(PEGfilgrastim)，白蛋白偶聯(lián)形式 (albugranin)。治療不限于特發(fā)性抑郁癥，亦可用于繼發(fā)性抑郁癥和伴發(fā)性抑郁癥。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，所述治療可提供每周一次的皮下注射，可與腦中GCSF或GMCSF受體的口服 激動(dòng)劑聯(lián)合施用。治療劑量如上文所述，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可為每日0. 1-1000 u g/ 公斤體重的GCSF或GMCSF。局部缺血中心周圍類似的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)環(huán)境、損傷位置及改變 的基因轉(zhuǎn)錄提示采用類似的神經(jīng)保護(hù)策略，針對(duì)有害機(jī)制進(jìn)行干預(yù)，應(yīng)當(dāng)對(duì)腦缺血和外傷 性腦損傷有效。在兩種類型損傷中該療法的目的是在于將激活的毒性途徑減到最小、增強(qiáng) 內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的活性及在這些途徑之間保持平衡，最終確定了處于危險(xiǎn)的組織的命 運(yùn)。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)更多的神經(jīng)保護(hù)劑在中風(fēng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭杏行В湓谕鈧阅X損傷(TBI)實(shí)驗(yàn) 模型中也有效。根據(jù)常見的病理及現(xiàn)行的腦缺血和外傷性腦損傷的保護(hù)方法，以及通常響應(yīng)的神 經(jīng)保護(hù)策略，指出GCSF治療對(duì)外傷性腦損傷將有效。在外傷性腦損傷情況下，已有研究在 分析 GCSF (Heard 等.(1998)，Crit. Care Med.，26，748-54)。但該研究并不針對(duì) GCSF (非 格司亭)的任何神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，而僅減少了感染參數(shù)(該研究主要結(jié)果增加嗜中性細(xì)胞絕 對(duì)計(jì)數(shù)、非格司亭的安全性和，醫(yī)院感染(肺炎、菌血癥和尿路感染)的頻度)。該研究并沒 有使死亡率降低。在上下文的臨床安全性中，該研究證明對(duì)于TBI給予GCSF是安全的，確 定了根據(jù)本發(fā)明具有神經(jīng)保護(hù)作用的GCSF療法的安全實(shí)用性。因此，在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí) 施方案中，所述造血生長因子，例如GCSF和GMCSF，可單獨(dú)或互相結(jié)合，和/或與一種或多種 其他附加因子結(jié)合可用于治療腦缺血和外傷性腦損傷，例如，通過提供一種保護(hù)那些具有 損傷的患者中神經(jīng)元細(xì)胞的預(yù)防性方法。因?yàn)樵诨谛募∷ソ吆蛷?fù)蘇的腦缺血中起作用的基本病理生理機(jī)制與那些在基 于血管閉塞的腦缺血下所發(fā)生的事件(參見實(shí)施例1)具有可比性，所以GCSF療法也可在 心臟有問題的情況下起有效的神經(jīng)保護(hù)作用。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述造 血生長因子，例如GCSF和GMCSF可單獨(dú)、彼此結(jié)合和/或與一種或多種可用于治療局部缺 血的附加因子結(jié)合使用解決心臟問題/疾病，和/或提供預(yù)防性神經(jīng)保護(hù)治療。應(yīng)急復(fù)蘇 一開始就可進(jìn)行治療?；蛘撸趯儆谛呐K問題(在前的心肌梗塞、高血膽固醇水平、高血壓、 糖尿病、吸煙)已知的危險(xiǎn)組患者中，可使用諸如GCSF的造血生長因子進(jìn)行預(yù)防性持續(xù)治 療，如使用該因子的緩釋劑型。同樣地，將這些上述需要考慮的事項(xiàng)應(yīng)用于經(jīng)歷了并發(fā)腦缺血的手術(shù)的大組患者 中。具體而言，心臟手術(shù)(HoRue等.(1999)，Circulation, 100,642-7)和對(duì)供給腦的大血 管手術(shù)(如，頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝離術(shù))具有與之相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)。回顧性調(diào)查 了多倫多大學(xué)神經(jīng)外科教學(xué)單位在1982年進(jìn)行的358例頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝離術(shù)的客觀事實(shí)，
23證明了在手術(shù)期間中風(fēng)率為3.9%，死亡率為1.5%。大多數(shù)(82% )神經(jīng)外科手術(shù)并發(fā)癥 在術(shù)后期(24小時(shí))馬上發(fā)生。該延遲的中風(fēng)的高發(fā)病率暗示大多數(shù)手術(shù)期間的中風(fēng)是 血栓性而非血液動(dòng)力性。應(yīng)當(dāng)預(yù)計(jì)在頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝離術(shù)中具有5-6%的發(fā)病率和死亡率 (Group (1986), Stroke，17，848-52)。這些和其他數(shù)據(jù)證明了在這些操作中確實(shí)需要預(yù)防 性神經(jīng)保護(hù)療法。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述造血生長因子，例如GCSF和 GMCSF，可單獨(dú)，彼此結(jié)合，和/或與一種或多種附加因子結(jié)合使用，可用于治療外科手術(shù)誘 發(fā)的腦缺血所產(chǎn)生的局部缺血和/或提供預(yù)防性神經(jīng)保護(hù)療法。在一個(gè)實(shí)施方案中，在處 于危險(xiǎn)的患者中，所述治療在主要手術(shù)操作前就開始。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述造血生長因子，例如GCSF和GMCSF，可單獨(dú)， 彼此結(jié)合，和/或與一種或多種附加因子結(jié)合使用，可用于治療多發(fā)性硬化癥(MS)和/或 在多發(fā)性硬化癥患者中提供預(yù)防性神經(jīng)保護(hù)療法。該方法是基于少突膠質(zhì)細(xì)胞上GCSF 受體的存在，支持了 GCSF對(duì)MS的初級(jí)靶細(xì)胞的直接效力。此外，神經(jīng)細(xì)胞及其突起上 存在的GCSF受體，在疾病后期可危及安全，可能與持久的殘疾相關(guān)(Cid.等.(2002)， J Neurol Sci，193，103-9)。事實(shí)上，最近對(duì)于多發(fā)性硬化癥在治療觀念上產(chǎn)生了變化， 即從免疫調(diào)節(jié)變?yōu)樯窠?jīng)保護(hù)作用，看來對(duì)于多發(fā)性硬化癥的殘疾結(jié)果而言，神經(jīng)變性機(jī) 制是最重要的(Bo,等· (2003)，Mult Scler,9,323-31, Bjartmar,等· (2003)，JNeurol Sci，206，165-71，ffujek,等.(2002)，J Neuropathol Exp Neurol，61，23-32，Bjartmar, 等.(2001)， Neurology,57,1248-52, Peterson,等.(2001)， Ann Neurol,50,389-400, Bjartmar 禾口 Trapp(2001)， Curr OpinNeurol，14，271—8， Bjartmar,等.(2000)， Ann Neurol，48，893-901，Bjartmar，等·(1999)，J Neurocytol，28，383-95，Trapp，等·(1999)， CurrOpin Neurol，12，295-302，Trapp，等·(1998)，N Engl J Med，338，278-85，Neuhaus, 等· (2003)，Trends Pharmacol Sci，24，131-8，Pryce，等· (2003)，Brain, 126，2191-202， Waubant (2003), Expert Opin EmergDrugs,8,145-61, Graumann, 等.(2003), Brain Pathol，13，554-73，Golde，等.(2003) ,Eur J Neurosci，18，2527-37)。甚至在腦中顯示正 常的區(qū)域都與顯示神經(jīng)變性征兆的白質(zhì)改變相關(guān)。因此，在多發(fā)性硬化癥中軸突病理和神 經(jīng)變性是重要的治療靶標(biāo)。如本發(fā)明所示，GCSF和GMCSF在神經(jīng)元中具有的抗細(xì)胞凋亡活 性和原再生(pro-regenerative)潛能(通過增加神經(jīng)發(fā)生及可塑性)支持了將于此描述 的組合物用于治療多發(fā)性硬化癥的新療法。此外，多發(fā)性硬化癥中病理生理機(jī)制與腦缺血中重要機(jī)制交迭，如氧化亞氮 受累(Smith,等.(2001)，Ann Neurol,49,470-6)和谷氨酸鹽興奮性中毒受累(Pitt,
(2000), Nat Med, 6,67-70) 0根據(jù)該信息，對(duì)于多發(fā)性硬化癥和炎性腦功能障礙而言， 諸如GCSF和GMCSF的造血生長因子是一種新的治療選擇。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及精神分裂癥的神經(jīng)保護(hù)治療。近年來已有令人驚奇 的證據(jù)表明在精神分裂癥患者中具有進(jìn)行性的灰質(zhì)損失。通過新的磁共振成像技術(shù)業(yè)已初 步提供了該證據(jù)。雖然精神分裂癥中神經(jīng)變性過程的分子水平尚不清楚，但在精神分裂癥 中使用GCSF和/或GMCSF的神經(jīng)保護(hù)治療對(duì)于該疾病而言卻是一種新的治療方法。為測(cè)試諸如GCSF的造血生長因子保護(hù)初級(jí)神經(jīng)元的效力，神經(jīng)元可制備如下。 10-12只大鼠皮層可制備自El期的胚胎(胚胎第18日)。在HBSS(Hank氏平衡鹽溶液， Bioffithakker)中使用胰蛋白酶[10 mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml] (Roche diagnostics,
24Mannheim, Germany)解離組織。使用4組份培養(yǎng)液(神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液+lml50x B-27 添加物(InvitrogerO+O. 5mM L-谷氨酰胺+25 y M谷氨酸鹽)來停止消化，并在室溫下 以800g離心5分鐘。將沉淀溶于5ml培養(yǎng)基中，通過計(jì)數(shù)(Neubauer載玻片)測(cè)定細(xì)胞 數(shù)量。將細(xì)胞置于24孔培養(yǎng)板中，每孔密度為250 000個(gè)細(xì)胞，覆蓋上涂覆有聚-L-賴 氨酸的蓋玻片。然后，用保護(hù)性刺激物(GCSF)和傷害性刺激物(谷氨酸鹽，100yM)的 組合物處理這些神經(jīng)元。在用谷氨酸鹽處理培養(yǎng)物前30分鐘應(yīng)用GCSF。對(duì)照組既不用 GCSF(僅用鹽水)也不用谷氨酸鹽處理。24小時(shí)后，按照制造商推薦，使用LDH測(cè)定法 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)測(cè)定神經(jīng)元細(xì)胞死亡。或者，其他已知用于誘 發(fā)細(xì)胞死亡的傷害性刺激亦可使用，如NMDA和甘氨酸、3-硝基丙酸(3-NPA)、H202、十字孢 堿、缺氧/葡萄糖喪失、鉀停藥(potassiumwithdrawal)、MPP+、白介素_1 3、TNF a、FAS 配體或其他已知對(duì)細(xì)胞和神經(jīng)元的傷害。不同的測(cè)定法亦可用于評(píng)估硝死亡或相對(duì)的細(xì) 胞生存，如細(xì)胞死亡ELISA(Roche Diagnostics)、膜聯(lián)蛋白/碘化丙錠染色后的激光掃描 iffllfiiffi^ (Kamentsky(2001), Methods Cell Biol, 63, 51-87), Compucyte, Cambridge, Massachusetts)、DAPI或H0ECHST33342染色后對(duì)具有細(xì)胞凋亡特征(凝聚、斷裂)的細(xì)胞 核計(jì)數(shù)、在用裂解特異性抗體(如，Promega半胱天冬酶3抗體)免疫染色后對(duì)活化的半胱 天冬酶3陽性的細(xì)胞計(jì)數(shù)、或在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中對(duì)半胱天冬酶3活性進(jìn)行測(cè)定(如ApoOne 測(cè)定法，Promega ；蛋白質(zhì)印跡、Elisas)、或任何其他適用于測(cè)定細(xì)胞生存或細(xì)胞凋亡特征 的測(cè)定法?；蛘?，可適用其他細(xì)胞，例如分化的PC12細(xì)胞、HN33細(xì)胞、SHSY5細(xì)胞、初級(jí)海 馬神經(jīng)元、初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、初級(jí)感覺神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、初級(jí)中腦培養(yǎng)物、神經(jīng)元干細(xì)胞、分化的 ES細(xì)胞或其他本領(lǐng)域已知的神經(jīng)元樣細(xì)胞、或具有一種或多種神經(jīng)元表型的細(xì)胞。在此 例證的時(shí)間和濃度也可改變，例如，GCSF可與一種刺激物協(xié)同應(yīng)用，或在刺激物前或后應(yīng) 用。也可使用不同的GCSF濃度，如0. 1-100 ug/ml.原則上，該測(cè)定法也可適用于腦切片培 養(yǎng)物。為測(cè)試諸如GCSF的造血生長因子在腦外傷模型(受控的皮層撞擊)中的效力，進(jìn) 行下列實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案應(yīng)得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的批準(zhǔn)。將20只重量為280-320g的雄性 Wistar大鼠(Charles River, Germany)隨機(jī)分組如下A(對(duì)照組，n = 10，外傷性腦損傷 (TBI)，TBI開始30分鐘后用2ml 0. 9%鹽水處理90分鐘)；B(GCSF組，n = 10，局部缺血 持續(xù)90分鐘，TBI開始30分鐘后用60 u g/公斤體重的溶于2ml 0. 9%鹽水的重組G_CSF( NeilpOgen 、Amgen，Europe B. V.，Netherlands)處理 90 分鐘)；C (模擬手術(shù) GCSF 處理 的對(duì)照組，n = 10，假手術(shù)，TBI開始30分鐘，用60 u g/公斤體重的溶解于2ml 0. 9%鹽水 重組 G-CSF( Neupogen 、Amgen, Europe B. V.，Netherlands)處理 90 分鐘)?？赏ㄟ^向腹膜內(nèi)注射100mg/公斤體重的鹽酸氯胺酮(WDT，Garbsen, Germany)麻 醉動(dòng)物。如必要的話，麻醉可維持在50mg/公斤體重。可將PE-50聚乙烯導(dǎo)管插入右股動(dòng) 脈用于平均動(dòng)脈壓、血?dú)?、血?xì)胞比容和血糖水平的連續(xù)監(jiān)測(cè)?？蓪E-50導(dǎo)管插入右股靜 脈用于處理注入物。在實(shí)驗(yàn)過程中，監(jiān)測(cè)直腸溫度并通過恒溫控制加熱墊(Fohr Medical Instruments, Germany)維持在 37°C。對(duì)于TBI而言，接著除去探頭周圍的皮膚并將顱骨暴露并清洗?？墒褂镁哂虚g接 撞擊的重物墜擊(weight-drop)裝置造成TBI，改良了與微量透析的相容性(150g重物從 40cm高度墜擊在具有2. 0mm直徑的Telfon接觸點(diǎn)的PVC圓筒上)。模擬手術(shù)的對(duì)照物可用相同方法制備經(jīng)歷TBI，但無損傷的大鼠。在所有動(dòng)物中，結(jié)果可通過死亡率和神經(jīng)損害程度度量表(NSS)進(jìn)行測(cè)定，在外 傷性腦損傷后研究人員通過儀器對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行測(cè)定，該測(cè)定每日進(jìn)行，持續(xù)一周。神經(jīng)系統(tǒng) 功能分為0-16級(jí)(正常得分，0 ；最大缺陷得分，16)。NSS是一種運(yùn)動(dòng)、感覺及反射試驗(yàn)并 包括游梁平衡(beam balance)試驗(yàn)之復(fù)合體。在損傷的嚴(yán)重程度評(píng)分中，無法進(jìn)行測(cè)試或 缺乏測(cè)試反射就獎(jiǎng)勵(lì)1分，因此損傷越嚴(yán)重，得分越高。TBI—周后，用150mg/公斤體重的氯胺酮麻醉大鼠并斬首。移除大腦并在0. Imol/ 1磷酸緩沖液中用4%低聚甲醛固定24小時(shí)。在石蠟包埋后，切下1 μ m厚的切片進(jìn)行H&E 染色、Nissl染色和免疫組化分析?？捎每顾柽^氧化物酶(DAKO，USA)和G_CSFR(Santa CruzBiotechnology Inc.， USA)的抗血清進(jìn)行免疫組化研究?？寡蹇僧a(chǎn)生自用分離的人蛋白質(zhì)(抗-髓過氧化物 酶)或在小鼠G-CSFR羧基末端的合成肽分別免疫的兔。對(duì)于抗原回收而言，所提供的用 于G-CSFR免疫組化的切片可在IOmM檸檬酸鹽緩沖液中于99°C加熱20分鐘。然后將切片 在常規(guī)的豬血清(溶于10%磷酸鹽緩沖液)中溫育30分鐘，接著于4°C在初級(jí)抗血清中過 夜。一級(jí)抗體可稀釋至1 150 (髓過氧化物酶)或1 400 (G-CSFR)。免疫反應(yīng)性通過抗 生物素蛋白生物素復(fù)合物方法(Vectastain，Vector Laboratories, USA)顯影。切片可在 含有0.02%過氧化氫的0.02%二氨基聯(lián)苯(DAB)中顯影。可通過添加0. 02%氯化鈷和硫 酸鎳銨以強(qiáng)化反應(yīng)產(chǎn)物。可通過在顯微鏡(放大倍率x40)下，對(duì)G-CSF處理的動(dòng)物活對(duì)照 動(dòng)物海馬中神經(jīng)元進(jìn)行定量，從而測(cè)量TBI后神經(jīng)元生存率。中性粒細(xì)胞(NG))侵入可用 四點(diǎn)量表(0 = MPO陰性，1 = MPO低表達(dá)，2 = MPO中等表達(dá)，3 = MPO強(qiáng)表達(dá))半定量測(cè) 量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)值表示為均值士SD。在獲取所有數(shù)據(jù)后，打亂隨機(jī)編碼。ANOVA法和在此之后 的Fisher保護(hù)的最小顯著差數(shù)檢驗(yàn)可用于測(cè)定諸如生理參數(shù)的連續(xù)變量的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯 著性。t檢驗(yàn)可用于比較神經(jīng)元損傷和免疫組化數(shù)據(jù)?？蓪?duì)諸如死亡率和MPO免疫組化的 非參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行Marm-Whitney U檢驗(yàn)。ρ值< 0. 05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。基于諸如GMCSF和GCSF的造血因子的效應(yīng)，以及使人極度痛苦的神經(jīng)元細(xì)胞上同 類受體的效應(yīng)，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是通過拮抗癌細(xì)胞上GMCSF和/或GCSF受體來治 療腦腫瘤或其他神經(jīng)系統(tǒng)癌癥。神經(jīng)元干細(xì)胞近來，業(yè)已認(rèn)識(shí)到形成新的神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)發(fā)生)對(duì)于治療)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重 要性。和許多其他組織不同，成熟的腦具有受限的再生力，及其獨(dú)特的細(xì)胞?；潭认拗屏?殘存的健康組織承擔(dān)受損腦功能的程度。然而，腦神經(jīng)元所衍生自的前體細(xì)胞在成體腦中 仍存在，因此在成體腦中刺激內(nèi)源性神經(jīng)前體可具有治療潛能。神經(jīng)發(fā)生出現(xiàn)在成體腦的不同區(qū)域，包括側(cè)腦室的喙部腦室下區(qū)(SVZ)和齒狀回 (DG)的顆粒下層(SGZ)。神經(jīng)發(fā)生在成體動(dòng)物中出現(xiàn)，特別是在特定的神經(jīng)學(xué)上范例后出 現(xiàn)(如腦缺血(Jin,等· (2001)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98，4710-5，Jiang 等· (2001)， Stroke, 32，1201—7， Kee，等.(2001), Exp.Brain. Res. ,136, 313-20, Perfilieva, 等.(2001)，J Cereb. Blood Flow Metab.，21，211-7)).也已經(jīng)在人中證實(shí)了神經(jīng)發(fā)生(Eriksson，等.(1998)，Nat Med，4，1313-7.)，并實(shí)際上產(chǎn)生功能性神經(jīng)元(van Praag， 等.(2002)，Nature，415，1030-4)。具體而言，在成年期中齒狀回的顆粒下層及門具有產(chǎn)生 新神經(jīng)元的潛能(Gage,等 (1998)，JNeurobiol，36，249-66)。令人震驚的是GCSF受體在 該區(qū)域表達(dá)(圖4a，d)?？偨Y(jié)這些令人震驚的數(shù)據(jù)，證實(shí)了在GCSF治療后功能性結(jié)果得到 改善(圖8)，事實(shí)在于GCSF在另一系統(tǒng)(造血)中是一種干細(xì)胞因子，通過其至少是在齒 狀回中對(duì)成體干細(xì)胞的刺激作用，可預(yù)計(jì)到GCSF可發(fā)揮其部分作用，特別是所觀察到的長 期效應(yīng)(圖8)。這就證實(shí)了在目前應(yīng)用中GCSF受體存在于成體神經(jīng)元干細(xì)胞上，該干細(xì)胞分離 自大鼠齒狀回周圍的海馬區(qū)(圖12和13)。神經(jīng)發(fā)生的重要性提供了用GCSF治療所有神經(jīng) 變性疾病和所有的神經(jīng)元死亡的病癥的適用性與有效性的另一理由。與在腦中作用于內(nèi)源 性干細(xì)胞用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病對(duì)比，GCSF可用于體外處理干細(xì)胞，例如分化和增殖。目前 正在研究用人干細(xì)胞療法治療許多疾病，具體來說是帕金森氏癥和中風(fēng)。最好是培養(yǎng)中的 干細(xì)胞能分化為特定類型的神經(jīng)細(xì)胞，如用于治療帕金森氏癥多巴胺能細(xì)胞。接著，將分化 的或相反的適應(yīng)新環(huán)境的細(xì)胞通過不同的途徑給予生物體。例如，在帕金森氏癥中，干細(xì)胞 業(yè)已直接注射入腦中以彌補(bǔ)黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的損失(“補(bǔ)充療法”)(Arenas (2002), Brain. Res.Bull，57，795-808，Barker(2002)，Mov.Disord,17，233-41)。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是在植入哺乳動(dòng)物前，使用造血生長因子及其衍生 物刺激神經(jīng)元干細(xì)胞的生長和分化或?qū)ι窠?jīng)元干細(xì)胞預(yù)處理。該方法進(jìn)一步的實(shí)施方案是 在于此所述的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法中利用這些神經(jīng)元干細(xì)胞，當(dāng)將神經(jīng)元干細(xì)胞給予 個(gè)體時(shí)，優(yōu)選在提供神經(jīng)保護(hù)效力的方法中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞能由靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)給予。業(yè)已顯示，例如， 在腦缺血或外傷性腦損傷中，發(fā)現(xiàn)了注射的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在腦中遷移至靶區(qū)域的途 徑(Mahmood,等 (2001)，Neurosurgery, 49,1196-203 ；討論 1203-4，Lu,等 (2001)，J Neurotrauma，18，813-9， Lu,等 (2002)， Cell Transplant，11，275—81， Li 等 (2002)， Neurology, 59，514-23)。因此，干細(xì)胞可用GCSF、GMCSF或其他造血因子體外處理，接著通 過不同途徑注射患于此所述的任何疾病的患者。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，移植的干細(xì)胞被遺傳學(xué)改造以表達(dá)分泌因子，并增 強(qiáng)附近細(xì)胞的生存力，或?qū)е鲁审w內(nèi)源性干細(xì)胞增殖和/或分化的增加。例如，干細(xì)胞可改 造以穩(wěn)定表達(dá)GCSF、GMCSF和/或一種或多種另外的造血因子，并接著遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng) 以持續(xù)分泌GCSF、GMCSF或其他造血因子至局部環(huán)境中?？捎肎CSF、GMCSF和/或其他造血因子的受體激動(dòng)劑處理干細(xì)胞?？墒褂玫母杉?xì) 胞包括無限增殖干細(xì)胞(如，癌基因無限增殖)、神經(jīng)球(神經(jīng)球)和胚胎干細(xì)胞(ES)衍 生的神經(jīng)細(xì)胞(Gottlieb (2002)，Annu Rev Neurosci，25，381-407)，但也可包括類似于骨 髓基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞或臍帶細(xì)胞(Lu等(2002)，Cell Transplant，11，275-81，Li等(2002)， Neurology, 59, 514-23)。移植不同類型的干細(xì)胞可能治療不同的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括帕金 森病(Isacson(2002)，Brain Res Bull，57，839-46)和中風(fēng)(Kondziolka，等.(2002)，J Clin Neurosci,9,225-30)。所述干細(xì)胞，如人神經(jīng)元干細(xì)胞，可在移植前使用因子處理進(jìn)行調(diào)節(jié)。那些調(diào) 節(jié)因子的一個(gè)實(shí)例是生長因子。一個(gè)調(diào)節(jié)的實(shí)例是將其定向分化為所需細(xì)胞，如神經(jīng)元
27(Svendsen，等.(1999)，Brain Pathol，9，499-513)。干細(xì)胞上存在 GCSF 受體表明了作用 于該受體以調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的激動(dòng)劑的重要性。成體神經(jīng)元干細(xì)胞可用不同濃度的GCSF或 其他的GCSF受體激動(dòng)劑處理，并通過定量PCR方法分析增加的分化潛能，如通過定量神經(jīng) 元干細(xì)胞(nestin)的神經(jīng)元標(biāo)記物(Map2、NSE (神經(jīng)元特異性烯醇酶)、神經(jīng)絲、NeuN)對(duì) 標(biāo)記物的比率。在處理后增加的比率表明對(duì)所述神經(jīng)元譜系干細(xì)胞分化增加了。在對(duì)神經(jīng) 系統(tǒng)疾病進(jìn)行移植術(shù)之前，可使用適合的濃度和時(shí)間窗口來處理干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，GCSF、GMCSF、它們的衍生物以及GCSF和GMCSF受 體激動(dòng)劑有助于神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)，例如神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)。在該方法中，GCSF、GMCSF、它們 的衍生物以及GCSF和GMCSF受體激動(dòng)劑可添加至培養(yǎng)基中，并在添加至細(xì)胞前預(yù)混合，或 可添加至其中細(xì)胞正在培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。在該方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，用編碼GCSF、 GMCSF和它們衍生物的多核苷酸轉(zhuǎn)染所述神經(jīng)細(xì)胞，當(dāng)轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)因子。給藥/配伍/劑量G-CSF、GM_CSF和其他因子、衍生物、基因以及它們的組合可以多種劑型給藥，包括 但不限于，液體溶液或混懸液、片劑、丸劑、粉劑、栓劑、多聚微膠囊或微泡、脂質(zhì)體以及可注 射的或適合注入的溶液。優(yōu)選的劑型取決于給藥方式和治療用法。所述組合物可以是液體、膏劑或無菌固體劑型，其在使用前可溶于無菌可注射介 質(zhì)中。腸胃外給藥優(yōu)選經(jīng)靜脈注射給予。該注射可使用注射器或同等的手段?？砂帉W(xué) 上可接受的載體。或者，所述組合物，如包含G-CSF的，可以合適的劑量以液體劑型經(jīng)粘膜 途徑給予。對(duì)于口服給藥而言，所述組合物，如包含G-CSF的，可以具有合適載體的液體或 固體劑型給予。所述要被治療的哺乳動(dòng)物可以是，例如豚鼠、狗、貓、大鼠、小鼠、馬、奶牛、綿羊、猴 或猩猩。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。同樣地，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述造血因 子，例如用于治療或預(yù)防用途的GCSF和GMCSF是一種人因子或人源性因子。當(dāng)造血因子單獨(dú)或聯(lián)合給藥時(shí)，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方法中所使用的造血因子的 治療有效量應(yīng)當(dāng)是能產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)效力的量。上述量可在每種因子或組合約lOOng至約 10mg/公斤體重的范圍內(nèi)變化，并取決于年齡、種族、性別和基于患者個(gè)體的其他因素。例 如，用于本發(fā)明方法的GCSF的量應(yīng)在約5至約60 u g/公斤體重，而GMCSF的量則在約5至 約750 u g/公斤體重。當(dāng)這些因子聯(lián)合給藥時(shí)，在給予、同時(shí)給予或逐一連續(xù)給予前可對(duì)它 們進(jìn)行預(yù)混合。在某些于此所述的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的實(shí)施方案中，更高劑量的G-CSF和GM-CSF 是特別有用的，例如，可使用至少lmg、至少2mg或至少3mg，優(yōu)選約l_3mg。使用目前可用的 包裝單位，這些更高劑量是無法方便地給予成年患者。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提 供了包裝，特別適用于20-250 y g/公斤體重范圍的劑量，其可被給予，如由靜脈內(nèi)或皮下， 用于依照于此所述的神經(jīng)保護(hù)作用的目的。所述用于遞送高劑量組合物的包裝單位的實(shí)例 包括，例如，含有0. 75-25mgG-CSF和/或GM-CSF，填充體積為1. 0ml或2. 0ml的單次使用的 管形瓶和預(yù)充滿的注射器。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述包裝單位也應(yīng)在標(biāo)簽或單獨(dú)印 刷的材料上包含用法說明，用于于此包含的組合物的遞送。也優(yōu)選用于G-CSF和/或GM-CSF給藥的預(yù)充滿的注射器，用kg/bdy重量標(biāo)度校 準(zhǔn)，允許根據(jù)患者體重精確且快速地確定每一患者的用藥量。在緊急情況下，這些包裝單
28位十分有用，例如在中風(fēng)情況下，在損傷后必須對(duì)患者進(jìn)行十分快速的治療。因此，本發(fā)明 的另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種神經(jīng)保護(hù)作用，例如，在患中風(fēng)或其他神經(jīng)外傷事件的患者 中，在損傷后短時(shí)間內(nèi)給予一種或多種于此所述的組合物。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，于此 所述的組合物，例如預(yù)充滿的注射器也可在損傷后任何時(shí)間，而不限于損傷短時(shí)間內(nèi)給予/ 使用。當(dāng)該實(shí)施方案用于上下文中時(shí)，“損傷后短時(shí)間”指在損傷或?qū)е聯(lián)p傷事件發(fā)生后 約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘或甚至多達(dá)約1小時(shí)內(nèi)的時(shí)間。所述組合物 可通過專業(yè)醫(yī)師給予，或在某些情況下通過有權(quán)使用包含適當(dāng)使用量的因子包裝單位的非 專業(yè)醫(yī)師給予。在專業(yè)醫(yī)師，例如救護(hù)技師、護(hù)士、醫(yī)生等情況下，可在患者患諸如中風(fēng)的神 經(jīng)外傷之區(qū)域進(jìn)行給藥，當(dāng)正運(yùn)輸?shù)结t(yī)院(或其他醫(yī)療設(shè)施)時(shí)在救護(hù)車或其他運(yùn)輸工具 中，或在醫(yī)院，例如急救室中進(jìn)行給藥。無意于為理論所限，在損傷后短時(shí)間內(nèi)給予包含一 種或多種造血因子，例如G-CSG和/或GM-CSG的組合物，可獲得最大的神經(jīng)保護(hù)效力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明也提供了 一種特別適用于緩釋和長期穩(wěn)定應(yīng)用的裝 置，其可以是植入的微泵，優(yōu)選是植入皮下(例如，EdithMathiowitz ；(編)Encyclopedia of Controlled Drug Delivery, Johnffiley & Sons vol. 2，pp. 896-920，1999 中所述的)。已 知該泵可用于胰島素治療。該泵的實(shí)例包括那些為Animas，Dana Diabecare,DeltecCozm, Disetronic Switzerland, Medtronic和Nipro Ami go制造/銷售的，以及描述于例如美國 專利號(hào)5474552 ；6558345 ；6122536 ；5492534和6551276中的那些，其相關(guān)內(nèi)容在此并入作 為參考。本發(fā)明也提供了一種測(cè)量G-CSF或GM-CSF內(nèi)源性血清水平的裝置，基于 此，考慮到年齡和體重，計(jì)算并注射入適當(dāng)量的藥物(例如，Renard E.，Curr Op in Pharmacol. 2002Dec ；2 (6) 708-16中所述的)?？砷L期進(jìn)行，例如通過使用上述微泵或 短期進(jìn)行。上述裝置的一個(gè)實(shí)例是由Medtronic minimet (Medtronic MiniMed, 18000 DevonshireStreet, Northridge, CA 91325-1219)公司所生產(chǎn)的用于胰島素治療的裝置。 一種測(cè)量GCSF或GMCSF血清水平的方法可使用蛋白質(zhì)芯片或陣列來實(shí)現(xiàn)，例如，美國專利 6，630，358 ；6, 537，749和6，475，809中所描述的，其相關(guān)內(nèi)容在此并入作為參考。在慢性神經(jīng)變性疾病，例如，帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、癡呆等的治療 中，上述使用泵的藥物遞送和/或GSCF和/或GCCSF血清水平檢測(cè)的實(shí)施方案可特別有 用。給藥途徑可包括常規(guī)途徑，包括，例如，經(jīng)口，皮下，經(jīng)皮、皮內(nèi)、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、肌 內(nèi)、靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)、通過直接注射至腦以及腸胃外。此外，在某些環(huán)境中，經(jīng)肺給藥可能有 用，如肺噴霧劑和其他可呼吸劑型。除了肺噴霧劑外，鼻內(nèi)(IN)遞送(例如通過鼻噴霧劑)是一種優(yōu)選的給予遞送本 發(fā)明用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病/精神病的組合物的施用模式。鼻內(nèi)遞送特別適合蛋白質(zhì)或肽的施 用模式，是十分方便使用的，特別適用于長期治療。使用鼻內(nèi)遞送(鼻噴霧劑)肽或蛋白質(zhì) 至腦的實(shí)例可見(Lyritis 和 Trovas(2002)，Bone，30，71S-74S，Dhillo 和 Bloom(2001)， Curr Opin Pharmacol,1,651-5, Thorne and Frey(2001), Clin Pharmacokinet,40, 907-46，Tirucherai，等.(2001)，Expert OpinBiol Ther, 1,49-66, Jin，等.(2003)，Ann Neurol, 53,405-9, Lemere,^ . (2002)，Neurobiol Aging, 23,991-1000, Lawrence (2002)，Lancet，359，1674，Liu，等· (2001), Neurosci Lett，308，91-4)。對(duì)于鼻內(nèi)施用而言，GCSF/ GMCSF和其他于此所述的組合物可與溶劑、去污劑及能增加鼻上皮滲透性或遞送至血管的 物質(zhì)結(jié)合使用，所述物質(zhì)例如能擴(kuò)大鼻血管、增加灌注等的藥物?；诮o藥模式，以及考慮到所涉及的相關(guān)藥物代謝動(dòng)力學(xué)，所述劑量可進(jìn)一步改 變，如直接注射入腦的劑量應(yīng)當(dāng)較低，且應(yīng)指明為絕對(duì)劑量，是基于GCSF、GMCSF或它們的 衍生物的局部有效性(如，5 μ g總劑量)。優(yōu)選地，GCSF、GMCSF和其他造血因子及它們的 衍生物經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下給予，或通過大腦內(nèi)直接注射給予，可用滲透泵進(jìn)行給藥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GCSF、GMCSF和其他造血因子及它們的衍生物可通過給予一 種或多種編碼這些因子的核酸而提供給個(gè)體。所述編碼序列核酸優(yōu)選以重組載體形式給 予，例如以病毒載體形式。合適載體、表達(dá)控制序列的選擇及載體構(gòu)建方法是公知的。病毒 載體的實(shí)例包括腺病毒(Acsadi 等.，Hum. Gene Ther. 7 (2) 129-140 (1996) ；Quantin 等·， PNAS USA 89(7) :2581_2584(1992)；和 Ragot 等.，Nature 361(6413) :647_650(1993))、 腺伴隨病毒載體(Rabinowitz 等.，Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5) 470-475 (1998))、逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體(Federico, Curr. Opin. Biotechnol. 10(5) :448_453 (1999))、單純皰疹病毒載體 (Latchman,基因264 (1) 1-9 (2001))、慢病毒載體、辛德比斯病毒載體或Semliki森林病毒 載體。合適的載體也可以是包含蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體，其可結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞，如病毒表位，并含有 編碼GSCF或GMCSF的核酸、或蛋白質(zhì)、或寡核苷酸。上述輸送系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例是HVJ-脂質(zhì) 體(Kaneda，等· (2002),Mol Ther,6,219-26. Kaneda(1999),Mol Membr Biol,16，119—22)。 優(yōu)選地，所述分離的和純化的編碼并表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽的核酸是可操作地連接于啟動(dòng)子， 所述啟動(dòng)子適用于在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。這些和其他合適的載體述評(píng)于Kay等.，Nature Medicine 7:33—40(2001) ；Somia 等· ，Nature Reviews 1:91—99(2000)；禾口 van Deutekom 等.，Neuromuscular Disorders 8 135-148(1998)中。適用于可操作連接至所述分離的和純化的核酸的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。優(yōu) 選地，所述分離的和純化的編碼多肽核酸是可操作地連接于啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子選自 肌肉肌酸激酶(MCK)啟動(dòng)子(Jaynes 等.，Mol. Cell Biol. 6 =2855-2864(1986)),巨 細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、四環(huán)素/多西環(huán)素調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子(Gossen等.，PNAS USA 89: 5547-5551(1992))。一般來說，為確保本發(fā)明載體的有效轉(zhuǎn)化，對(duì)每個(gè)要接觸的細(xì)胞使用約1至約 5，000拷貝的載體，基于要接觸的細(xì)胞的大概數(shù)量并考慮到特定的給藥途徑，其更優(yōu)選為每 一細(xì)胞轉(zhuǎn)化約3至約300pfu。這些病毒的量可根據(jù)需要和是否在體外或體內(nèi)使用而有所變 化。實(shí)際劑量和用藥方案也可取決于所述組合物是否與諸如藥物組合物的其他組合物聯(lián)合 給藥，或取決于藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物分布和代謝的個(gè)體差異而有所變化。同樣地，體外施 用的數(shù)量可取決于細(xì)胞的特定類型或載體轉(zhuǎn)化手段而有所變化。上述蛋白質(zhì)或其衍生物、物質(zhì)或核酸可根據(jù)本領(lǐng)域可用到的標(biāo)準(zhǔn)程序配制用于醫(yī) 學(xué)目的，如可添加藥學(xué)上可接受載體(或賦形劑)。載體或賦形劑可以是固體、半固體或 液體物質(zhì)，其可作為活性成分的載體或介質(zhì)?；谒x擇產(chǎn)物的特性、所要治療的疾病或 病癥、疾病或病癥的階段及其他相關(guān)情況，可選擇合適的給藥形式和模式(Remington' s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co. (1990))。藥學(xué)上可接受載體或賦形劑的 比例和性質(zhì)決定自所選擇物質(zhì)的溶解性和化學(xué)性質(zhì)、所選擇的給藥途徑以及標(biāo)準(zhǔn)的配藥
30實(shí)踐。所述藥物制備物可適合于經(jīng)口、腸胃外或局部使用，并可以片劑、膠囊、栓劑、溶液、混 懸液等劑型給予患者。本發(fā)明的生長因子、其衍生物、其核酸編碼序列，當(dāng)其有效時(shí)，為了穩(wěn) 定性、便于結(jié)晶、增加溶解性等目的，可配制為并以藥學(xué)上可接受的鹽給予，例如酸式鹽或 堿式鹽。對(duì)于某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是在局部缺血疾病中，治療的關(guān)鍵在于有效治療而 非延遲發(fā)作。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其中GCSF、GMCSF、它們的衍 生物、激活STAT蛋白的物質(zhì)、或GCSF或GMCSF受體的激動(dòng)劑可在血管閉塞、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀 發(fā)作、或其他可檢測(cè)的局部缺血事件發(fā)作后24小時(shí)內(nèi)、優(yōu)選10小時(shí)內(nèi)，最優(yōu)選3-6小時(shí)內(nèi) 給予。GCSF和GMCSF對(duì)長期功能改善也具有益效應(yīng)，因此可在局部缺血損傷相當(dāng)一段時(shí)間 后開始治療(如損傷后1-7天)。局部缺血事件發(fā)生后，治療可持續(xù)幾天、幾周，作為一種手 段來改善患者的功能恢復(fù)，類似于在我們的長期皮層梗塞模型中所見到的功能改善(參見 圖8)。治療可以是每天幾個(gè)劑量(如短暫的靜脈注射輸注)，以使GCSF、GMCSF或相關(guān)因子 達(dá)到穩(wěn)定的最低水平。治療亦可包括持續(xù)緩慢輸注所述物質(zhì)(如，通過注樣器設(shè)備)予患 者以達(dá)到穩(wěn)定的血清水平。在諸如帕金森氏癥或肌萎縮性側(cè)索硬化的慢性神經(jīng)變性過程的情況下，治療更有 可能是GCSF或相關(guān)因子的日劑量，或優(yōu)選使用緩釋劑型，或GCSF或相關(guān)因子更穩(wěn)定的衍生 物。篩選與神經(jīng)細(xì)胞上GCSF或GMCSF受體結(jié)合的神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)為了實(shí)施本發(fā)明，優(yōu)選GCSF、GMCSF衍生物(如GCSF或GMCSF模擬物)和/或其 他造血因子，所述其他造血因子保留了其保護(hù)神經(jīng)元潛能并還具有對(duì)白細(xì)胞減少的作用， 因此減少了潛在的不利效應(yīng)。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是篩選結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞上GCSF或 GM-CSF受體的化合物，所述化合物能刺激如本申請(qǐng)中所述的GM-CSF或GCSF所觀察到的神 經(jīng)保護(hù)效力。GCSF衍生物，如GCSF模擬物，可在如實(shí)施例10所例證的體外神經(jīng)保護(hù)分析中得 到測(cè)試。該神經(jīng)保護(hù)分析可有所變化，而不改變?cè)摐y(cè)試的基本原理，是通過改變，例如(i) 其他的損刺激物如白介素-1、缺氧、A4肽、FAS配體或(ii)其他細(xì)胞，如神經(jīng)元樣細(xì)胞如 SH-SY5Y細(xì)胞，或PC12細(xì)胞，或(iii)用于細(xì)胞生存能力或細(xì)胞死亡的其他示值讀數(shù)，例如 DNA-斷裂，核凝聚，共轉(zhuǎn)染的0 -半乳糖苷酶活性、檢測(cè)半胱天冬酶的熒光生成底物等的示 值讀數(shù)。所有這些眾多的改變是公知的并也可用于高通量系統(tǒng)。高通量篩選技術(shù)一般用于 定義大規(guī)模地細(xì)胞快速處理。在該分析中證實(shí)具有確定神經(jīng)保護(hù)效力的物質(zhì)可進(jìn)一步測(cè)試 其粒細(xì)胞生成活性，如Tian等.，Science 281，257-259中所描述的。GCSF衍生物的選擇 優(yōu)選基于將測(cè)試物質(zhì)得到的這兩種特異效應(yīng)與由已知類型GCSF所得到的那些效應(yīng)進(jìn)行比 較。同樣地，GMCSF衍生物，如GMCSF模擬物也可在所述用于GCSF的體外神經(jīng)保護(hù)分析中 受測(cè)試。通過測(cè)定活性轉(zhuǎn)錄因子的存在可獲得更多的神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)，所述活性轉(zhuǎn)錄因子例 如STAT蛋白，包括將這些細(xì)胞暴露于測(cè)試物質(zhì)后，在神經(jīng)元或神經(jīng)元樣細(xì)胞(例如，PC12、 SH-SY5Y、hNT、NT2、hn33)中的STAT-3和STAT-5。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中， 在于此所述的神經(jīng)元樣細(xì)胞中并使用常規(guī)的基因表達(dá)測(cè)定法，例如使用了 LightCycler 或Taqman 分析的定量PCR，特定物質(zhì)或化合物作為GCSF或GMCSF受體激動(dòng)劑的能力通過STAT蛋白的激活可得到評(píng)估，所述STAT蛋白如STAT3和/或STAT5。活化的STAT蛋白是磷酸化形式(pSTAT)并能在蛋白質(zhì)印跡或免疫組化研究或 ELISA中通過使用可商購的pSTAT特異性抗體(SantaCruz Biotechnology)而得到檢測(cè)?；蛘?，可使用報(bào)道基因構(gòu)建體測(cè)定STAT活性，該構(gòu)建體包括STAT-應(yīng)答啟動(dòng)子元 件(例如，多聚化STAT-結(jié)合元件，例如多聚化STAT-3或STAT-5結(jié)合元件)，其連接至報(bào)道 基因，例如熒光素酶、SEAP(分泌型堿性磷酸酶)、氯霉素轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP) 或其他常見的報(bào)道基因。在用報(bào)道基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，將細(xì)胞與測(cè)試物質(zhì)接觸并確定 報(bào)道基因表達(dá)量。該測(cè)定STAT活性的方法適用于高通量形式。可使用典型的報(bào)道基因測(cè)定法，例如，使用商業(yè)化的鑒定系統(tǒng)(Clontech的 Mercury Pathway Profiling System ;Stratagene 白勺 PathDetect—System)。實(shí)§1方胃白勺一 個(gè)實(shí)例可按如下操作。在多孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞，如在96孔板中，密度20，000細(xì)胞/孔。細(xì)胞 接種兩天后，將培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基(40 μ 1/孔)并在對(duì)于每一細(xì)胞類型而言 最佳的條件下(例如PC-12細(xì)胞可通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，該方法使用了推薦的 LIP0FECTAMINE2000 , Invitrogen)，用報(bào)道基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該質(zhì)粒編碼STAT-結(jié)合元 件和報(bào)道蛋白(STAT-3蟲熒光素酶質(zhì)粒；50ng/孔)，亦轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒(renilla-熒光素酶 表達(dá)質(zhì)粒；10-20ng/孔)。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后就可運(yùn)行該測(cè)定法。用多種濃度的測(cè)試物質(zhì) 刺激細(xì)胞，其濃度范圍覆蓋應(yīng)寬。在刺激開始的5分鐘內(nèi)應(yīng)當(dāng)選擇多次測(cè)定的時(shí)間點(diǎn)。當(dāng) 使用熒光素酶測(cè)定法時(shí)，讀數(shù)可確定自光度計(jì)，平板形式(Berthold，Germany)，分階段測(cè) 量renilla和蟲熒光素酶活性?？赏ㄟ^使用商購的檢測(cè)試劑盒(雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè) 試劑盒，Promega ；熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)試劑盒，Clonetech)進(jìn)行兩種熒光素酶活性的檢 測(cè)。然后，將蟲熒光素酶值對(duì)renilla熒光素酶值歸一化，并計(jì)算報(bào)道基因的相對(duì)誘導(dǎo)值 (relativeinduction)。在一個(gè)可選的篩選方法實(shí)例中，可利用并測(cè)定作用于神經(jīng)元細(xì)胞上GCSF或 GMCSF受體的激動(dòng)劑的活性。例如，可通過使用熒光共振轉(zhuǎn)移能量測(cè)定法(FRET，或 BRET (生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移法)(Siegel RM 等 Sci STKE (2000) 2000 (38) =Ll ；Xu Y 等 Proc NatlAcad Sci USA(1999) 96 (1) :151_6)，用于二聚化事件的報(bào)道基因系統(tǒng)，如雙轉(zhuǎn) 換系統(tǒng)(DE 10211063. 8), β -半乳糖報(bào)道基因系統(tǒng)(Rossi F等Proc Natl Acad Sci USA(1997)94(16) :8405_10)或分裂-泛肽(split-ubiquitin)系統(tǒng)(W0 954/29195，US 5，585，245，或 Johnson，N.和 Varshavs，Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91 (22) 10340-4) 來分析配體結(jié)合上同二聚化作用。在本發(fā)明中提供了另外可選的方法，用于篩選結(jié)合神經(jīng)元細(xì)胞上GCSF和GMSCF的 神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)，該物質(zhì)對(duì)GCSF和/或GMCSF腦內(nèi)源性水平產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。于此所述及如下 實(shí)施例所證明，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)GCSF和GMCSF作為腦內(nèi)源性配體。這些配體為一些腦局部 缺血病癥所誘導(dǎo)。因此，它們作為腦內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)系統(tǒng)的一部分。在相同意義上，作為外 源性添加的GCSF或GMCSF，其通過血腦屏障對(duì)于許多病癥是有益的，在這里神經(jīng)保護(hù)作用 是一種有效的治療原則，增加GCSF/GMCSF腦內(nèi)源性水平的藥物可有益于這些病癥?？梢栽谂囵B(yǎng)基中添加物質(zhì)(例如來自大量小分子文庫)到細(xì)胞，所述細(xì)胞如神經(jīng) 元細(xì)胞、初級(jí)細(xì)胞或神經(jīng)元樣無限增殖細(xì)胞，例如PC12細(xì)胞、SHSY5細(xì)胞等，并測(cè)定GCSF和
32GMCSF水平的基本方式，以建立用于鑒定上述物質(zhì)的篩選系統(tǒng)。可通過測(cè)定其蛋白質(zhì)(通過蛋白質(zhì)印跡、ELISA、RIA和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 技術(shù))、測(cè)定編碼這些蛋白質(zhì)的mRNA (例如定量PCR、RNA印跡、RNAse保護(hù)分析、RNA斑點(diǎn)印 跡和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知技術(shù))或通過測(cè)定該基因調(diào)控元件對(duì)GCSF/GMCSF活性，從而 測(cè)定了 GCSF/GMCSF的水平。優(yōu)選地，調(diào)控元件的活性可通過報(bào)道基因構(gòu)建體得到確定，該 構(gòu)建體由來自啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和/或與編碼報(bào)道分子的cDNAs連接的基因內(nèi)元件(例如熒 光素酶，半乳糖苷酶，綠色熒光蛋白或其他能容易測(cè)定的報(bào)道基因)的DNA片斷組成。 這些報(bào)道基因構(gòu)建體可轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，可以是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。所述細(xì)胞可在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)，或額外暴露于傷害性刺激(例如缺氧/葡萄糖喪 失、NO供體、谷氨酸鹽過量等)，以觀察添加各種要測(cè)試物質(zhì)的伴隨效應(yīng)。通過將所鑒定的物質(zhì)給予動(dòng)物，并測(cè)定腦中GCSF/GMCSF含量(如，通過定量PCR) 可對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增加GCSF和GMCSF受體的表達(dá)水平可用于增加細(xì)胞對(duì)配體 的應(yīng)答性。因此，以上概述的篩選方法也可適用于篩選受體表達(dá)的增加。業(yè)已概述了本發(fā)明，可通過所涉及的某些特定實(shí)施例以得到進(jìn)一步的理解，所述 于此提供的實(shí)施例目的僅在于例證，而無意于限制，除非另有指定。實(shí)施例本發(fā)明下列實(shí)驗(yàn)闡明了 GCSF的體外神經(jīng)保護(hù)作用，在瞬時(shí)局灶性腦缺血后，GCSF 顯示了明顯的梗塞減輕效應(yīng)。除了對(duì)側(cè)上的神經(jīng)元外，梗塞形成周圍的神經(jīng)元顯示了與抗 GCSFR-抗體特異性的結(jié)合，表示具有GCSF受體。神經(jīng)元上GCSFR的存在是新發(fā)現(xiàn)，可通過對(duì) 腦進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡、RT-PCR和詳細(xì)的免疫組化以及對(duì)培養(yǎng)的初級(jí)神經(jīng)元進(jìn)行PCR和免疫細(xì) 胞化學(xué)而得到驗(yàn)證。此外，相較于對(duì)照組，為STAT3核易位所鑒定的STAT3激活作用在GCSF 治療的動(dòng)物半影神經(jīng)元中顯著增加，暗示該作用的GCSFR/STAT介導(dǎo)機(jī)制。在體內(nèi)局部缺血 實(shí)驗(yàn)中(大腦中動(dòng)脈閉塞，MAC0)，當(dāng)通過激光多普勒血流儀(ldf)測(cè)定比較這兩組時(shí)，對(duì)腦 血流量沒有影響。在MAC0實(shí)驗(yàn)過程中，在這兩組間生理參數(shù)和體重下降沒有顯著差異。在 MCA0實(shí)驗(yàn)中，相較于對(duì)照組，在GCSF處理的動(dòng)物中死亡率得到顯著改善。相較于對(duì)照組， 在GCSF處理動(dòng)物24小時(shí)后嗜中性血細(xì)胞計(jì)數(shù)(NGC)顯著增加。髓過氧化物酶(MP0)-染 色用于測(cè)定中性粒細(xì)胞(NGs)侵入局部缺血半球，在GCSF處理的動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物之間沒有 顯著差異。在該實(shí)驗(yàn)中使用的靜脈注射遞送的GCSF劑量(60P g/kg/體重)與用于其他實(shí)驗(yàn) 條件的劑量相當(dāng)。在初期試驗(yàn)計(jì)劃前就業(yè)已測(cè)試了安全性，因此沒有觀察到明顯的副作用。 該劑量(eoyg/kg/體重)高于用于治療人脊髓發(fā)育不良和其他疾病的批準(zhǔn)劑量6倍，且在 大鼠模型中沒有顯示可評(píng)估的副作用。使用GCSF所達(dá)到的50%梗塞減小結(jié)果與其他諸如bTOF或IGF的生長因子全身給 藥后的結(jié)果相當(dāng)(Fisher M 等 ，J :Cereb. BloodFlow Metab.，1995 ；15 :953_9 ；Schabitz WR，等.，Stroke 2001 ；32 1226-33)。似乎葡萄糖喪失、興奮性中毒、伴發(fā)的細(xì)胞Ca2+過載 及細(xì)胞凋亡、活性氧簇、以及面對(duì)增加的需要量而減少的能量儲(chǔ)備(如來自擴(kuò)散性抑制)是 局部缺血后神經(jīng)元細(xì)胞死亡的主要原因(Lee JM.等.，Nature 1999 ；399(Suppl) :A7_14)。 如實(shí)施例所證實(shí)，GCSF在體外保護(hù)神經(jīng)元樣細(xì)胞(NGF-分化的PC12細(xì)胞)抗H202誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。H2O2通過產(chǎn)生活性氧簇(ROS)而引起氧化應(yīng)激，其引起細(xì)胞死亡。依據(jù)細(xì)胞表 型、劑量、時(shí)程和所涉及的信號(hào)途徑，H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可得到充分鑒 定。在許多研究中H2O2大量使用支持了細(xì)胞凋亡機(jī)制是細(xì)胞中H2O2效應(yīng)的結(jié)論(參見，例如 FASEB J. 2002Jan ； 16(1) :111_3 J Cell Biochem 2001 ；82 (3) :437_44)。例如，在H2O2介導(dǎo) 的細(xì)胞死亡中業(yè)已令人信服地證實(shí)了激酶ASKl和Fas配體在細(xì)胞凋亡前的作用(Tobiume K, EMBO Rep 200IMar ；2 (3) 222~8 ； Kwon, D.，J Neuroimmunol. 2001 Feb 1 ；113(1) :1_9 ； Facchinetti，F(xiàn).，JNeurosci Res. 2002Jul 15 ；69 (2) 178-88.) 因此，有可能 GCSF 干擾 了引起腦缺血的細(xì)胞凋亡機(jī)制。GCSF作用可能是通過結(jié)合高親和力受體GCSFR而得到介 導(dǎo)。與其受體相互作用激活了 Janus家族激酶(JAKs)和STATs (Darnell JE Jr. ,Science 1997 ；277 :1630-5)。JAK是非受體型酪氨酸蛋白激酶，在配體誘導(dǎo)的受體二聚化中得到激 活。在保守的酪氨酸殘基上，GCSF誘導(dǎo)JAKs激活磷酸化STATs，其引起STAT 二聚化(Quelle FW，等.，Mol. Cell Biol. 1994 ；14 :4335_41)。此外，STATs易位至細(xì)胞核并隨后調(diào)節(jié)基因 表達(dá)(Shuai K，等.，Nature 1993 ；366 :580_3 ；Shuai K.，Oncogene 2000 ；19 :2638_44)。 STAT3 是為 GCSFR 所激活的主要 STAT 蛋白(Shuai K.，Oncogene 2000 ； 19 2638-44)。 STAT3通過激活bcl-2介導(dǎo)抗細(xì)胞凋亡功能，并通過上調(diào)原癌(c-myc)基因誘導(dǎo)粒細(xì)胞增 殖和分化(Fukada T, Immunity 1996 ；5 449-60 ；Shimozaki K, J :Biol. Chem 1997 ；272 25184-9)。于此所示，通過使用免疫組化、RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡，GCSFR并不僅僅存在于造 血細(xì)胞，也存在于神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)元干細(xì)胞。此外，GCSF在半 影神經(jīng)元中誘導(dǎo)的STAT3上調(diào)可介導(dǎo)抗細(xì)胞凋亡作用，如所示作用于BDNF或bFGF的bcl_2 上調(diào)(Schabitz WR，等.，Stroke 2001 ;32 :1226_33)，并提供了神經(jīng)元生存的營養(yǎng)支持。 梗塞形成的半影中稠密的STAT3核標(biāo)記能反映膜受體-介導(dǎo)的STAT3從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核 的易位，其也顯示為腦缺血后激活的小膠質(zhì)細(xì)胞(PlanasAM，等.，Eur. S =Neurosci. 1996 ； 8:2612-8)。已知GCSF能刺激釋放、增強(qiáng)效應(yīng)子作用并通過延遲中性粒細(xì)胞(NGCs)的細(xì) 胞凋亡性細(xì)胞死亡而延壽、增強(qiáng)身體對(duì)所有類型感染的第一道防線(Hartimg Curr Opin Hematol 1998;5:221-5)。嗜中性粒細(xì)胞可閉塞微脈管，隨后侵入白細(xì)胞引起已知能增大 梗塞體積并惡化腦缺血后果的蛋白水解酶、氧自由基、白介素和TNF- α -效應(yīng)的釋放(Del Zoppo GJ, Stroke 1991 ；22 1276-83 Jean WC，等·，Neurosurgery 1998 ；43 1382-96 ； Matsuo Y，等.，Brain Res. 1994 ；656 :344_52)。與之相反，GCSF具有顯著的抗炎作用 在外周感染模型中GCSF減少了 TNF-α、IL-I β , IL-2、IL-6和IL-8，并提高了 IL-1 β受 體拮抗劑水平(GorgenL 等·，J Immunol 1992 ； 149 :918_24 ；Heard S0，等·，Crit. Care Med. 1999；27 1019-21 ；Heard SO,等·，Crit. Care Med. 1998 ；26 :748_54 ；Hebert JC, 等·，Arch. Surg. 1990 ；125 1075-8 ；Lundblad R，等.，Crit. Care Med. 1996；24 :820_6·； Squadrito F，等.，Br Pharmacol 1997;120:333-9)。GCSF 減少了 TNF-α 在體外和健康 志愿者體內(nèi)的釋放，并提高TNF、IL-6、IL-8和IL-1拮抗劑水平(Hartung T. Curr Opin Hematol 1998 ；5 221~5 ；Gorgen I，等·，J. Immunol. 1992 ； 149 :918_24 ；HeardSOn等·，Crit Care Med 1999 ;27 :1019_21)。此外，在內(nèi)臟局部缺血模型中觀察到了肺和回腸中減少的嗜 中性粒細(xì)胞滲透，給予GCSF15分鐘后的再灌注以及小腸的再灌注(Squadrito F，等.，Br J Pharmacol 1997 ；120 :333_9.)。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是在局部缺血半球中并沒有發(fā)現(xiàn)嗜中性 粒細(xì)胞滲透的增加，盡管在GCSF處理后總的中性粒細(xì)胞(NGCs)增加了。
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另一可能的生長因子作用機(jī)制，具體而言bFGF的作用機(jī)制包括對(duì)腦血流量的 影響。bFGF處理使局部缺血區(qū)周圍側(cè)突擴(kuò)大，甚至在并不促進(jìn)全身性低血壓的情況下亦 然，因此增加 了半影區(qū)的血流量(Tanaka R，等.，Stroke 1995 ；26 2154-8 ；discussion 2158-9)。然而，如此所示，相較于對(duì)照組，通過LDF測(cè)定的GCSF處理并不減少全身血壓或
改變腦血流量。在光誘導(dǎo)血栓形成的孟加拉玫瑰紅模型中，光誘導(dǎo)血栓形成性中風(fēng)6周后，局部 缺血后靜脈內(nèi)GCSF處理明顯地改善了感覺運(yùn)動(dòng)功能的結(jié)果，進(jìn)一步支持了，即在體內(nèi)外傷 性腦損傷后，生長因子誘導(dǎo)恢復(fù)及再生。之前報(bào)道兩種其他化合物，堿性成纖維細(xì)胞生長因 子(bFGF)和成骨蛋白-l(OP-l)能改善感覺運(yùn)動(dòng)功能并在局灶性腦缺血后能誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā) 芽(Kawamata 等 Proc Natl Acad Sci USA 1997 ;94 :8179_84 ;Kawamata 等 Neuror印ort 1998 ；9 :1441-5 ；Ren 等 Neuropharmacology 2000 ；39 860-5)。在大多數(shù)這些研究中，在腦 室中給予生長因子被認(rèn)為在臨床上是不恰當(dāng)?shù)?。R有Ramirez等.(Ramirez，等.(1999)， Neuroreport, 10，1201-4.)報(bào)道了在靜脈內(nèi)給予bFGF，證實(shí)了損傷誘導(dǎo)的海馬發(fā)芽，但作 者沒有研究功能結(jié)果的措施。在此出現(xiàn)的該結(jié)果顯示了臨床上相關(guān)的GCSF給予劑量方案 誘導(dǎo)了腦缺血后的功能恢復(fù)。很明顯，用于增強(qiáng)可塑性的能力不限于局部缺血腦損傷，也包 括與神經(jīng)變性疾病相關(guān)，例如帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、三核苷酸串聯(lián)重復(fù)疾 病、基于復(fù)蘇或產(chǎn)時(shí)問題的腦缺血、可能也與諸如阿爾茨海默氏病的癡呆相關(guān)，以及與精神 分裂癥的神經(jīng)變性方面相關(guān)。腦缺血實(shí)驗(yàn)方法概述通過使用大鼠大腦中動(dòng)脈縫合閉塞模型(90分鐘)誘導(dǎo)局部缺血。局部缺血誘發(fā) 30分鐘后，由靜脈內(nèi)持續(xù)90分鐘給予動(dòng)物(每組n = 12)60 yg/公斤體重的GCSF或載體。 基于局部缺血24小時(shí)后TTC(2，3，5-氯化三苯四唑)染色來計(jì)算梗塞體積。通過免疫組化 研究GCSFR表達(dá)，通過RT-PCR合免疫印跡驗(yàn)證。通過免疫組化研究STAT3表達(dá)。在孟加拉 玫瑰紅光誘導(dǎo)血栓形成模型中研究GCSF在功能恢復(fù)中的功效。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在該研究中數(shù)值表示為均值士SD。在獲取所有數(shù)據(jù)后，打亂隨機(jī)編碼。AN0VA法 和在此之后的Fisher保護(hù)的最小顯著差數(shù)檢驗(yàn)或Bonferroni校正可用于測(cè)定體外數(shù)據(jù)和 生理參數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性。t檢驗(yàn)可用于比較尸檢梗塞體積、MP0和STAT3免疫組化。 可對(duì)死亡率數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。p值< 0. 05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。結(jié)果GCSF將梗塞體積減少至 131. 96mm3士 112. 7mm3，對(duì)照組中為 278. 9mm3士91. 56mm3(p < 0. 05)。免疫組化、蛋白質(zhì)印跡和RT-PCR揭示了在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中存在GCSF受 體。相較于對(duì)照組，在梗塞形成周圍GCSF有效激活STAT3(p< 0.05)。GCSF能有效地改善 孟加拉玫瑰紅光誘導(dǎo)血栓形成模型中局部缺血后的功能恢復(fù)。因此，已經(jīng)證實(shí)了在細(xì)胞培養(yǎng)物中及在局灶性腦缺血后GCSF具有有效的神經(jīng)保 護(hù)效應(yīng)。該效應(yīng)似乎為GCSFR與STAT3激活之間的相互作用所介導(dǎo)。實(shí)施例1-局灶性腦缺血誘導(dǎo)局灶性腦缺血(MCA0，大腦中動(dòng)脈閉塞)程序?qū)嶒?yàn)方案為地方倫理委員會(huì)所批準(zhǔn)。將24只重量為280_320g的雄性Wistar大鼠(Charles River, Germany)隨機(jī)分組如下A (對(duì)照組，η = 12，局部缺血持續(xù)90分鐘， 在血管閉塞開始30分鐘后用2ml0. 9%鹽水處理90分鐘)；B(GCSF組，η = 12，局部缺血持 續(xù)90分鐘。在血管閉塞開始30分鐘后用60 μ g/公斤體重的溶解于2ml 0. 9%鹽水的重組 人 GCSF，Neupogen , Amgen, Europe B. V.，Netherlands 處理 90 分鐘)?；蛘?，任何的
GCSF或衍生物或其他來源的制劑(另外的制造商(如Roche的Lenogastrim 、Chugai的 Granocyte 、HGS 的 Albugranin 或 Roche/Amgen 的 Neulasta )也可在此使用。然后通過向腹膜內(nèi)注射IOOmg/公斤體重的鹽酸氯胺酮(WDT，Garbsen, Germany) 麻醉動(dòng)物。如必要的話，麻醉可維持在50mg/公斤體重?？蓪E-50聚乙烯導(dǎo)管插入右股 動(dòng)脈用于平均動(dòng)脈壓、血?dú)狻⒀?xì)胞比容、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血糖水平的連續(xù)監(jiān)測(cè)?？蓪E-50 導(dǎo)管插入右股靜脈用于處理注入物。在實(shí)驗(yàn)過程中，監(jiān)測(cè)直腸溫度并通過恒溫控制加熱墊 (Fohr Medical Instruments, Germany)維持在37°C。通過使用縫合閉塞模型誘導(dǎo)瞬時(shí)局 灶件腦缺血，該樽型詳細(xì)描沭于ZeaLonga等.(Stroke 1989 ;20 :84_91)中。簡言之，通 過頸中線切口暴露右頸部總動(dòng)脈和右頸外動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈中通過動(dòng)脈切除術(shù)將涂有硅 (Bayer, Germany)的4_0單絲尼龍縫線(Ethicon，Germany)插入，輕輕地進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈并 定位于離頸動(dòng)脈杈約17mm處。使用該技術(shù)，縫合頂端單側(cè)閉塞了近端的大腦前動(dòng)脈、MCA起 端及后交通動(dòng)脈。通常，在MCA區(qū)域產(chǎn)生了大范圍梗塞。在導(dǎo)管閉塞后90分鐘，通過取回 閉塞細(xì)絲進(jìn)行再灌注。對(duì)模擬手術(shù)動(dòng)物進(jìn)行上述相同實(shí)驗(yàn)程序，但尼龍絲沒有進(jìn)入頸總動(dòng) 脈遠(yuǎn)端，因此不形成梗塞。在手術(shù)后，移去導(dǎo)管，允許動(dòng)物從麻醉中恢復(fù)并隨意給予食物和 水。局部腦血流量測(cè)量法在MCA閉塞前、閉塞過程中及閉塞后，使用激光多普勒血流儀(LDF) (Periflux 4001Master, Perimed AB, Sweden)監(jiān)測(cè)腦血流量(CBF)。在將動(dòng)物置于立體定位架后，暴露 動(dòng)物顱骨并在顯微鏡下在右側(cè)4mm外側(cè)和前囟尾側(cè)2mm處鉆一個(gè)直徑1. 5mm的孔。取下完 整的硬腦膜并將LDF探頭(直徑1. 4mm)置于頭顱鉆孔處。選擇相應(yīng)于大鼠MCA閉塞模型 缺血半影區(qū)的區(qū)域進(jìn)行CBF監(jiān)測(cè)。梗塞體積計(jì)算MCA閉塞24小時(shí)后，用150mg/公斤體重的氯胺酮麻醉大鼠并斬首。解剖腦并切成 5個(gè)2mm厚的冠狀面切片，在2%的2，3，5-氯化三苯四唑(TTC)溶液中于37°C溫育30分鐘 并通過浸于10%甲醛緩沖液中進(jìn)行固定。使用電荷耦合器件照相機(jī)(EDH-1000HR計(jì)算機(jī)照 相機(jī)，Electrim Corporation,Princetown,NJ,USA)對(duì)TTC-染色的切片照相。研究人員使 用計(jì)算機(jī)圖象分析儀(Bio Scan Optimas,Edmonds,WA)接儀表操作測(cè)定梗塞體積。為補(bǔ)償 腦水腫造成的影響，如前詳述計(jì)算校正的梗塞體積校正的梗塞區(qū)相當(dāng)于左半球區(qū)_(右半 球區(qū)-梗塞區(qū))(SchabitZ WR，等.，Stroke 2001 ；32 1226-33)。梗塞體積表示為對(duì)側(cè)半 球的百分比。局部缺血實(shí)驗(yàn)在局灶性腦缺血后GCSF實(shí)現(xiàn)了有力的神經(jīng)保護(hù)效果。腹膜內(nèi)GCSF處理的動(dòng)物 平均梗塞體積為131. 96mm3+112. 7mm3,對(duì)照組為278. 9mm3士91. 56mm3 ；或?yàn)榭偟陌肭虻?9. 96 士8. 31% (η = 12)，對(duì)照組為 22. 7 士6. 69% (ρ < 0. 05 ；圖 1)。GCSF處理能明顯減少死亡率在24小時(shí)再灌注期間，對(duì)照組中死亡四只動(dòng)物，而
36GCSF處理組中僅死亡一只(p < 0. 05)。對(duì)于所有動(dòng)物的直腸溫度、pH、pC02、p02、血細(xì)胞比 容(hct)、血糖、心率、平均動(dòng)脈壓和體重而言，在對(duì)照組和GCSF處理組之間沒有觀察到統(tǒng) 計(jì)學(xué)差異(表1)。局部缺血24小時(shí)后，相較于對(duì)照動(dòng)物，GCSF處理的動(dòng)物的外周血中白細(xì) 胞計(jì)數(shù)明顯增加(P < 0. 05，表1)。
LDF監(jiān)測(cè)揭示了在兩個(gè)處理組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例2-在上下文的局灶性腦缺血中的免疫組化
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使用的免疫組化方法為了從形態(tài)學(xué)上分析STAT3激活作用(圖6)和GCSFR在梗塞的腦中分布，以及 對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，將GCSF處理的動(dòng)物及對(duì)照動(dòng)物的2-mm厚的腦切片浸泡固定于溶于 0. lmol/1磷酸緩沖液的4%低聚甲醛中24小時(shí)(每組η = 5)。在石蠟包埋后，切下Ιμπι 厚的切片，用Η&Ε染色、Nissl染色并免疫組化分析。使用抗髓過氧化物酶(DAKO，Carpinteria, CA, USA)的抗血清、膠質(zhì)纖維酸性蛋 白(GFAP) (DAKO, Carpinteria, CA, USA)、GCSFR(Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA, USA)禾口 STAT3 (Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA, USA)進(jìn)行免 疫組化研究。為了回收抗原，將所提供用于GCSFR和STATS免疫組化的切片在IOmM檸檬酸 鹽緩沖液中于99°C加熱20分鐘。然后，將切片在正常豬血清(在磷酸鹽緩沖液中占10%) 中溫育30分鐘，接著在初級(jí)抗血清中于4°C溫育過夜。將一級(jí)抗體分別稀釋至1 150(髓 過氧化物酶)、1 400 (GFAP)U 400 (GCSFR)及1 100(STAT3)。通過抗生物素蛋白生 物素復(fù)合物法(Vectastain，Vector Laboratories,USA)顯影免疫反應(yīng)。切片在含0.02% 過氧化氫的0. 02% 二氨基聯(lián)苯(DAB)中顯影。通過添加0. 02%氯化鈷和硫酸鎳銨強(qiáng)化反應(yīng) 產(chǎn)物。在對(duì)照切片亞組中，GCSFR抗血清與各自肽的預(yù)吸收并不產(chǎn)生免疫染色(未顯示)。 當(dāng)省略初級(jí)抗血清時(shí)間，也沒有產(chǎn)生免疫染色(未顯示)。通過對(duì)每個(gè)梗塞半球的NG計(jì)數(shù)，從而定量測(cè)定中性粒細(xì)胞(NG)侵入。在頂骨皮層 和相應(yīng)對(duì)側(cè)梗塞形成周圍的rostro-尾部兩個(gè)重疊區(qū)域中對(duì)STAT3蛋白表達(dá)進(jìn)行定量(放 大倍率x400)。結(jié)束時(shí)，計(jì)數(shù)核易位的神經(jīng)元，給出STAT3陽性神經(jīng)元在所有神經(jīng)元中的百 分比。局灶性腦缺血中免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果在兩組中，對(duì)非局部缺血半球的中性粒細(xì)胞(NGs)進(jìn)行髓過氧化物酶(MPO)染色。 基于局部缺血半球中對(duì)MPO陽性細(xì)胞定量，在GCSF處理的動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物之間MPO染色無 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(14 士 17. 6 對(duì) 14. 3 士 12. 5，n. s.)。GFAP免疫反應(yīng)性(IR)存在于非梗塞半球整個(gè)皮層、紋狀體和白質(zhì)分散的星形細(xì) 胞突起中。沒有證據(jù)表明在未處理的和GCSF處理的大鼠的梗塞區(qū)周圍皮層中能檢測(cè)到 GFAP染色的分布和密度。具體而言，在皮層半影中GFAP IR沒有增加，在安慰劑組和GCSF 組中也沒有增加(未顯示)。在梗塞核心中，分散的GFAP免疫反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可得到 檢測(cè)(未顯示)。在未處理和GCSF處理的動(dòng)物中，對(duì)GCSFR的免疫組化、染色可在分散的皮層神經(jīng) 元和神經(jīng)突(未顯示)中得到檢測(cè)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也被GCSF-R抗體(未顯示)染色。在 梗塞核心中，沒有觀察到GCSF-R免疫反應(yīng)性細(xì)胞。證據(jù)表明在兩實(shí)驗(yàn)組中，GCSF-R IR的 分布和密度沒有差異。在安慰劑和GCSF處理的大鼠中，在未梗塞半球的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分散的 細(xì)胞核中觀察到STAT3 IR0 一些細(xì)胞質(zhì)染色也存在于少數(shù)分散的神經(jīng)元中。在梗塞形成 半影中，相較于未處理對(duì)照物，在GCSF處理后STAT3蛋白表達(dá)顯著增加(34. 4士7. 05對(duì) 13. 7士4. 4 ;ρ < 0. 00039)(圖 6，7)。在對(duì)側(cè)中沒有差異出現(xiàn)(16. 2士6. 9 對(duì) 13. 3士6. 9 ； n. s.) ο實(shí)施例3-在上下文的局灶性腦缺血中的蛋白質(zhì)印跡和PCR
蛋白質(zhì)印跡(圖3)為了免疫印跡，將腦組織(2小時(shí)的瞬時(shí)局部缺血)在4°C下溶解于在20倍體積 (w/v)的勻漿緩沖液(320mM蔗糖，0. ImM苯甲磺酰氟和2i!g/ml胃蛋白酶抑制劑)中。于 4°C在9，200G下離心勻漿15分鐘。在將沉淀重懸于1/10的勻漿體積中，分離并取樣用于蛋 白質(zhì)檢測(cè)(Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定，Munich, Germany)等分試樣，將其在氧化亞氮中快速冷凍 并貯存在-70°C下。在含有4M尿素的8% SDS聚丙烯酰胺凝膠的每一泳道上添加15 y g蛋 白質(zhì)，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下電泳。通過半干印跡法將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至Immobilon-PTM膜 (MilliporeCorp. , Eschborn, Germany)上。在溶于 TBST (20mM pH 7. 6Tris 堿，，137mM NaCl 和0. 05% Tween-20)的3%脫脂奶粉中于室溫(RT)封閉1小時(shí)后，將膜與一級(jí)GCSFR抗體 (1 500)在4°C溫育過夜。在TBST洗滌后，將膜與1 2，000稀釋的適當(dāng)?shù)睦备^氧化 物酶綴合的二級(jí)抗體在室溫下溫育1小時(shí)。在線性范圍內(nèi)觀察到具有增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的免 疫反應(yīng)條帶(Amersham Intl. , Braunschweig, Germany)。在使用皮層提取物的免疫印跡實(shí)驗(yàn)中(圖3)，GCSF_R抗血清檢測(cè)到約130kD的蛋 白條帶，與推斷的分子量一致(Fukunaga R，等.，JBiol Chem 1990 ;265 :14008_15)。此外， 觀察到一些低分子量條帶，反映了產(chǎn)物很可能斷裂。在GCSFR抗血清與各自肽預(yù)吸收后，條 帶消失了(圖3)。對(duì)腦中GCSF受體進(jìn)行PCR (圖2A)在大鼠深度麻醉并經(jīng)頸動(dòng)脈灌注后，快速解剖腦。根據(jù)制造商說明書，通過 RNA-clean試劑盒(AGS，Heidelberg, Germany)從腦中提取RNA。用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶盒隨機(jī) 六聚物逆轉(zhuǎn)錄總共10 y g的RNA。對(duì)于PCR而言，使用了下列來自鼠GCSFR外顯子5和7的 引物正義，5' -CCC CTC AAA CCT ATC CTG CCT C_3' (SEQ ID NO 5)；和反義，5' -TCC AGG CAG AGA TCA GCG MT G_3' (SEQ ID NO 6) (Ashihara E 等 ，J Cell Physiol 1997 ； 171 343-56)。根據(jù)下列方案進(jìn)行PCR :94°C 3分鐘，94°C 1分鐘，58°C 1分鐘和72°C 1分鐘 (40個(gè)循環(huán))。在2%瓊脂糖凝膠上分析產(chǎn)物。使用特異于小鼠GCSFR的RT-PCR，在腦組織中檢測(cè)GCSF-RmRNA (圖2A)。PCR產(chǎn)物 具有預(yù)期567bp的大小。通過對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證了同一性(圖2)。實(shí)施例4-在ALS模型中GCSF功效ALS小鼠模型中生存測(cè)試前述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了 ALS的S0D1小鼠模型是成功進(jìn)行人治療的前兆(Cleveland 和Rothstein(2001)，Nat Rev Neurosci 2，806-19)。在該分析中主要終點(diǎn)是運(yùn)動(dòng)征兆的 發(fā)作和死亡率。例如，運(yùn)動(dòng)征兆的發(fā)作可定義為小鼠無法在轉(zhuǎn)筒中以20rpm速度保持7分 鐘的第一天(Li，等(2000)，Science，288，335-9)。或在死亡日子或由于缺點(diǎn)嚴(yán)重而要被處 死的小鼠的日子(如其無感覺及不健康)來記錄死亡率。通過握力測(cè)試測(cè)定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、對(duì) 脊髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)、神經(jīng)稠度(如，坐骨神經(jīng)、膈神經(jīng))和在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中所存在 細(xì)的胞凋亡染色以確定附加參數(shù)。GCSF可通過滲透泵以預(yù)確定的劑量，如60 y g/公斤體 重/天。注入腦室中?；蛘撸珿CSF可通過靜脈注射或腹腔注射給予60 yg/公斤體重/天 的劑量，或更高劑量?；蛘?，給予緩釋劑型的GCSF，例如PEG劑型(見前)或白蛋白劑型 (見前)或其他緩釋劑型。或者，使用任何的GCSF或衍生物或其他來源的制劑(另外的制 造商(如 Roche 的 LEN0GASTRIM 、Chugai Pharma, Co. Ltd.，的 GRAN0CYTE 、Human GenomeSciences 的 ALBUGRANIN 或 Roche/Amgen 的 NEULASTA )。在 S0D1 G93A 突變體晚期癥狀 發(fā)生前的60天開始治療。在未治療的家族ALS小鼠中，在12-14周出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，而在20 周前沒有觀察到癱瘓。預(yù)期壽命未140-170天。有效治療應(yīng)能延長壽命，與對(duì)照組相比超 過 15% (Cleveland 和 Rothstein (2001)，Nat. Rev. Neurosci. , 2,806-19) 關(guān)于對(duì)照組的 處理，可用載體和zVADfmk( —種在該模型中顯效的潛在的半胱天冬酶抑制劑)治療動(dòng)物。 每組包含10只動(dòng)物。實(shí)施例5-GCSF在帕金森模型中功效現(xiàn)有多種帕金森氏癥嚙齒動(dòng)物模型適用于GCSF的功效研究(Grunblatt， 等.(2000),JNeurol,247Suppl 2，1195-102.)。一種性能良好的模型使用了 1_ 甲基 _4_ 苯 基-1，2，3,6-四氫吡啶(MPTP)。通過腹腔注射將4劑量的MPTP-HC1 (15mg/kg每劑量)以 2小時(shí)間隔給予8周大小的雄性小鼠(n = 20)。給予模擬手術(shù)處理的動(dòng)物鹽水。20只動(dòng)物 都進(jìn)行MPTP處理并給予GCSF日劑量(靜脈注射，60i!g/公斤體重)，在最終的MPTP處理 7天后處死小鼠。在處死前，分析小鼠的運(yùn)動(dòng)參數(shù)(旋轉(zhuǎn)行為、自由運(yùn)動(dòng))。對(duì)10只小鼠的 每只的腦進(jìn)行免疫組化以分析黑質(zhì)中對(duì)酪氨酸羥化酶或多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白陽性的神經(jīng)元的 總數(shù)(使用商購抗體)，和細(xì)胞凋亡陽性神經(jīng)元的數(shù)量(TUNEL染色、半胱天冬酶-3染色)。 將MPTP處理后殘留的多巴胺能神經(jīng)元與那些給予MPTP+GCSF的神經(jīng)元、及模擬手術(shù)組的神 經(jīng)元進(jìn)行比較。每組剩下的10只動(dòng)物可經(jīng)頸動(dòng)脈灌注鹽水，處死，并切開紋狀體。紋狀體在冰上 勻漿，通過具有電化學(xué)檢測(cè)的HPLC測(cè)定多巴胺含量。對(duì)三組動(dòng)物的比較可提供了對(duì)由于黑 質(zhì)中細(xì)胞損失而導(dǎo)致的多巴胺損耗的有效測(cè)量。該實(shí)驗(yàn)也可使用不同劑量方案的MPTP (即一次40mg/公斤體重；兩次30mg/公斤 體重等)來進(jìn)行。實(shí)施例6-在光誘導(dǎo)血栓形成腦缺血后GCSF改善感覺運(yùn)動(dòng)功能(圖8)實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)方案為地方倫理委員會(huì)所批準(zhǔn)。將重280_320g的雄性Wistar大鼠(Charles River, Germany)隨機(jī)分組如下A (對(duì)照組，n = 6)，局部缺血，在局部缺血開始1小時(shí)后用 0. 5ml 0. 9%鹽水處理，如通過快速靜脈注射；B (GCSF組，n = 6)，局部缺血，在局部缺血開 始1小時(shí)后用溶于0. 5ml 0. 9%鹽水的5ii g GCSF(Amgen)處理，如通過快速靜脈注射?；?者，任何的GCSF或衍生物或其他來源的制劑(另外的制造商(如Roche的Lenogastrim 、 Chugai 的 Granocyte 、HGS 的 Albugranin 或 Roche/Amgen 的 Neulasta )也可在此使用。 在1-5天，通過尾部靜脈重復(fù)快速注射。C(模擬手術(shù)組，n = 6)，假手術(shù)，無局部缺血，在局 部缺血開始1小時(shí)后用0. 5ml 0. 9%鹽水處理，如通過快速靜脈注射。通過光誘導(dǎo)血栓形成的局灶性腦缺血通過肌肉注射100mg/公斤體重的鹽酸氯胺酮(WDT，Garb sen，Germany)麻醉動(dòng)物。 如必要的話，麻醉可維持在50mg/公斤體重?？蓪E-50聚乙烯導(dǎo)管插入右股動(dòng)脈用于平 均動(dòng)脈壓和血?dú)獾倪B續(xù)監(jiān)測(cè)。可將PE-50導(dǎo)管插入右股靜脈用于處理注入物。在實(shí)驗(yàn)過程 中，監(jiān)測(cè)直腸溫度并通過恒溫控制加熱墊(Fohr Medical Instruments, Germany)維持在 37 °C。根據(jù)Watson等的方法在大鼠右頂骨皮層進(jìn)行光誘導(dǎo)血栓形成的局部缺血的誘導(dǎo)(Watson BD,Dietrich WD,Busto R,ffachtel MS,Ginsberg MD. Induction of reproducible brain infarction byphotochemically initiated thrombosis. Ann Neurol.1985 ； 17 497-504.)。用鹽酸氯胺酮麻醉動(dòng)物并置于立體定位架中，切開頭皮暴露顱骨表面。為了照 明，將具有1. 5mm孔徑的光導(dǎo)纖維束置于顱骨前囟后部4mm和中線側(cè)面4mm處。用冷白光束 (150W)照明顱骨20分鐘。在開始的2分鐘過程中，靜脈注射染料孟加拉玫瑰紅(0. 133mL/ 公斤體重，10mg/mL鹽水)。如上所述對(duì)模擬手術(shù)動(dòng)物進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，但不注射孟加拉玫 瑰紅和進(jìn)行照明。在手術(shù)后，移去導(dǎo)管，允許動(dòng)物從麻醉中恢復(fù)并隨意給予食物和水。行為測(cè)試在所有動(dòng)物中，在局部缺血前和在局部缺血后的基線、2、3、4、5和6周進(jìn)行一組 行為測(cè)試，對(duì)研究人員隱蔽實(shí)驗(yàn)組。為了進(jìn)行旋轉(zhuǎn)測(cè)試，將大鼠置于加速的轉(zhuǎn)筒中，測(cè)定動(dòng) 物在轉(zhuǎn)筒上停留時(shí)間(Hamm等，J Neurotrauma 1994Apr ； 11 (2) 187-96,Chen J,Li Y,ffang L,ZhangZ,Lu D,Lu M,Chopp M. Therapeutic Benefit of IntravenousAdministration of Bone Marrow Stromal Cells After Cerevral Ischemiain Rats. Stroke. 2001 ；32:1005)。 緩慢增加速度，在5分鐘內(nèi)從4增加到40rpm。如果動(dòng)物從橫檔落下或抓住裝置并旋轉(zhuǎn)2周 而不嘗試在橫檔上行走，則結(jié)束該試驗(yàn)。在訓(xùn)練及測(cè)試程序中，對(duì)大鼠人工設(shè)定時(shí)間限度， 即在轉(zhuǎn)筒上500秒。在局部缺血前訓(xùn)練動(dòng)物3天。在手術(shù)前，記錄在裝置上的平均持續(xù)時(shí) 間(以秒計(jì))，1天測(cè)量3輪。運(yùn)動(dòng)測(cè)試數(shù)據(jù)表示為轉(zhuǎn)筒上平均持續(xù)時(shí)間(3次試驗(yàn))相對(duì) 于內(nèi)在基線對(duì)照(手術(shù)前)的百分?jǐn)?shù)。為了進(jìn)行膠帶移除(adhesive-removal)測(cè)試，在局部缺血前后測(cè)定身體感覺缺 陷(Schallert T, Kozlowski DA, Humm JL, Cocke RR. Use-dependent structural events in recovery of function. Adv Neurol. 1997 ；73 :229_238. ；Chen J, Li Y, Wang L, Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic Benefit of Intravenous Administration of BoneMarrow Stromal Cells After Cerebral Ischemia in Rats. Stroke.2001 ； 32:1005.).讓所有大鼠熟知測(cè)試環(huán)境。在最初測(cè)試中，將2小塊背面帶粘性的紙點(diǎn) (adhesive-backed paper dots)(具有合適的大小，113. 1mm2)用于在每一前肢腕部上末稍 橈骨區(qū)進(jìn)行兩側(cè)觸覺刺激。然后將大鼠放回籠中。對(duì)于每一前肢，記錄每天5次試驗(yàn)中的 每次來自前肢刺激移除的時(shí)間。每次試驗(yàn)至少間隔5分鐘。在手術(shù)前，訓(xùn)練動(dòng)物3天。一 旦大鼠能在10秒內(nèi)移除該點(diǎn)，它們就具有局部缺血。神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴(yán)重性得分(NSS)改良自Chen J，Li Y，Wang L，Zhang Z，Lu D， Lu M, Chopp Mo Therapeutic Benefit of IntravenousAdministration of Bone Marrow Stromal Cells After Cerebral Ischemiain Rats. Stroke. 2001 ;32 :1005,禾口 Schallert T, Kozlowski DA, HummJL, Cocke RR. Use-dependent structural events in recovery of function. Adv Neurol. 1997 ；73 :229_238。將神經(jīng)系統(tǒng)功能分級(jí)為 0_16(正常得分，0 ； 最大缺陷得分，16). NSS是運(yùn)動(dòng)、感覺、反射和平衡測(cè)試的復(fù)合物(Chen J, Li Y，Wang L， Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic Benefit of Intravenous Administration of Bone MarrowStromal Cells After Cerebral Ischemia in Rats. Stroke. 2001 ；32 1005. ,Germano AF,Dixon CE,d' Avella D,Hayes RL,Tomasello F. Behavioral deficits following experimental subarachnoid hemorrhage inthe rat. J Neurotrauma. 1994 ； 11 =345-353.)。在損傷的嚴(yán)重程度評(píng)分中，無法進(jìn)行測(cè)試或缺乏測(cè)試反射就獎(jiǎng)勵(lì)1分，因此損傷越嚴(yán)重，得分越高。結(jié)果對(duì)于所有動(dòng)物的直腸溫度、pH、pC02、p02、血細(xì)胞比容(hct)、血糖、心率、平均動(dòng)脈 壓和體重和死亡率而言，在各組間沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(數(shù)據(jù)未顯示)。與其他組比較，在整個(gè)過程中GCSF處理的動(dòng)物功能恢復(fù)得明顯更好。相較于對(duì)照 組，GCSF處理的動(dòng)物具有明顯更低的NSS得分，包括實(shí)驗(yàn)過程中得游梁平衡(p < 0. 05,圖 8a)。在GCSF處理的動(dòng)物中對(duì)側(cè)前肢中，在整個(gè)過程中通過除去膠帶測(cè)定的感覺運(yùn)動(dòng)功能 也好于對(duì)照組，在同側(cè)前肢中同樣的情況在6周時(shí)出現(xiàn)(參見圖8c，d)。實(shí)施例7-GCSF受體在腦缺血的光誘導(dǎo)血栓形成模型中下調(diào)節(jié)在用Qiagen Rneasy 微型試劑盒純化后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Chomczynski and Sacchi (1987)，Anal. Biochem.，162，156-159)從大鼠皮層半影樣品的同側(cè)和對(duì)側(cè)損傷部位 分離RNA(參見圖9a，組織樣品定位；此處3對(duì)4)。使用寡dT引物、Superscript II逆 轉(zhuǎn)錄酶(Gibco)及標(biāo)準(zhǔn)條件，從1 P g總RNA合成cDNA。使用具有SYBR綠染色的DNA雙鏈 的 Ughtcycler 系統(tǒng)(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)進(jìn)行定量 PCR，。循環(huán) 條件如下95°C 5分鐘、95°C 5秒、66°C 7秒、72°C 30秒、84°C 9秒，進(jìn)行55個(gè)循環(huán)。用如 下參數(shù)作出解鏈曲線95°C冷卻至50°C ；以0.2°C/秒斜線上升至99°C。使用了如下引物 對(duì)“大鼠 GCSFR-片段-32s”CCATTGTCCATCTTGGGGATC(SEQ ID NO 7)和“大鼠 GCSFR-片段 -265as"CCTGGAAGCTGTTGTTCCATG (SEQ ID NO :8)。按照制造商推薦(Roche Diagnostics), 使用SYBR綠標(biāo)準(zhǔn)混合物進(jìn)行Lightcycler pcR。通過熔點(diǎn)分析和瓊脂糖凝膠電泳確 保產(chǎn)物特異性。將樣品的cDNA含量對(duì)Cyclophilin的表達(dá)水平歸一化(引物“cyc5” ACCCCACCGTGTTCTTCGAC (SEQ ID NO 9) ； “ acyc300 “ CATTTGCCATGGACAAGATG (SEQ ID NO 10))。相對(duì)調(diào)節(jié)水平源自對(duì)cyclophilin的歸一化，并與模擬手術(shù)動(dòng)物比較。圖9b顯示了 作用對(duì)側(cè)48小時(shí)后GCSFR的上調(diào)，誤差條顯示了標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算了 3倍連續(xù)稀釋的cDNA樣品， 反映了測(cè)量的可靠性。實(shí)施例8-在初級(jí)培養(yǎng)物的神經(jīng)元細(xì)胞上存在GCSF受體免疫細(xì)胞化學(xué)制備神經(jīng)元10-12個(gè)皮層制備自E18期的胚(胚胎第18天)。使用溶于HBSS (Hanks平衡鹽溶 液，Bioffithakker)的胰蛋白酶[10mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml] (Roche Diagnostics)解 離組織。使用4組分培養(yǎng)液(神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液+1 ml 50x B-27添加物(InvitrogerO+O. 5mM L_谷氨酸+25iiM谷氨酸鹽)停止消化，并在室溫下以800g離心5分鐘。將沉淀溶解在5ml 培養(yǎng)液中并通過計(jì)數(shù)(Neubauer載玻片)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔 密度為250 000個(gè)細(xì)胞，使用的蓋玻片涂覆有聚L-賴氨酸。免疫細(xì)胞化學(xué)在制備14天后，將神經(jīng)元用PBS (Gibco) (37°C )洗滌并用2%低聚甲醛在冰上固 定10分鐘。然后，用PBS (4°C )洗滌細(xì)胞并儲(chǔ)存在4°C下。在50mM甘氨酸PBS溶液中溫育細(xì) 胞10分鐘，接著用PBS洗滌。細(xì)胞在冰上使用0. 2% TritonX-100 (Sigma) PBS溶液進(jìn)行透化 處理，并與封閉溶液(0.2% Triton-X100，4%標(biāo)準(zhǔn)羊血清(NGS) (Jacksonlmmunoresearch Laboratories)PBS溶液)在室溫下溫育。一級(jí)抗體(直接抗小鼠GCSFR的C-末端的兔 抗-GCSF-受體-抗體、M-20、sc-694，SantaCruz Biotechnology, Inc.)以 1 800 稀釋度使用，并在4°C下溫育過夜。然后用1%NGS/PBS洗滌細(xì)胞，與二級(jí)抗體(抗兔-FITC， 1 400 ；dianova)在室溫下溫育30分鐘。接著簡單地在1 % NGS/PBS中洗滌細(xì)胞，并用 Hoechst 33342染色(Molecular Probes) (1 10000在PBS中)用于計(jì)數(shù)染色的細(xì)胞核。 最后，蓋玻片簡單地在1 % NGS/PBS中洗滌兩次，在PBS中洗滌兩次，在10mM pH7. 6Tris/HCl 中洗滌一次，時(shí)間10分鐘。使用Aquamount(Polyscience)包埋蓋玻片。使用Olympus 1X81 顯微鏡和“分析”軟件包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)獲得數(shù)碼照片。實(shí)施例9-GCSF受體存在于神經(jīng)元干細(xì)胞上PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)(圖12，13)； GCSF受體存在于PC12細(xì)胞上PCR(圖2B)產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞從具有已知自發(fā)神經(jīng)發(fā)生的腦區(qū)域中分離神經(jīng)干細(xì)胞，即從所述的4-6周大小的 雄性Wistar大鼠的海馬、嗅球和腦室下區(qū)分離(Ray J等(1993)，Proc Natl Acad Sci USA 90:3602-6)。方案應(yīng)與動(dòng)物使用方針一致，為美國國家研究委員會(huì)(National Research Council of the U. S. A)所認(rèn)可，并遵守德國法律。簡言之，用(v/v)異氟烷、70%N20、 29%氧麻醉動(dòng)物并通過斬首處死。分離腦并在50mL冰冷的Dulbecco' s磷酸鹽緩沖液 (DPBS)中洗滌，該緩沖液添加有4. 5g/L葡萄糖(DPBS/Glc)。切開來自6只動(dòng)物的海馬、嗅 球和腦室下區(qū)，在lOmLDPBS/Glc中洗滌并在4°C以1600xg離心5分鐘。在除去上清液后，用 剪刀和解剖刀對(duì)組織進(jìn)行均勻加工處理。用DPBS/Glc培養(yǎng)液在800g洗滌組織碎片5分鐘， 將三種沉淀重懸于0.01% (w/v)木瓜蛋白酶、0.1% (w/v)分散酶11(中性蛋白酶)、0.01% (w/v)DNase I和12. 4mM硫酸錳Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)中。用塑料移液管頂端研磨組織 并在室溫下溫育40分鐘，但每10分鐘對(duì)溶液進(jìn)行一次充分混合。將懸浮液在4°C以800xg 離心5分鐘，并在DMEM-Ham氏F-12培養(yǎng)液中洗滌沉淀3次，該培養(yǎng)液添加有2mM L-谷氨酸 鹽、100單位/毫升青霉素和100單位/毫升str印otomycin。然后，將細(xì)胞沉淀重懸在lmL 神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，該培養(yǎng)液添加有B27(Invitrogen，Carlsbad, CA，USA)、2mM L_谷氨酸 鹽、100 單位 / 毫升青霉素和 100 單位 / 毫升 str印otomycin、20ng/mL EGF、20ng/mL FGF-2 和2ii g/mL肝素。在無菌條件下，將細(xì)胞置于6孔培養(yǎng)皿中，濃度為25，000-100, 000細(xì)胞 /毫升。于5%0)2中，將培養(yǎng)皿在37°C下溫育。一周換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，其中約三分之二 的培養(yǎng)液被置換(s Ray J 等(1993)，Proc Natl Acad Sci U SA 90 :3602_6)。RT-PCR 方案按照制造商推薦(RNeasy kit，Qiagen)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案從海馬干細(xì)胞分離RNA(圖 12)，在從冷凍的母液中融化后，將該干細(xì)胞于培養(yǎng)液中增殖3周。使用寡dT引物、 Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco)及標(biāo)準(zhǔn)條件合成cDNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)使用下 列循環(huán)條件進(jìn)行94°C 3分鐘、94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分鐘；進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，使用了 引物對(duì)“大鼠 GCSFR-片段-8s”GCGGGCAAATCAGGATCTCAC(SEQ ID NO :2)，和“大鼠 GCSFR-片 段-287as”CGAAGCTCAGCTTGATCCAGG(SEQ ID NO :3)。引物來源自從大鼠基因組數(shù)據(jù)庫中通 過TBLASTX搜尋所鑒定的大鼠GCSFR片段引物(參見圖11)。反應(yīng)條件2mM MgCl2,200 uM dNTP、200nM每種引物、1單位Taq聚合酶(Invitrogen)/25 u 10在1. 5%瓊脂糖凝膠上解 析PCR產(chǎn)物。特異性PCR產(chǎn)物長度為279bp，具有如下序列(SEQ ID NO 4)(引物序列具有下劃線)
gcgggcaaatcaggatctcaccccccattgtccatcttggggatcctgtcctggcctcctgcaccatca gcccaaactgcagcaaactggaccgacagccaaagatcctatggagactgcaagatgaaccaaaccagcctggggacagacagcatca cctgcctgacgggtcccaggagtccatcatcactctgcctcatctgaactacactcaggccttcctcttctgcttggtgccatgg aacaacagcttccaggtcct^gatcaagctgagcttcg.PC12細(xì)胞的PCR(圖2B)按上述方案進(jìn)行。神經(jīng)球免疫細(xì)胞化學(xué)神經(jīng)球由移液至載玻片上的神經(jīng)干細(xì)胞組成，將蓋玻片蓋在孔上，并將載玻片置 于-80°C至少30分鐘。移去蓋玻片，并立刻置于4% PFA(低聚甲醛)0. IM pH 7. 4磷酸鹽 緩沖液種。固定細(xì)胞20分鐘。在含F(xiàn)CS和0.02% NaN3 (pH 7.4)中洗滌細(xì)胞3 次，每次5分鐘。然后在含0. 5% TX-100的PBS中透化處理細(xì)胞10分鐘。在含F(xiàn)CS和 0. 02% NaN3的PBS(pH 7. 4)中封閉抗原60分鐘。細(xì)胞用0. 001mg/ml細(xì)胞核染料DAPI的 PBS溶液染色12分鐘。接著，用含F(xiàn)CS和0. 02% NaN3的PBS(pH 7. 4)洗滌細(xì)胞2次， 每次5分鐘。添加在含F(xiàn)CS和0. 02% NaN3的PBS (pH 7. 4)中稀釋的一級(jí)抗體2小時(shí)， 抗體濃度分別為抗 G-GSF 1 1000、抗 G-CSF-R 1 1000、抗 GM-CSF-R1 1000 (Santa Cruz)。用含1 % FCS和0. 02% NaN3的PBS (pH 7. 4)洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。接著，添加 在含F(xiàn)CS和0. 02%妝隊(duì)的PBS (pH 7. 4)中稀釋的二級(jí)抗體(羊抗兔IgG-FITC (DAKO)) 60 分鐘，抗體濃度為1 30。然后，用含F(xiàn)CS和0.02%NaN3 (pH 7. 4)洗滌細(xì)胞3 次。每次5分鐘。最后細(xì)胞用Aquamount和蓋玻片包埋。實(shí)施例10-在腦缺血光誘導(dǎo)血栓形成模型中GMCSFRa是上調(diào)的(通過RMDD發(fā) 現(xiàn))實(shí)驗(yàn)方案為地方倫理委員會(huì)所批準(zhǔn)。重280_320g的雄性Wistar大鼠(Charles River,Germany)進(jìn)行如下處理:a)不同時(shí)間點(diǎn)的局部缺血(6小時(shí)、48小時(shí)和21天)；b)假 手術(shù)，無局部缺血，不同時(shí)間點(diǎn)(6小時(shí)、48小時(shí)和21天)，每一時(shí)間點(diǎn)和每次處理η = 2。光誘導(dǎo)血栓形成的局灶性腦缺血通過肌肉注射IOOmg/公斤體重的鹽酸氯胺酮(WDT，Garb sen，Germany)麻醉動(dòng)物。 如必要的話，麻醉可維持在50mg/公斤體重。可將PE-50聚乙烯導(dǎo)管插入右股動(dòng)脈用于平 均動(dòng)脈壓和血?dú)獾倪B續(xù)監(jiān)測(cè)?？蓪E-50導(dǎo)管插入右股靜脈用于處理注入物。在實(shí)驗(yàn)過程 中，監(jiān)測(cè)直腸溫度并通過恒溫控制加熱墊(Fohr Medical Instruments, Germany)維持在 37 °C。U M Watson BD, Dietrich WD, Busto R, Wachtel MS, GinsbergMD. Induction of reproducible brain infraction by photochemicalIyinitiated thrombosis. Ann Neurol. 1985 ；17 497-504的方法，在大鼠右頂骨皮層進(jìn)行光誘導(dǎo)血栓形成的局部缺血的 誘導(dǎo)。用鹽酸氯胺酮麻醉動(dòng)物并置于立體定位架中，切開頭皮暴露顱骨表面。為了照明， 將具有1.5mm孔徑的光導(dǎo)纖維束置于顱骨前囟后部4mm和中線側(cè)面4mm處。用冷白光束 (150W)照明顱骨20分鐘。在開始的2分鐘過程中，靜脈注射染料孟加拉玫瑰紅(0. 133mL/ 公斤體重，10mg/mL鹽水)。如上所述對(duì)模擬手術(shù)動(dòng)物進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，但不注射孟加拉玫
45瑰紅和進(jìn)行照明。在手術(shù)后，移去導(dǎo)管，允許動(dòng)物從麻醉中恢復(fù)并隨意給予食物和水。在不 同的時(shí)間點(diǎn)(分別在局部缺血和假手術(shù)6小時(shí)、48小時(shí)和21天后)處死動(dòng)物，并根據(jù)本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的方法制備皮層半影同側(cè)和對(duì)側(cè)。RNA 分離和 RMDD根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案從大鼠皮層半影樣本的同側(cè)和對(duì)側(cè)損傷部位分離RNA(ChomCZynSki 和 Sacchi Anal Biochem (1987)，162，156-9)，隨后使用 Qiagen RNeasy 微型試劑盒純化) (參見圖13a的組織樣本定位；這里3對(duì)4)。按照如EP O 743 367 A2和US 5，876，932 中所述的RMDD (限制介導(dǎo)的差異顯示)方案，從Iyg總RNA合成cDNA。在第一鏈和第二 鏈合成后，進(jìn)行MboI消化和接頭連接。用引物組合子集進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)。隨后將PCR反 應(yīng)物置于變性膠上并印跡至尼龍膜(GATC Biotech AG, Konstanz, Germany)。用常規(guī)的抗 生物素蛋白鏈菌素-過氧化酶反應(yīng)顯影生物素標(biāo)記的條帶。將來自皮層半影的PCR樣本置 于凝膠上，以下列順序同側(cè)天然的(未處理的)、模擬手術(shù)(sham) 6小時(shí)、模擬手術(shù)48小 時(shí)、模擬手術(shù)21天和光誘導(dǎo)血栓形成6小時(shí)、48小時(shí)和21天；對(duì)側(cè)模擬手術(shù)6小時(shí)、模擬 手術(shù)48小時(shí)、模擬手術(shù)21天和光誘導(dǎo)血栓形成6小時(shí)、48小時(shí)和21天。將在同側(cè)和對(duì)側(cè) 區(qū)具有不同的強(qiáng)度的條帶從尼龍膜上切下，并依PCR產(chǎn)物進(jìn)行再擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入 pCR-Bluntll-TOPO 載體(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，Germany)并用 T7 和 M13rev 引物測(cè) 序(ABI 3700)。將獲得序列與EMBL數(shù)據(jù)庫比較。鑒定得到在皮層半影同側(cè)和對(duì)側(cè)48小時(shí) 后上調(diào)的序列(圖14)。將鑒定的EST序列在EST數(shù)據(jù)庫中用BLASTN-搜尋擴(kuò)展，通過使用 篩選程序(BLAST、TBLASTN(Altschul，等.(1997)，Nucleic Acids Res, 25, .3389-402))， 在EST和基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定得到編碼小鼠GM-CSFRa的小鼠同源序列(ensembl ；www. ensembl. Org)。使用Sh印ard((1997)Nucleic Acids Res 25:3183-3185)的PCR克隆方法在大鼠 cDNA文庫中進(jìn)行篩選以確認(rèn)所獲得的大鼠序列。該方法是基于源自質(zhì)粒文庫的cDNA分子 與生物素偶聯(lián)的寡核苷酸序列的雜交。在質(zhì)粒抽提物與抗生物素蛋白鏈菌素偶聯(lián)的磁珠結(jié) 合后，通過診斷性PCR和兩倍復(fù)制步驟，隨后所獲得的質(zhì)粒再變形直至恢復(fù)單克隆從而證 實(shí)了結(jié)果。使用了如下的引物組合5'封閉-2. clb4-4-4 :CGGGATCCGGGACCGCGTATCTGATGACGAGCGTGTCAA(SEQID NO: 12)25 生物素-2. clb4-4-4 CTCGGAGACGCTGAGGAAGGACCTG (SEQ ID NO 13)3'封閉-2. clb4-4-4 :CTGCGGCCCTAGACCACGCCCACCGCTCCCCGTGACGTCG(SEQ ID NO 14)(確定了單克隆的閱讀框，序列示于SEQID NO :40，相應(yīng)的氨基酸序列示于SEQ ID NO 41)。實(shí)施例11-在腦缺血的光誘導(dǎo)血栓形成模型中GMCSF受體α是上調(diào)的(通過定 量PCR驗(yàn)證)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案從大鼠皮層半影樣本的同側(cè)和對(duì)側(cè)損傷部位分離RNA(ChomcZynSki 和 Sacchi Anal Biochem (1987)，162，156-9)，隨后使用 Qiagen RNeasy 微型試劑盒純化) (參見圖13a的組織樣本定位；這里3對(duì)4)。使用寡dT引物、Superscript II逆轉(zhuǎn)錄 酶(Gibco)及標(biāo)準(zhǔn)條件，從Iiig總RNA合成cDNA。使用具有SYBR綠染色的DNA雙鏈的
46Lightcycler 系統(tǒng)(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)進(jìn)行定量 PCR，。循環(huán)條件如 下95°C 5分鐘、95°C 5秒、62°C 7秒、72°C 30秒、80°C 9秒，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。用如下參數(shù)作 出解鏈曲線95°C冷卻至50°C ；以0.2°C/秒斜線上升至99°C。使用了如下引物對(duì)“大鼠 BR4-4s96” ACGTCGTTGGCTCAGTTATGTC (SEQ ID NO 15)和“大鼠 BR4_4as272” ATTTATGTCAGA GATGGAGGATGG (SEQ ID NO: 16)。按照制造商推薦(Roche Diagnostics)，使用 SYBR 綠標(biāo)準(zhǔn) 混合物進(jìn)行Lightcycler PCR。通過熔點(diǎn)分析和瓊脂糖凝膠電泳確保產(chǎn)物特異性。將樣品 的 cDNA含量對(duì) Cyclophilin 的表達(dá)水平歸一化(引物“cyc5”ACCCCACCGTGTTCTTCGAC (SEQ ID NO 17) ；“acyc300“CATTTGCCATGGACAAGATG(SEQ ID N0:18))。相對(duì)調(diào)節(jié)水平源自對(duì) cyclophilin的歸一化，并與模擬手術(shù)動(dòng)物比較。圖14顯示了作用對(duì)側(cè)48小時(shí)后GMCSFR 的上調(diào)。在光誘導(dǎo)血栓形成的誘導(dǎo)21天沒有檢測(cè)到明顯的調(diào)節(jié)(圖14b)。誤差條顯示了 標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算了 3倍連續(xù)稀釋的cDNA樣品，反映了測(cè)量的可靠性。實(shí)施例12-在初級(jí)皮層培養(yǎng)物神經(jīng)元細(xì)胞上存在GMCSF-受體α 制備神經(jīng)元10-12個(gè)皮層制備自Ε18期的胚(胚胎第18天)。使用溶于HBSS (Hanks平衡鹽溶 液，Bioffithakker)的胰蛋白酶[10mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml] (Roche Diagnostics)解 離組織。使用4組分培養(yǎng)液(神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液+1 ml 50x B-27添加物(InvitrogerO+O. 5mM L-谷氨酸+25 μ M谷氨酸鹽)停止消化，并在室溫下以800g離心5分鐘。將沉淀溶解在 5ml培養(yǎng)液中并通過計(jì)數(shù)(Neubauer載玻片)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)， 每孔密度為250 000個(gè)細(xì)胞，使用的蓋玻片涂覆有聚L-賴氨酸。免疫細(xì)胞化學(xué)在制備1周后，將神經(jīng)元用PBS(Gibco) (37°C )洗滌并用2%低聚甲醛在冰上固定 10分鐘。然后，用PBS (4°C)洗滌細(xì)胞并接著在50mM甘氨酸PBS溶液中溫育10分鐘，接著 用PBS洗滌。細(xì)胞在冰上使用0. 2% TritonX-100 (Sigma)PBS溶液進(jìn)行透化處理，并與封閉 溶液(0.2% Triton-X100，4%標(biāo)準(zhǔn)羊血清(NGS) (Jacksonlmmunoresearch Laboratories) PBS溶液)在室溫下溫育。一級(jí)抗體(直接抗小鼠GMCSFR的C-末端的兔抗-GM-CSF-受 體-抗體、M-20、sc-694，SantaCruz Biotechnology，Inc.)以 1 300 稀釋度使用，并在 4°C 下溫育過夜。然后用NGS/PBS洗滌細(xì)胞，與二級(jí)抗體(抗兔-FITC，1 400 ；dianova) 在室溫下溫育30分鐘。接著簡單地在NGS/PBS中洗滌細(xì)胞，并用Hoechst 33342染色 (Molecular Probes) (1 10000在PBS中)用于計(jì)數(shù)染色的細(xì)胞核。最后，蓋玻片簡單地 在NGS/PBS中洗滌兩次，在PBS中洗滌兩次，在IOmM pH 7. 6Tris/HCl中洗滌一次，時(shí)間 10分鐘。使用Aquamount(Polyscience)包埋蓋玻片。使用Olympus 1X81 顯微鏡和“分析”軟件包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)獲得數(shù)碼照片。實(shí)施例13-在神經(jīng)干細(xì)胞上存在GMCSF受體產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞(圖13)從具有已知自發(fā)神經(jīng)發(fā)生的腦區(qū)域中分離神經(jīng)干細(xì)胞，即從所述的4-6周大小的 雄性Wistar大鼠的海馬、嗅球和腦室下區(qū)分離(Ray J等(1993)，Proc Natl Acad Sci USA 90:3602-6)。方案應(yīng)與動(dòng)物使用方針一致，為美國國家研究委員會(huì)(National Research Council of the U. S. Α)所認(rèn)可，并遵守德國法律。簡言之，用(ν/ν)異氟烷、70%Ν20、 29%氧麻醉動(dòng)物并通過斬首處死。分離腦并在50mL冰冷的Dulbecco' s磷酸鹽緩沖液 (DPBS)中洗滌，該緩沖液添加有4. 5g/L葡萄糖(DPBS/Glc)。切開來自6只動(dòng)物的海馬、嗅球和腦室下區(qū)，在lOmLDPBS/Glc中洗滌并在4°C以1600xg離心5分鐘。在除去上清液 后，用剪刀和解剖刀對(duì)組織進(jìn)行均勻加工處理。用DPBS/Glc培養(yǎng)液在800g洗滌組織碎 片5分鐘，將三種沉淀重懸于0.01% (w/v)木瓜蛋白酶、0.1% (w/v)分散酶II (中性蛋白 酶)、0.01% (w/v) DNase I和12. 4mM硫酸錳Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)中。用塑料移液 管頂端研磨組織并在室溫下溫育40分鐘，但每10分鐘對(duì)溶液進(jìn)行一次充分混合。將懸浮 液在4°C以800xg離心5分鐘，并在DMEM-Ham氏F-12培養(yǎng)液中洗滌沉淀3次，該培養(yǎng)液添 加有2mM L-谷氨酸鹽、100單位/毫升青霉素和100單位/毫升str印otomycin。然后，將 細(xì)胞沉淀重懸在ImL神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，該培養(yǎng)液添加有B27(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)、2mM L-谷氨酸鹽、100單位/毫升青霉素和100單位/毫升str印otomycin、20ng/mL EGF、20ng/mL FGF-2和2 μ g/mL肝素。在無菌條件下，將細(xì)胞置于6孔培養(yǎng)皿中，濃度為 25，000-100，000細(xì)胞/毫升。于5% CO2中，將培養(yǎng)皿在37°C下溫育。一周換一次細(xì)胞培 養(yǎng)液，其中約三分之二的培養(yǎng)液被置換(s Ray J等(1993)，Proc NatlAcad Sci U SA 90 3602-6)。RT-PCR 方案按照制造商推薦(RNeasy kit, Qiagen)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案從海馬干細(xì)胞分離RNA，在 從冷凍的母液中融化后，將該干細(xì)胞于培養(yǎng)液中增殖3周。使用寡dT引物、Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco)及標(biāo)準(zhǔn)條件合成cDNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)使用下列循環(huán)條件進(jìn) 行94°C 3分鐘、94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分鐘；進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，使用了引物對(duì)“大鼠 BR4-4s96"ACGTCGTTGGCTCAGTTATGTC (SEQID NO 19)，和“大鼠 BR4_4as272”ATTTATGTCAGAG ATGGAGGATGG(SEQ ID NO :20)。反應(yīng)條件2mM MgCl2、200yM dNTP、200nM 每種引物、1 單位 Taq聚合酶(Invitrogen)/25y L·在1. 5%瓊脂糖凝膠上解析PCR產(chǎn)物。特異性PCR產(chǎn)物 長度為176bp，具有如下序列(引物序列具有下劃線)ACGTCGTTGGCTCAGTTATGTCAGACAGGAAATCTCACCATCCCACAATGATTGAC
AGCTCTCACAGGGAATCCCGCCTCCGCTGGGACCAATTGACATCACGGACAGGAATACCCGCCCCTGTGGCCCTGATGGGCAGGTCCTGCCTGGCTCCCATCCTCCATCTCTGACATAAAT(SEQ ID NO 21)實(shí)施例14 分析測(cè)定血清半衰期和GCSF/GM-CSF傳代通過血腦屏障希望了解是否GCSF和GMCSF通過血腦屏障。對(duì)GCSF/GM-CSF生物素化，以使 用高靈敏性的抗生物素蛋白-生物素相互作用來檢測(cè)腦組織中化學(xué)增活素。使用生物 素-XX-SE (MolecularProbes B 1606)生物素化 G-CSF (Neupogen，Amgen)。G-CSF 在添加 有250mM山梨糖醇、0. 004% Tween-80和生物素-XX-SE的20mMpH 8碳酸鈉緩沖液中稀釋。 在室溫下1小時(shí)后，添加50mM pH 8Tris_緩沖液以淬滅未反應(yīng)的標(biāo)記試劑。將樣品在TLA 110轉(zhuǎn)子(BeclcmanInstruments)中以45000轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)30分鐘以除去T聚集物。在時(shí)間零點(diǎn)將7. 5 μ g生物素化G-CSF注射入小鼠腹膜內(nèi)(在250mM山梨糖醇和 0. 004% Tween-80的200 μ 1 20mM pH 8碳酸鈉緩沖液中)。用水合氯醛在所示時(shí)間麻醉小 鼠，從右心室采集血樣(約200μ 1)。添加5mM EDTA并將樣品在IOOOg下離心10分鐘以獲得 血清。添加4x樣品緩沖液至血清，通過加熱至95°C持續(xù)5分鐘變性蛋白質(zhì)，并將20 μ 1加到 微型膠上。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素，在TBST中用抗生物素蛋白鏈菌素-HRP(Amersham) 封閉并溫育。洗滌后，使用PierceSupersignal化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)信號(hào)。
用于Elisa分析的血清樣品在分析緩沖液中稀釋到1 20，根據(jù)制造商推薦進(jìn)行 該分析(IBL，Hamburg，Germany)。。該分析可適用于腦脊液(csf)或腦組織勻漿以測(cè)定GCSF通過血腦屏障的轉(zhuǎn)變。實(shí)施例15 分析GCSF、GMCSF的神經(jīng)保護(hù)作用(圖lb)在體外檢測(cè)GCSF/GMCSF對(duì)NGF處理的PC12細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。將PC12細(xì)胞 接種在96孔培養(yǎng)板中，覆蓋上聚L-賴氨酸(0. 01 %終濃度)，密度為40，000細(xì)胞/孔。細(xì) 胞在含IOOOmg葡萄糖/升和10 % HS (馬血清)、5 % FCS (胎牛血清)、1 %青霉素/鏈霉素 的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。然后，用PSV40-RL(編碼renilla熒光素酶基因)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按制 造商推薦使用 了 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染劑(Gibco BRL) (0. 2 μ g DNA/ 孔)。在轉(zhuǎn)染 后，立即添加濃度為40ng/ml的NGF(神經(jīng)生長因子)來誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的分化。在處理后 24小時(shí)，PC12細(xì)胞發(fā)育為具有伸出的突起的神經(jīng)元樣形態(tài)。然后，用不同濃度的H2O2 (圖 lb)和GCSF(l-100ng/ml)處理細(xì)胞。添加已知具有體外神經(jīng)保護(hù)效力的EPO作為陽性 對(duì)照物(Cerami，等.(2002)，Nephrol DialTransplant, 17,8-12.，Kawakami，等.(2001)， J Biol Chem，276，39469-75.，Sinor 和 Greenberg(2000), Neurosci Lett，290，213—5.， Chong，等· (2002)，J Cereb Blood Flow Metab，22，503-14.)，濃度為 0. 01-lU/ml。24 小時(shí) 后，拋棄培養(yǎng)液上清液，用被動(dòng)溶解緩沖液(Promega)裂解細(xì)胞。接著在光度計(jì)(Mithras， Berthold)中記錄Renilla熒光素酶活性，讀數(shù)表示為相對(duì)光單位。該分析通過可檢測(cè)的熒 光素酶數(shù)量從而測(cè)定了細(xì)胞生存率。因此，越高的相對(duì)光單位，就有越多的細(xì)胞生存。在該 分析中，GCSF顯示了對(duì)PC12細(xì)胞劑量依賴性神經(jīng)保護(hù)作用，較促紅細(xì)胞生成素更有效。實(shí)施例16-GCSF受體在對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病起重要作用的不同腦區(qū)域中表達(dá)(圖 4) ；GMCSF在起重要作用的不同腦區(qū)域中表達(dá)(圖19)為系統(tǒng)地評(píng)估GCSF受體在正常小鼠腦中分布，通過腹腔注射Rompun 和 Ketanest ，麻醉C57/bl6小鼠(2-3個(gè)月大)。然后經(jīng)頸動(dòng)脈給小鼠灌注20ml Hank 氏平衡鹽溶液(HBSS)，接著灌注20ml 4%低聚甲醛(PFA) PBS (pH 7. 4)溶液。將腦切開， 在2% PFA溶液中儲(chǔ)存過夜。對(duì)石蠟包埋的組織切片(2 μ m)，置于預(yù)處理的載玻片(DAK0， Glostrup,Denmark)上，空氣干燥過夜并隨后去石蠟化。在微波處理后(檸檬酸鹽緩沖液； 500W，10分鐘)，應(yīng)用抗GCSFR抗體(1 400)并在濕室中將組織于室溫下溫育1小時(shí)。按 制造商推薦(DAK0，Glostrup, Denmark)，使用常規(guī)ABC技術(shù)和作為一種色原體的DAB顯影 抗體標(biāo)記。陰性對(duì)照包括類似處理的切片，其中一級(jí)抗體已完全省略，并對(duì)切片使用了合適 的正常血清(Dianova，Hamburg, Germany)。可見GCSF-R定位于海馬中(圖4a_d)，在CA3 區(qū)中具有占優(yōu)勢(shì)的染色神經(jīng)元(圖4a，b)，在CA3和CA2區(qū)之間具有光滑邊界(圖4c，箭 頭)。GCSF-R分布在體細(xì)胞和神經(jīng)元突起上(圖4b，箭頭)。該受體存在于齒狀回，的門和 基底細(xì)胞層中(圖4d，箭頭)。GCSF-受體也在皮層區(qū)中檢測(cè)到例如在梨狀皮層(圖4e) 和鼻周皮層(f)中。在小腦中，浦肯野細(xì)胞被標(biāo)記(圖4g，箭頭)。同樣，嗅球中的一些大 僧帽細(xì)胞是GCSF-R陽性(圖4h，箭頭)。在脊髓前索中出現(xiàn)強(qiáng)染色(圖4i，j)，通過高倍 放大鑒定了大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元為GCSF-R陽性(圖4k，1)。注意神經(jīng)元突起被強(qiáng)力標(biāo)記。在中 腦中，黑質(zhì)中神經(jīng)元顯示了 GCSF-R陽性(圖4m，η, ο)。除神經(jīng)元外，白質(zhì)束中少突膠質(zhì)細(xì) 胞亦被染色，例如在前連合中(圖4，ρ，箭頭)。將相同的方法應(yīng)用于GMCSFR的定位(圖19)。于此，在海馬、皮層、小腦和脈絡(luò)叢
49中觀察到染色。就中腦和脊髓而言，還未檢查。實(shí)施例17 分析GCSF、GMCSF的神經(jīng)保護(hù)作用(圖lb，圖23)在體外檢測(cè)GCSF/GMCSF對(duì)NGF處理的PC12細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。將PC12細(xì)胞 接種在96孔培養(yǎng)板中，覆蓋上聚L-賴氨酸(0. 01 %終濃度)，密度為40，000細(xì)胞/孔。細(xì) 胞在含IOOOmg葡萄糖/升和10 % HS (馬血清)、5 % FCS (胎牛血清)、1 %青霉素/鏈霉素 的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。然后，用PSV40-RL(編碼renilla熒光素酶基因)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按制 造商推薦使用 7 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染劑(Gibco BRL) (0. 2 μ g DNA/ 孔)。在轉(zhuǎn)染 后，立即添加濃度為40ng/ml的NGF(神經(jīng)生長因子)來誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的分化。在處理后 24小時(shí)，PC12細(xì)胞發(fā)育為具有伸出的突起的神經(jīng)元樣形態(tài)。然后，用不同濃度的H2O2 (圖 lb，圖23)及GCSF和GMCSF(l-100ng/ml)處理細(xì)胞。添加已知具有體外神經(jīng)保護(hù)效力的 EPO作為陽性對(duì)照物(Cerami，等.(2002)，^phrol Dial Transplant, 17,8-12. ,Kawakami, 等.(2001)，J Biol Chem，276，39469-75.，Sinor 和 Greenberg (2000) ,Neurosci Lett, 290, 213-5.，Chong，等.(2002)，J Cereb Blood Flow Metab，22，503-14.)，濃度為 0. 01-1U/ ml (圖lb)。24小時(shí)后，拋棄培養(yǎng)液上清液，用被動(dòng)溶解緩沖液(Promega)裂解細(xì)胞。接著 在光度計(jì)(Mithras，BerthoId)中記錄Renilla熒光素酶活性，讀數(shù)表示為相對(duì)光單位。該 分析通過可檢測(cè)的熒光素酶數(shù)量從而測(cè)定了細(xì)胞生存率。因此，越高的相對(duì)光單位，就有越 多的細(xì)胞生存。在該分析中，GCSF和GMCSF顯示了對(duì)PC12細(xì)胞劑量依賴性神經(jīng)保護(hù)作用， 較促紅細(xì)胞生成素更有效。實(shí)施例18 血栓栓塞性腦缺血實(shí)驗(yàn)方案為地方倫理委員會(huì)所批準(zhǔn)。40只重280_320g的雄性Wi star大鼠 (Charles River,Germany)隨機(jī)分組如下A)在血栓性血管閉塞1小時(shí)后，用IOmg rt-PA/ 公斤體重進(jìn)行早期溶栓1小時(shí)；B在血栓性血管閉塞3小時(shí)后，用IOmg rt-PA/公斤體重 進(jìn)行晚期溶栓；C)不溶栓，但在血栓性局部缺血30分鐘后，用溶于2ml 0.9%鹽水中的
60 μ g/ 公斤體重的重組 G-CSF ( Neupogen ，Amgen, Europe B. V.，Netherlands)處理
90分鐘；D)在血栓性局部缺血30分鐘后，用溶于2ml 0. 9%鹽水中的60 μ g/公斤體重的
重組 G-CSF( Neupogen ，Amgen, Europe B. V.，Netherlands)處理 90 分鐘以及在血栓
性血管閉塞3小時(shí)后，用IOmg rt-PA/公斤體重進(jìn)行晚期溶栓?？赏ㄟ^向腹膜內(nèi)注射IOOmg/公斤體重的鹽酸氯胺酮(WDT，Garbsen, Germany)麻 醉動(dòng)物。如必要的話，麻醉可維持在50mg/公斤體重?？蓪E-50聚乙烯導(dǎo)管插入右股動(dòng) 脈用于平均動(dòng)脈壓、血?dú)?、血?xì)胞比容、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和和血糖水平的連續(xù)監(jiān)測(cè)。可將PE-50 導(dǎo)管插入右股靜脈用于處理注入物。在實(shí)驗(yàn)過程中，監(jiān)測(cè)直腸溫度并通過恒溫控制加熱墊 (Fohr Medical Instruments, Germany)維持在 37°C?？筛鶕?jù)Busch等(Brain Res 1997Dec 5 ；778(1) 16-24)描述的改良方法誘導(dǎo)血 栓栓塞性中風(fēng)。簡言之，通過頸部中線切口暴露右頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外 動(dòng)脈(ECA)。進(jìn)一步的解剖鑒定了翼腭動(dòng)脈(PPA)起源。通過6-0絲線縫合將ECA和PPA 永久地結(jié)扎起來。僅在形成栓塞時(shí)，臨時(shí)結(jié)扎CCA。將導(dǎo)管插入ECA中最接近其結(jié)扎點(diǎn)的地 方，并注射如12個(gè)紅血塊(每塊直徑0. 35mm,長3mm)，在右大腦中動(dòng)脈(MCA)產(chǎn)生栓塞。通過磁共振成像監(jiān)測(cè)梗塞進(jìn)展，可在1、2、4和24小時(shí)處通過使用擴(kuò)散-、灌注-和T2-加權(quán)成像檢測(cè)。在所有動(dòng)物中，在局部缺血24小時(shí)后，基于五點(diǎn)量表可測(cè)定死亡率和神 經(jīng)學(xué)結(jié)果。在局部缺血24小時(shí)后，用150mg/公斤體重氯胺酮麻醉大鼠并斬首。分離腦并 用4%低聚甲醛0. lmol/1磷酸緩沖液固定24小時(shí)。在石蠟包埋后，切下1 μ m厚切片用于 TTC、H&E和Nissl染色及免疫組化分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)值表示為均值士SD。在獲取所有數(shù)據(jù)后，打亂隨機(jī)編碼。ANOVA法和在此之后 的Fisher保護(hù)的最小顯著差數(shù)檢驗(yàn)可用于測(cè)定諸如生理參數(shù)和梗塞體積的連續(xù)變量的統(tǒng) 計(jì)學(xué)差異顯著性?？蓪?duì)諸如死亡率的非參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行Marm-Whitney U檢驗(yàn)。ρ值< 0. 05 被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。實(shí)施例19 當(dāng)在延長的時(shí)間窗口給予時(shí)，在大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)大鼠中風(fēng)模型 中G-CSF是有效的圖24顯示了當(dāng)在局部缺血發(fā)作后120分鐘，由靜脈內(nèi)給予G-CSF對(duì)大鼠MACO模 型梗塞體積的效果。該實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例1所述進(jìn)行，除了麻醉是通過吸入麻醉(1%氟烷、30% O2和70% N2O)進(jìn)行外。同樣于此，大鼠使用了 60 μ g G-CSF ( Neupogen AMGEN) /公 斤體重的劑量。當(dāng)通過TTC染色比較梗塞體積時(shí)，觀察到了明顯的保護(hù)作用(參見圖25)。 通過另一組研究者進(jìn)行手術(shù)，如實(shí)施例1中的那些，證實(shí)了在另一實(shí)驗(yàn)室機(jī)構(gòu)中的有效性。 該實(shí)施例進(jìn)一步證實(shí)了 G-CSF用于治療中風(fēng)和其他神經(jīng)系統(tǒng)中局部缺血病癥的有效性。實(shí)施例20 =GCSF及其受體在腦中的共區(qū)域化使用的免疫組化方法通過使用二甲苯處理2次，每次5分鐘，100%乙醇處理2次，每次分鐘，接著用從 96%-70%遞減濃度的乙醇處理石蠟包埋組織切片(2μπι)以去石蠟化。最后用蒸餾水洗 滌切片并用微波處理(檸檬酸鹽緩沖液，600W，15分鐘)(2u.m)were deparaffinated by treating them 2x 5min with Xylol, 2x 2。然后，用蒸餾水洗滌切片并在含0. 2% BSA的 Ix TBS (pH 7.4)中封閉抗原3次，每次5分鐘。將GCSF-受體抗血清(SC694 ；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ； 1 100)在含 0. 2% BSA 的 Ix TBS(pH 7. 4)中稀 釋，在濕室中于室溫下溫育1小時(shí)。接著用含0. 2% BSA的Ix TBS(pH 7. 4)洗滌切片3次， 每次2分鐘。然后在含0.2% BSA的Ix TBS(pH 7.4)中于4°C下應(yīng)用二級(jí)抗體(羊抗兔 Fab-FITC, dianova, 1 50)過夜。在用含 0. 2% BSA 的 IxTBS(pH 7. 4)洗滌切片 3 次，每 次分鐘后，在室溫下應(yīng)用在含0.2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 100稀釋的GCSF抗血 清(SC13102 ;SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz，CA，USA) 1 小時(shí)。如前述洗滌 3 次切 片并與在含0.2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀釋的生物素化羊抗兔IgG (Vector Laboratories, USA)溫育30分鐘。在再次洗滌切片后，在室溫下應(yīng)用TRITC-綴合的抗生 物素蛋白鏈菌素(dianova ；1 200) 1. 5小時(shí)。接著，用Ix TBS洗滌切片3次，每次2分鐘 并用在Ix TBS中以1 10000稀釋的細(xì)胞核染料DAPI染色10分鐘。最后用IxTBS洗滌 切片3次，每次2分鐘并用熒光封固劑(Vectashield，VectorLaboratories，USA)包埋。使 用 Olympus 1X81 顯微鏡和“分析”軟件包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany) 獲得數(shù)碼照片。所有的雙熒光(double-fluorescence)試驗(yàn)通過平行的單染色進(jìn)行對(duì)照，以控 制第二通道中不存在任何熒光攜帶污染。作為第二對(duì)照，對(duì)于二級(jí)抗體而言，所有的雙熒光
51染色使用了改變的生色團(tuán)。結(jié)果在海馬(圖25a_c齒狀回，d_f門)和皮層(圖25g_i)中GCSF受體(圖25a，d， g)顯示了與其配體(圖25b，e，h)共區(qū)域化。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)了相同的神經(jīng)元既表達(dá)受體 也表達(dá)配體，暗示了 GCSF的自分泌信號(hào)機(jī)制，證實(shí)了神經(jīng)系統(tǒng)新的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)系統(tǒng)。實(shí)施例21 =GCSF受體和GMCSF受體在腦中的共區(qū)域化免疫組化方法如實(shí)施例20所述進(jìn)行免疫組化。在用GCSFR抗血清和羊抗兔Fab-FITC與切片溫 育后，用含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)洗滌切片3次，每次2分鐘。然后，在室溫下應(yīng)用 GMCSFR 抗血清(SC690 ；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz, CA, USA ； 1 100)1 小時(shí)。 以下操作包括與生物素化羊抗兔IgG (Vector Laboratories, USA)及TRITC-綴合的抗生物 素蛋白鏈菌素(dianova;l 200)溫育，如實(shí)施例2所述進(jìn)行GCSF檢測(cè)。所有的雙熒光(double-fluorescence)試驗(yàn)通過平行的單染色進(jìn)行對(duì)照，以控制 第二通道中不存在任何熒光攜帶污染。作為第二對(duì)照，對(duì)于二級(jí)抗體而言，所有的雙熒光染 色使用了改變的生色團(tuán)。結(jié)果GCSF受體(圖26a，d，g)和GMCSF受體(圖26b，e，h)表達(dá)在海馬和皮層中相同 的神經(jīng)元上(圖26c，f，i)。圖26顯示了兩種受體在海馬齒狀回(a-c)和門(d_f)及皮層 (g-i)的神經(jīng)元上共表達(dá)。該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步闡明了所要求保護(hù)的GCSF和GMCSF能聯(lián)合用于治 療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并通過聯(lián)合給予而增強(qiáng)造血因子神經(jīng)保護(hù)特性。實(shí)施例22 =GCSF在神經(jīng)元中通過激活stat3產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡活性結(jié)果初級(jí)培養(yǎng)的神經(jīng)元是一種用于分析作用機(jī)理的根據(jù)。因此，我們檢查了在培養(yǎng) 21天后G-CSF受體是否能在海馬或皮層神經(jīng)元上表達(dá)。實(shí)際上，我們通過PCR(前述實(shí)施 例)和免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)了在皮層及海馬神經(jīng)元上皆有表達(dá)。在中風(fēng)病理生理學(xué)中一個(gè) 最重要的機(jī)制是延遲的神經(jīng)元細(xì)胞死亡(Choi (1996)，Curr Opin Neurobiol，6，667-72， Schneider,等·(1999)，Nat Med, 5, 554-9, Mattson (2000), Nat Rev MolCell Biol, 1, 120-9)。因此，我們假設(shè)G-CSF能干擾神經(jīng)元中細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)。在初級(jí)神經(jīng)元培養(yǎng)物中，在 我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)G-CSF受體、暴露于氧化亞氮的腦缺血過程相關(guān)事件，導(dǎo)致了在程序性細(xì)胞 死亡中劑量依賴性增加，證據(jù)如PARP-裂解(未顯示)。用50ng/ml G-CSF處理能急劇減 少了 N0R3處理后的細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡，如圖27所例證。在造血譜系細(xì)胞中，GM-CSF受 體通過Janus激酶2 (JAK2)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及反式作用蛋白(stat)傳遞其抗細(xì)胞凋亡信號(hào) (Jak-stat 途徑)(如(Epling-Burnette，等· (2001) ,J Immunol, 166, 7486-95, Sakamoto, 等.(2003)，Int J Hematol，77，60-70))。雖然我們無法通過statl或stat5的磷酸化 來檢測(cè)激活作用(圖27，部分III)，但在其他類型細(xì)胞中，通過以JAK-stat動(dòng)力學(xué)的典 型時(shí)間依賴性方式添加G-CSF(圖27，部分IV)可使stat3強(qiáng)磷酸化(圖27，部分V，改用 并修改自:Kuroki, Μ.禾口 0' Flaherty, J. Τ. Extracellular signal-regulated protein kinase (ERK)-dependent and ERK-independent pathways target STAT3 onserine-727 in human neutrophils stimulated by chemotactic factors andcytokines. Biochem 52J 341 (Pt 3) ,691-6(1999))。添加G-CSF至培養(yǎng)液中誘發(fā)stat3酪氨酸705磷酸化是通 過G-CSF受體/JAK2途徑特異性介導(dǎo)的，通過抑制劑AG490可阻斷JAK2/stat3途徑，導(dǎo) 致G-CSF存在的信號(hào)急劇減少(圖X)。Stat3激活誘導(dǎo)了 bcl家族抗細(xì)胞凋亡蛋白產(chǎn)生 (Yoshida，等.(2002)，J Exp Med，196，641-53，Sakai and Kraft(1997),J Biol Chem，272， 12350-8，Nielsen，等· (1999)，Leukemia 13，735-8)。向神經(jīng)元培養(yǎng)物添加 G-CSF 導(dǎo)致了腦 缺血期間神經(jīng)元中有效的抗細(xì)胞凋亡蛋白——Bcl-Xl和Bcl-2時(shí)間依賴性增加(圖27，部 分VI)。有趣的是，近來有報(bào)道提出stat3實(shí)質(zhì)上是作為一種神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?dú)埓娴?白(Schweizer，等.(2002)，J Cell Biol，156，287-97)。因此，G-CSF 的作用似乎與所建議的 涉及stat5和NF-kB激活的EPO抗細(xì)胞凋亡機(jī)制不同(Digicaylioglu and Lipton (2001)， Nature,412,641-7)。方法來自大鼠的初級(jí)皮層神經(jīng)元制備如下從大鼠胚ElO解剖獲得10-12個(gè)皮層。 使用 10mg/ml 姨蛋白酶、5mg/ml EDTA/Dnase (Roche diagnostics, Mannheim, Germany) HBSS(Bioffhitakker, Taufkirchen, Germany)溶液解離該組織。使用含 Ix B-27 添加物 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)的四組分神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液停止該消化反應(yīng)。離心后， 將沉淀溶解在5ml培養(yǎng)液中，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞，密度為250，000細(xì)胞/孔，蓋玻 片覆蓋有聚-L-賴氨酸。培養(yǎng)液通常含有50ml神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液(life technologies, Karlsruhe，Germany)、Iml 添力口物 B 27 (Life technologies)、5μ 1 bFGF(Sigma，19 μ g 溶 解在 100 μ t IOmM Tris/HCl pH 7 中)和 50 μ 1 青霉素 / 鏈霉素(Life technologies)。通過蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)STAT1、pSTATl、STAT5、pSTAT5、GCSFR、PARP，裂解的 PARP、半胱天冬酶3、裂解的半胱天冬酶3、Bcl2和，Bclxl0簡言之，用所示的150mM N0R-3 (Sigma-Aid rich, Seelze, Germany)禾口 50ng/ml G-CSF (Neupogen, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)處理神經(jīng)元24小時(shí)。從培養(yǎng)板上刮下細(xì)胞，以800轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)5分鐘，接 著在冰冷的含有2. 5mg/ml胃蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich，Seelze, Germany)和抑肽酶 (1 1000，Sigma-Aldrich)的PBS中洗滌。將沉淀重懸于100 μ 1的benzonase溶液中(含 10 μ 1 IOx PBS,79. 5 μ 1 H2OUOy 1 10%SDS,0. 5μ 1 IOOmM MgCl2、0. 1 μ 1 抑肽酶、0· 1 μ 1 亮肽酶素、0. 1 μ 1 胃蛋白酶抑制劑、0. 1 μ 1 PMSF和 0. 1 μ 1 benzonase (RocheDiagnostics, Mannheim, Germany))。增溶后，添加1體積PBS并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(BCA-測(cè)試法，Pierce, Rockford, IL, USA)。在95°C變性5分鐘，將IOOMg在8% -12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上 進(jìn)行電泳。然后使用半干印跡盒(Whatman Biometra, G6ttingen, Germany)將蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Protan BA79, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)。用溶于 PBS/0. 02% Tween20的5%奶粉封閉印跡，并在4°C與各自的一級(jí)抗體(抗裂解的PARP-抗 體，Cell Signaling,l 1000 ；抗 PARP，Cell Signaling, 1 1000;抗裂解的半胱天 冬酶 3，CellSignaling，1 200 ；抗半胱天冬酶 3，Cell Signaling, 1 200;抗 Bcl2， BDTransduction Laboratories,1 500 ；抗 Bel XI, BD TransductionLaboratories, 1 500 ；抗 pSTAT3tyr，Cell Signaling, 1 500 ；抗 STAT3，Cell Signaling, 1 500 ； 抗 GCSFR, Santa Cruz, 1 200 ；抗 pSTAT5, Cell signaling, 1 500 ；抗 stat5, Cell signaling, 1 200 ；抗 pSTATl，Cellsignaling，1 500)溫育過夜。洗滌后，將印跡與各 自的二級(jí)抗體(HRP-偶聯(lián)的抗兔或抗小鼠抗血清，Dianova，Hamburg，Germany 1 4000)在室溫溫育1小時(shí)。使用超級(jí)信號(hào)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Pierce，Rockford, USA)并暴露于 HyperfiIm-ECL(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ,USA)中以檢測(cè)信號(hào)。使用 Windows Image J vl. 29 (http //rsb. info. nih. gov/i j/index. Html)在掃描的放射自顯 影照片上定量PARP裂解物。實(shí)施例23 通過腦缺血誘導(dǎo)GCSF及其受體腦缺血的MCAO模型如實(shí)施例1所述進(jìn)行誘導(dǎo)局灶性腦缺血(MCA0，大腦中動(dòng)脈閉塞)的操作。全腦缺血模型對(duì)隨機(jī)動(dòng)物進(jìn)行的局部缺血/再灌注試驗(yàn)操作如前所詳述(Brambrin k， 等· (2000)，J Cereb Blood Flow Metab，20，1425-36)。簡言之，麻醉大鼠(水合氯醛)， 經(jīng)口插管并機(jī)械通氣(Pae()2為35-40mmHg，在試驗(yàn)全程中Paro2為95-110mmHg)。暴露兩 側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)并用聚乙烯管(PE-50)插入左側(cè)進(jìn)行血液采樣和MABP的連續(xù)監(jiān)測(cè) (Sirecust 310，Siemens, Danvers, MA, USA)。在右側(cè)用尼龍線在CCA周圍套一個(gè)松散的 圈，以便稍遲引發(fā)瞬時(shí)腦缺血。將動(dòng)物的頭部固定在立體定位架中用于EEG和CBF測(cè)量 法(詳見(Brambrink, Schneider, Noga, Astheimer, Gotz, Korner, Heimann, Welschof 禾口 Kempski (2000), J Cereb Blood Flow Metab，20，1425-36))。通過正中切口暴露顱蓋并制備 兩個(gè)凹陷設(shè)計(jì)用于容納經(jīng)過氯化處理的銀針EEG電極(高速牙鉆，定位于左側(cè)軀體感覺皮 層和額竇，依照Praxinos andWatson (1986) brain atlas)。除去右半球上約24mm2的顱骨， 使得骨層變薄(右側(cè)1. 3-5. 3mm和距前因1. 5-7. 5mm枕骨)。將計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)的顯微操縱器所 控制的激光多普勒探頭(波長780 μ m, BPM403A, TSIInc.，St. Paul, MN, USA)用于測(cè)定30 個(gè)位置的局部腦血流量(rCBF)，使用了 “掃描技術(shù)”(Soehle，等.(2000)，Acta Neurochir Suppl，76，181-4))。在對(duì)側(cè)上(左側(cè)3. 3-5. 3mm和距前囟5. 0-7. Omm枕骨)，一塊更小的 (4mm2)窗口被確定用于測(cè)量局部腦血流量(ICBF)，使用了固定的激光多普勒探頭(波長 780 μ m, BPM 2，VasamedicesInc.，St. Paul，MN，USA)。如前所述(Brambrink，等· (1999)， J Neurosci Methods，92，111-22)將溫度探頭置于右顳肌中、于左外耳道中和直腸6cm深 處。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，將體中心溫度(恒溫控制加熱毯)和顳肌溫度(接近梗塞的熱輻 射器)控制在37.5士0. 1°C。將動(dòng)物下身置于密閉室中。通過電子調(diào)節(jié)的真空泵以建立低 壓條件，因此以可控制方式(“低血壓”)降低了動(dòng)物的動(dòng)脈血壓(靜脈混合集中)。在手 術(shù)穩(wěn)定期后30分鐘，通過拉連接有確定重量砝碼的尼龍線，在右頸動(dòng)脈附近產(chǎn)生血管閉塞 (通過置于左頸動(dòng)脈的導(dǎo)管測(cè)量動(dòng)脈壓)，從而導(dǎo)致瞬時(shí)全腦缺血；同時(shí)使用低血壓技術(shù)將 MABP減少到35mm Hg，.通過對(duì)1CBF、rCBF和EEG連續(xù)測(cè)量證實(shí)腦局部缺血。在全腦缺血 15分鐘后，切斷尼龍線并停止真空以允許再灌注。在CCA恢復(fù)90分鐘后，拔去導(dǎo)管，閉合切 口并將動(dòng)物從通風(fēng)機(jī)上撤下。在拔管(約110分鐘再灌注)及存在穩(wěn)定的生命征象下，將 大鼠放回籠中并使用加熱毯防止熱量損失。定量PCR根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案分離RNA (Chomczynski and Sacchi (1987), AnalBiochem, 162, 156-9)，然后通過Qiagen Rneasy 微型試劑盒純化。組織樣品分別取自全腦缺血后的大 鼠全腦和局灶性腦缺血后不同時(shí)間點(diǎn)同側(cè)和對(duì)側(cè)損傷位置。使用寡dT引物、superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco)和標(biāo)準(zhǔn)條件從10 μ g總RNA合成cDNA。使用具有SYBR-綠染色的DNA雙鏈的 Ligbtcycler 系統(tǒng)(Roche Diagnostics,Mannheim, Germany)進(jìn)行定量 PCR。循 環(huán)條件如下GCSFR :95°C 5分鐘、95°C 5秒、66°C 10秒、72°C 30秒、84°C 10秒，進(jìn)行50個(gè) 循環(huán)；GCSF :95°C 5分鐘、95°C 5秒、64°C 10秒、72°C 30秒、88°C 10秒，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。用 如下參數(shù)作出解鏈曲線95°C冷卻至50°C ；以0.2°C/秒速度斜線上升至99°C。使用下列 引物對(duì)“大鼠 GCSFR-frag-32s”CCA TTG TCC ATC TTG GGG ATC(SEQ ID N0:42)，“大鼠 GCSFR-片段-265as”CCT GGA AGC TGT TGT TCCATG (SEQ ID NO :43)，“大鼠 GCSF_345s”CAC AGC GGG CTCTTC CTC TAC CAA (SEQ ID NO 44)和“大鼠 GCSF_862as”AGCAGC GGC AGG AAT CAA TAC TCG (SEQ ID NO :45)。按制造商推薦(Roche Diagnostics)，使用 SYBR 綠標(biāo)準(zhǔn)混 合物進(jìn)行Lightcyder PCR。通過熔點(diǎn)分析和瓊脂糖凝膠電泳確保產(chǎn)物特異性。將樣 品的 cDNA 含量對(duì) Cyclophilin 表達(dá)水平歸一化(引物“cyc5”ACC CCACCG TGT TCT TCG AC (SEQ ID NO 46) ； “acyc300 "CATTTGCCATGGACAAGATG (SEQ ID NO :47))。相對(duì)調(diào)節(jié)水平源 自對(duì)cyclophilin的歸一化，并與模擬手術(shù)動(dòng)物比較。誤差條顯示了標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算了 3倍連 續(xù)稀釋的cDNA樣品，反映了測(cè)量的可靠性。圖28 (部分I和II) A顯示了在同側(cè)和對(duì)側(cè)局灶性缺血2小時(shí)和6小時(shí)后GCSF具 有十分強(qiáng)的上調(diào)，而6小時(shí)后受體僅適度調(diào)節(jié)(圖28B)。GCSF誘導(dǎo)表達(dá)并不特異于MCAO模型，雖然在全腦缺血中程度更低，但也能觀察到 (圖28C)。該發(fā)現(xiàn)支持了 G-CSF實(shí)際上是腦內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)配體及GCSF或GMCSF治療是 利用神經(jīng)保護(hù)作用的內(nèi)源性效應(yīng)的假說。實(shí)施例24 在皮層梗塞半影區(qū)中GCSF及其受體是上調(diào)的方法如上述實(shí)施例所述，實(shí)施光誘導(dǎo)血栓形成局部缺血模型的皮層局部缺血。免疫組化石蠟包埋組織的切片(2 μ m)去石蠟化并用微波處理(檸檬酸鹽緩沖 液，500W, 10分鐘)。然后，在室溫下將切片與GCSF或GCSF-受體抗血清(SC13102或SC694 ； Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ； 1 500)在濕室中溫育 1 小時(shí)。使用 DAB作為色原體的ABC技術(shù)顯影染色(DAK0，Glostrup, Denmark)。省略一級(jí)抗血清以制備 陰性對(duì)照。結(jié)果在光誘導(dǎo)血栓形成局部缺血6小時(shí)后，有明顯證據(jù)表明在主要局部缺血損傷區(qū) (“半影”)周圍神經(jīng)元染色增強(qiáng)了，如圖29箭頭所示，受體和配體皆然。該發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了這 一效應(yīng)——即我們所揭開的新的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)系統(tǒng)。其也強(qiáng)調(diào)了 GCSF在半影 區(qū)中起作用的主要機(jī)制實(shí)際上最可能是抗細(xì)胞凋亡。實(shí)施例25 :GCSFR和雙皮質(zhì)激素(doublecortin)在海馬中的共區(qū)域化所使用的免疫組化方法如實(shí)施例2所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。代替GCSF抗血清的是在含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀釋的豚鼠抗雙皮質(zhì)激素(DCX)多克隆抗體(Chemicon International, Germany)。在用含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)洗滌切片3次，每次2分鐘后，將它們與 在含0.2%BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀釋的生物素化羊抗豚鼠IgG(Vector Laboratories, USA)溫育30分鐘。再次洗滌切片后，在室溫下應(yīng)用TRITC-綴合的抗生物 素蛋白鏈菌素(dianova;l 200) 1.5小時(shí)，以下方案描述于實(shí)施例21中。
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結(jié)果圖30顯示了在海馬齒狀回(a-f)和門(g_i)神經(jīng)元上表達(dá)了 GCSF受體(a，d，g) 和雙皮質(zhì)激素(b，e, h)。G-CSF受體和未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物雙皮質(zhì)激素(Jin，等.(2001)， Proc Natl Acad Sci USA, 98,4710-5 (圖 30c，f, i)交迭表達(dá)暗示了 G-CSF 在神經(jīng)元分化 初期的功能角色。實(shí)施例26 =GCSF誘導(dǎo)成體神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元制備神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)如實(shí)施例9所述制備大鼠成體神經(jīng)干細(xì)胞。分別用如下GCSF濃度10ng/ml、100ng/ml和500ng/ml刺激來自腦室下區(qū)(SVZ) 的39DIV培養(yǎng)的神經(jīng)球一次。4天后，添加重組人GCSF( NeupOgen ，Amgen，Europe B. V.，Netherlands)，收獲細(xì)胞并分離RNA。未處理細(xì)胞作為對(duì)照。定量PCR按制造商方案，使用Qiagen Rneasy微型試劑盒分離SVZ的GCSF-處理和未處理的 神經(jīng)球的RNA0使用寡dT引物、superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco)和標(biāo)準(zhǔn)條件從2 μ g總 RNA合成cDNA。使用具有SYBR綠染色的DNA雙鏈的Lightcycler系統(tǒng)(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)進(jìn)行定量PCR。循環(huán)條件如下Nestin 和 NSE (神經(jīng)元特異性烯醇酶):95°C 3 分鐘、95°C 5 秒、58°C 10 秒、72°C 30 秒、81°C 10秒，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)；β III-微管蛋白95°C3分鐘、95°C5秒、65°C 10秒、72°C30 秒、87°C 10 秒，進(jìn)行 50 個(gè)循環(huán)；PLP :95°C 3 分鐘、95°C 5 秒、62°C 10 秒、72°C 30 秒、84°C 10 秒，進(jìn)行 50 個(gè)循環(huán)；GFAP :95°C 3 分鐘、95°C 5 秒、60°C 10 秒、72°C 30 秒、81°C 10 秒，進(jìn)行 50 個(gè)循環(huán)。用如下參數(shù)作出解鏈曲線95°C冷卻至50°C;以0.2°C /秒速度斜線上升至99°C。 使用了如下引物對(duì)“大鼠 nestin-(+)”AGG AAG AAG CTG CAG CAG AG(SEQ ID NO 48), “大鼠 nestin-(-) ”TTC ACC TGC TTG GGCTCT AT (SEQ ID NO :49)，“大鼠 NSE_(+) ”GGC AAG GAT GCCACT AAT GT (SEQ ID NO :50)，“大鼠 NSE-(-) ”AGG GTC AGCAGG AGAC TTG A (SEQ ID NO :510，“大鼠 β 111-微管蛋白-7168”0^ CCT ACG GGG ACC TCA ACC AC (SEQ ID NO :52)， “大鼠 β III-微管蛋白 _1022as”GAC ATG CGC CCA CGG AAG ACG(SEQID NO :53)，“ rat PLP-518s" TCA TTC TTT GGA GCG GGT GTG(SEQ ID NO :54)，“大鼠PLP_927as，，TAA GGA CGG CAA AGTTGT AAG TGG(SEQ ID NO :55)，“大鼠GFAP3' _1123s，，CCT TTCTTA TGC ATG TAC GGA G (SEQ ID NO :56)，“大鼠 GFAP3' _1245as，，GTA CAC TAA TAC GAA GGC ACT C (SEQ ID NO 57)。按制造商推薦(Roche diagnostics)，使用SYBR綠標(biāo)準(zhǔn)混合物進(jìn)行Lightcycler PCR。 通過熔點(diǎn)分析和瓊脂糖凝膠電泳確保產(chǎn)物特異性。將樣品的cDNA含量對(duì)Cyclophilin的表 達(dá)水平歸一化(引物“cyc5”ACC CCA CCG TGT TCT TCG AC (SEQ ID NO :58)，“acyc300”CAT TTG CCA TGG ACA AGA TG(SEQ ID N0:59))。相對(duì)調(diào)節(jié)水平源自對(duì) cyclophilin 的歸一 化，并與未處理的細(xì)胞進(jìn)行比較。圖31顯示了在GCSF處理4天后，神經(jīng)元標(biāo)記物NSE和 β III-微管蛋白的強(qiáng)烈的和濃度依賴性上調(diào)。PLP和GFAP是依賴于GCSF濃度的適度調(diào)節(jié)。 誤差條顯示了標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算了 3倍連續(xù)稀釋的cDNA樣品，反映了測(cè)量的可靠性。實(shí)施例27 在腦中GMCSF及其受體的共區(qū)域化使用的免疫組化方法通過使用二甲苯處理2次，每次5分鐘，100%乙醇處理2次，每次5分鐘，接著用從96%-70%遞減濃度的乙醇處理石蠟包埋組織切片(2μπι)以去石蠟化。最后用蒸餾水洗 滌切片并用微波處理(檸檬酸鹽緩沖液，600W，15分鐘)。然后，用蒸餾水洗滌切片并在含 0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中封閉抗原3次，每次5分鐘。將GMCSF-受體抗血清(SC690 ； Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ； 1 100)在含 0. 2% BSA 的 Ix TBS(pH 7. 4)中稀釋，在濕室中于室溫下溫育1小時(shí)。接著用含0. 2% BSA的Ix TBS(pH 7. 4)洗滌 切片3次，每次2分鐘。然后在含0. 2% BSA的Ix TBS(pH 7. 4)中于4°C下應(yīng)用二級(jí)抗體 (羊抗兔 Fab-FITC, dianova，1 50)過夜。在用含 0. 2% BSA 的 Ix TBS(pH 7. 4)洗滌切 片3次，每次分鐘后，在室溫下應(yīng)用在含0.2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 100稀釋的 GMCSF 抗血清(SC13101 ；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA) 1 小時(shí)。如前述 洗滌3次切片并與在含0.2% BSA的Ix TBS(pH 7.4)中以1 200稀釋的生物素化羊抗兔 IgG(Vector Laboratories,USA)溫育30分鐘。在再次洗滌切片后，在室溫下應(yīng)用TRITC-綴 合的抗生物素蛋白鏈菌素(dianova;l 200) 1.5小時(shí)。接著，用Ix TBS洗滌切片3次，每 次2分鐘并用在Ix TBS中以1 10000稀釋的細(xì)胞核染料DAPI染色10分鐘。最后用Ix TBS洗滌切片3次，每次2分鐘并用熒光封固劑(Vectashield，Vector Laboratories, USA) 包埋。使用 Olympus 1X81 顯微鏡和“分析”軟件包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)獲得數(shù)碼照片。所有的雙熒光(double-fluorescence)試驗(yàn)通過平行的單染色進(jìn)行對(duì)照，以控制 第二通道中不存在任何熒光攜帶污染。作為第二對(duì)照，對(duì)于二級(jí)抗體而言，所有的雙熒光染 色使用了改變的生色團(tuán)。結(jié)果在齒狀回(圖32a_c)和門(圖32d_f)及皮層(圖32g_i)中的神經(jīng)元上GMCSF 受體(圖32a，d，g)和GMCSF(圖32b，e, h)共區(qū)域化。這些數(shù)據(jù)支持了 GMCSF是自分泌配 體的觀點(diǎn)。實(shí)施例28 通過腦缺血上調(diào)GMCSF及其受體腦缺血的MCAO模型用于誘導(dǎo)局灶性腦缺血(MCA0，大腦中動(dòng)脈閉塞)的方法如實(shí)施例1所述。全腦缺血模型如前所述進(jìn)行外科手術(shù)制備和瞬時(shí)全腦缺血。定量PCRRNA分離和cDNA合成按如前所述方案進(jìn)行。循環(huán)條件如下GMCSFR :95°C 5分鐘、 95°C 5 秒、62°C 10 秒、72°C 30 秒、80°C 10 秒，進(jìn)行 50 個(gè)循環(huán)；GMCSF :95°C 5 分鐘、95°C 5 秒、 600C 10秒、72°C30秒、81°C 10秒，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。用如下參數(shù)作出解鏈曲線95°C冷卻至 50°C;以0. 2V /秒速度斜線上升至99°C。使用了如下引物對(duì)大鼠GMCSFR"BR4-4s96”ACG TCG TTG GCT CAG TTATGT C (SEQ ID NO:60)，“BR4_4as272”ATT TAT GTC AGA GATGGA GGA TGG (SEQ ID NO :61)，“大鼠 GMCSF-723s”GGA GCTCTA AGC TTC TAG ATC (SEQ ID NO 62)和 “大鼠 GMCSF-908as，，GGC TCA ATG TGA TTT CTT GGG (SEQ ID NO :63)。按制造商推薦(Roche Diagnostics)，使用SYBR綠標(biāo)準(zhǔn)混合物進(jìn)行Lightcycler PCR。通過熔點(diǎn)分析和瓊脂 糖凝膠電泳確保產(chǎn)物特異性。將樣品的cDNA含量對(duì)Cyclophilin表達(dá)水平歸一化(引物 “cyc5，，ACC CCACCG TGT TCT TCG AC (SEQ ID NO 58) ； “ acyc300 "CATTTGCCATGGACAAGATG (SEQ ID N0:59))。相對(duì)調(diào)節(jié)水平源自對(duì)cyclophilin的歸一化，并與模擬手術(shù)動(dòng)物比較。誤 差條顯示了標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算了 3倍連續(xù)稀釋的cDNA樣品，反映了測(cè)量的可靠性。在同側(cè)和對(duì)側(cè)局灶性缺血2小時(shí)和6小時(shí)后，圖33A中顯示了 GMCSF十分強(qiáng)烈的 上調(diào)。GMCSF的誘導(dǎo)可顯示于全腦缺血中，雖然程度較小(圖33B)。甚至在全腦缺血6小 時(shí)后，GMCSF受體仍輕微上調(diào)(圖33C)。這些數(shù)據(jù)支持了 GMCSF是內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制一 部分的假說。實(shí)施例29 在海馬中GCSFR和雙皮質(zhì)激素的共區(qū)域化表達(dá)所用的免疫組化方法如前所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。代替GMCSF抗血清的是在含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4) 中以1 200稀釋的豚鼠抗雙皮質(zhì)激素(DCX)多克隆抗體(Chemicon International, Germany)。在用含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)洗滌切片3次，每次2分鐘后，將它們與 在含0.2%BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀釋的生物素化羊抗豚鼠IgG(Vector Laboratories, USA)溫育30分鐘。再次洗滌切片后，在室溫下應(yīng)用TRITC-綴合的抗生物 素蛋白鏈菌素(dianova ；1 200) 1. 5小時(shí)，以下方案描述如前。結(jié)果圖34顯示了在海馬齒狀回(a-c)和門(d_i)的神經(jīng)元上表達(dá)了 GMCSF受體(a，d， g)和雙皮質(zhì)激素(b，e, h)。G-CSF受體和未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物雙皮質(zhì)激素(Jin，Minami, Lan, Mao, Batteur, Simon and Greenberg(2001), Proc Natl Acad Sci USA,98,4710-5) (圖34c，f，i)交迭表達(dá)暗示了 GMCSF在神經(jīng)元分化初期的功能角色，并強(qiáng)調(diào)了 GMCSF對(duì)所 有神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的適用性，這里影響神經(jīng)發(fā)生的可作為治療的靶標(biāo)，如中風(fēng)、帕金森 氏癥、ALS等。實(shí)施例30 =GMCSF誘導(dǎo)成體神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元制備神經(jīng)干細(xì)胞如實(shí)施例9所述制備大鼠成體神經(jīng)干細(xì)胞。細(xì)胞每2-3周傳代一次，在SOOxg離心 細(xì)胞5分鐘，除去上清液并用Ix PBS洗滌一次。在重懸于Iml Accutase(Sigma)和在37°C 溫育15分鐘后，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，密度為1. 5-2. OxlO5細(xì)胞/孔。在第4 次傳代后，用 10ng/ml GMCSF ( Leukine⑧,Berlex，Schering AG Germany)刺激源自海馬 的神經(jīng)干細(xì)胞，3天后收獲細(xì)胞進(jìn)行RNA分離。未處理的細(xì)胞作為對(duì)照。定量PCR按制造商推薦，使用Qiagen Rneasy微型試劑盒分離SVZ的GMCSF-處理和未處理 的神經(jīng)球的RNA。使用寡dT引物、superscriptll逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco)和標(biāo)準(zhǔn)條件從5 μ g總 RNA合成cDNA。使用具有SYBR綠染色的DNA雙鏈的Lightcycler系統(tǒng)(Roche Diagnostics, Mannheim,Germany)進(jìn)行定量 PCR。Lightcycler PCR 的執(zhí)行、用于 β III-微管蛋白、NSE、 PLP和GFAP的循環(huán)條件和引物對(duì)如前所述。相對(duì)調(diào)節(jié)水平源自對(duì)cyclophilin的歸一化， 并與未處理的細(xì)胞進(jìn)行比較。在圖35A中神經(jīng)干細(xì)胞的分化潛能和分化細(xì)胞的特異性標(biāo)記 物表達(dá)如圖解所示意。用lOng/ml GMCSF處理神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生了明顯誘導(dǎo)了 β III-微管 蛋白的表達(dá)(η = 3 ;ρ < 0. 05，雙側(cè)t檢驗(yàn))，對(duì)于NSE——一種成熟神經(jīng)元標(biāo)記物則程度 較小(圖35B)。沒有觀察到PLP和GFAP表達(dá)水平的變化。該實(shí)施例強(qiáng)調(diào)了 GMCSF調(diào)節(jié)神 經(jīng)發(fā)生的適用性。可用于體外產(chǎn)生分化的神經(jīng)元，亦可影響內(nèi)源性干細(xì)胞，并可適用于許多人類疾病，特別是神經(jīng)變性疾病。實(shí)施例31 =G-CSF通過血腦屏障(BBB)在文獻(xiàn)中獲得最多的數(shù)據(jù)包括關(guān)于G-CSF及相關(guān)的細(xì)胞因子的血清水平信息。一 個(gè)對(duì)有效使用G-CSF無論以何種方法治療神經(jīng)系統(tǒng)病癥的重要因素是蛋白質(zhì)通過血腦屏 障(BBB)的能力。對(duì)該問題特別感興趣，這是因?yàn)橐阎S多蛋白質(zhì)藥物無法通過血液和神 經(jīng)元之間的天然邊界。另一方面，已有幾種蛋白質(zhì)，包括像促紅細(xì)胞生成素和粒細(xì)胞巨噬 細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的造血因子可通過BBB并有效地作用于CNS神經(jīng)元(McLay， 等· (1997)，Brain, 120,2083-91.，‘ Brines，等· (2000)，Proc Natl Acad Sci USA, 97, 10526-31)。為證實(shí)G-CSF能通過血腦屏障，我們?cè)诖笫竽X中檢驗(yàn)了已注射的G-CSF的情況。 因此，我們采用了非常靈敏的碘化測(cè)定法。G-CSF和BSA作為對(duì)照，通過Iodogen方法 (Sigma，Taufkirchen，Germany)用 131I (Amersham Biosciences，F(xiàn)reiburg Germany)進(jìn)行 放身寸標(biāo)記，并在 Sephadex G-25 (Amersham Biosciences, Freiburg Germany)柱上純化。純 化的蛋白與未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物共洗脫出來，當(dāng)通過大小排阻層析分析時(shí)，具有的正確分 子量單峰。將放射標(biāo)記的蛋白經(jīng)尾部靜脈注射入雌性Sprague-Dawley大鼠(250_300g)。 為了進(jìn)行競爭性攝取研究，將冷蛋白與標(biāo)記的化合物混合并共同注射。在解剖前不久用 Ronipun /iCetanest 麻醉大鼠并用ioomi鹽水通過下腹主動(dòng)脈灌注(在注射后ι、4和 24小時(shí))以除去血液。將全腦與血液分離、吸干并稱重。離心血液以獲得血清。用Y-計(jì)數(shù) 器(LB 951G，Berthold, Germany)測(cè)定放射性強(qiáng)度，連同可注射的樣品一起計(jì)算組織的％ ID/g。結(jié)果顯示G-CSF存在于腦中并與白蛋白比較，隨著時(shí)間過去通過血腦屏障增加了 4-5 倍。相較于1和4小時(shí)，在放射性標(biāo)記的G-CSF注射后24小時(shí)提取的樣品顯示了增加的水 平(圖36)。這些觀察資料顯示G-CSF由靜脈內(nèi)注射入血液中能通過BBB，并可主要地激活 CNS神經(jīng)元上的特異性受體。測(cè)定了血清和腦中的放射性標(biāo)記的G-CSF量，將腦/血清比率對(duì)時(shí)間作圖。牛血 清白蛋白作為對(duì)照物使用。為避免腦組織的血污染，在解剖前用IOOml鹽水灌注大鼠。實(shí)施例32 =GM-CSF通過血腦屏障(BBB)為顯示GM-CSF能通過血腦屏障，如實(shí)施例31對(duì)G-CSF所述，我們將碘處理的 GM-CSF注射大鼠。該實(shí)驗(yàn)給出了類似的結(jié)果，在靜脈內(nèi)給予后，比較GM-CSF和存在于大鼠 腦中的白蛋白顯示GM-CSF水平(腦/血清比率)高于白蛋白3-4倍。該數(shù)據(jù)證實(shí)了 GM-CSF 可通過血腦屏障(圖37)。圖37，測(cè)定了血清和腦中放射性標(biāo)記的GM-CSF量，將腦/血清比率對(duì)時(shí)間作圖。 牛血清白蛋白作為對(duì)照物使用。為避免腦組織的血污染，在解剖前用IOOml鹽水灌注大鼠。實(shí)施例33 =G-CSF用于治療肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)G-CSF和GM-CSF有益于ALS治療的想法源于兩方面首先，在脊髓前角的大運(yùn)動(dòng) 神經(jīng)元中都表達(dá)GCSF和GMCSF的受體和配體。其次，根據(jù)在ALS中細(xì)胞凋亡起效的證據(jù) (Li，等.(2000) ,Science，288，335-9)，因此證實(shí)了 G-CSF通過抵抗細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的部分作 用是十分吸引人的。最常使用的ALS小鼠模型是攜帶有SODl基因突變的轉(zhuǎn)基因小鼠，業(yè)已 顯示該SODl基因應(yīng)對(duì)家族性人ALS負(fù)責(zé)。那些最通常使用的是SODl (G93A)轉(zhuǎn)基因系。通 常，這些小鼠壽命降低并顯示出不好運(yùn)動(dòng)的進(jìn)展征兆，因此能容易地通過行為測(cè)試(如握力測(cè)試、旋轉(zhuǎn)試驗(yàn))進(jìn)行評(píng)估。在這些小鼠中業(yè)已進(jìn)行了許多對(duì)于治療功效的測(cè)試，并對(duì)于 諸如利魯唑(Riluzole)、二甲胺四環(huán)素(Minocycline)、卡尼汀(Carnitine)等的物質(zhì)顯示 出延壽活性。這些小鼠被認(rèn)為在臨床上可預(yù)測(cè)實(shí)用性，如利魯唑(Riluzole)，唯一被批準(zhǔn)用 于人的藥物，在這些小鼠中具有保護(hù)效果，而BDNF卻無法通過人體實(shí)驗(yàn)，因此不被批準(zhǔn)。因 此，我們測(cè)試了是否G-CSF能延長預(yù)期壽命，或在ALS的SODl轉(zhuǎn)基因小鼠中是否具有功能 性結(jié)果。SODl和野生型小鼠在出生后60天，皮下注射10 μ g/公斤體重的G-CSF或載體并 全程監(jiān)測(cè)。該結(jié)果清楚表明在G-CSF處理組中具有更長壽命的趨勢(shì)(圖38A)，和改善的運(yùn) 動(dòng)功能(握力強(qiáng)度測(cè)試(圖38B))，全過程中在幾個(gè)測(cè)量點(diǎn)具有顯著性。此外，在處理組中 具有增加重量的趨勢(shì)。圖38A :S0Dl-tg小鼠在出生后60天用10 μ g/公斤體重注射。在G-CSF處理的 SODl-tg小鼠中清楚表明具有延長預(yù)期壽命的趨勢(shì)(實(shí)線對(duì)虛線)。在幾個(gè)點(diǎn)上，差異達(dá)到顯著。
圖38B :S0Dl-tg小鼠在出生后60天用10 μ g/公斤體重注射。握力強(qiáng)度測(cè)試顯示 了在G-CSF處理的SODl-tg小鼠中改善的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度(空心方形對(duì)空心三角形)。在幾個(gè)點(diǎn) 上，差異達(dá)到顯著。實(shí)施例34 =GCSF在帕金森氏癥(PD)嚙齒動(dòng)物模型中的功效MPTP 模型通過使用神經(jīng)毒素1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)業(yè)已開發(fā)出性能最 好的帕金森氏癥(PD)模型。為研究GCSF在帕金森模型中的功效，我們給予8周大的雄性小 鼠MPTP。每組小鼠(η = 15)腹腔注射重復(fù)給予MPTP-HCl或鹽水(每日一次，持續(xù)5天，濃 度為30mg/kg，5ml/kg)并皮下注射重復(fù)給予(每日一次，持續(xù)22天)緩沖液、GCSF(0. 03mg/ kg/ ；5ml/kg)或二甲胺四環(huán)素(45mg/kg ;5ml/kg)。當(dāng)?shù)谝淮谓o予GCSF時(shí)，在MPTP (或組 0的鹽水)給予后立即進(jìn)行，而二甲胺四環(huán)素則在其后30分鐘給予，因?yàn)檫@兩種化合物可 能互相作用。每組所有的動(dòng)物在22天都被處死。直至該天，都一直在分析小鼠的運(yùn)動(dòng)活性 (加速旋轉(zhuǎn))并每日測(cè)定體重。此外，對(duì)每個(gè)腦進(jìn)行具有電化學(xué)檢測(cè)的HPLC分析用于測(cè)定 紋狀體和伏核中多巴胺、3，4_ 二羥苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)濃度。然而，在該模型中神經(jīng)保護(hù)藥物作用最重要和最直接的參數(shù)是中毒后神經(jīng)元的生 存率。因此，用每只動(dòng)物的中腦切片進(jìn)行酪氨酸(TH)免疫組化和TH-陽性神經(jīng)元的立體定 量(Triarhou，等.(1988)，JNeurocytol，17，221-32)。結(jié)果表明GCSF處理組具有體重增加趨勢(shì)(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，在加速旋轉(zhuǎn)測(cè)試 后觀察到運(yùn)動(dòng)活性的改善(數(shù)據(jù)未顯示)。近來在小鼠中用MPTP誘導(dǎo)帕金森病的研究顯 示在這些動(dòng)物中二甲胺四環(huán)素阻止了黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)變性(Du，等.(2001)，Proc Natl Acad SciUSA，98，14669-74)。在我們研究中，我們選擇了二甲胺四環(huán)素作為神經(jīng)保護(hù) 化合物參照物用于確認(rèn)我們的數(shù)據(jù)。用MPTP進(jìn)行超過連續(xù)5天的亞急性處理，在黑質(zhì)密部 中酪氨酸水解酶(TH)陽性神經(jīng)元明顯減少了(圖39A)。用GCSF和二甲胺四環(huán)素處理顯示 了抵抗TH陽性神經(jīng)元黑質(zhì)水平減少的相近功效(圖39B)。此外，當(dāng)多巴胺的紋狀體水平減 少時(shí)，GCSF和二甲胺四環(huán)素顯示了相近的治療效果(圖39B)，這里考慮到了多巴胺的代謝 物。實(shí)施例35 =GMCSF在帕金森氏癥模型中的功效
MPTP 模型如所述對(duì)GCSF的研究，在如下研究中確定GMCSF在帕金森模型中功效(參見前述 實(shí)施例)。每組小鼠(η = 15)腹腔注射重復(fù)給予MPTP-HC1或鹽水(每日一次，持續(xù)5 天，濃度為30mg/kg，5ml/kg)并皮下注射重復(fù)給予(每日一次，持續(xù)22天)緩沖液、 GMCSF(0. 03mg/kg/ ；5ml/kg)或二甲胺四環(huán)素(45mg/kg ；5ml/kg)。當(dāng)?shù)谝淮谓o予 GCSF 時(shí)， 在MPTP (或組0的鹽水)給予后立即進(jìn)行，而二甲胺四環(huán)素則在其后30分鐘給予，因?yàn)檫@ 兩種化合物可能互相作用。每組所有的動(dòng)物在22天都被處死。業(yè)已觀察到在給予GMCSF后，增加了體重并具有加速旋轉(zhuǎn)的運(yùn)動(dòng)活性改善，類似 于GCSF得分結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，當(dāng)考慮TH陽性神經(jīng)元的黑質(zhì)水平時(shí)，GMCSF的療 效可媲美于GCSF (圖39B)。相較于GCSF，在給予GMCSF后紋狀體多巴胺水平及其代謝物的 減少可抵消(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例36 =GCSF和GMCSF在大鼠帕金森氏癥6_羥多巴胺(60HDA)模型中的功效如上所例證，在小鼠MPTP模型中GCSF和GMCSF具有強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)特性。強(qiáng)烈證明 了對(duì)人帕金森氏癥的適用性，因?yàn)镸PTP是一種毒素，其被發(fā)現(xiàn)是由于能引起人PD。一種用于研究造血因子對(duì)帕金森氏癥功效的另外的模型是6-0HDA模型。該模型 是基于直接向黑質(zhì)或紋狀體中注射60HDA。該藥物選擇性積聚在多巴胺能神經(jīng)元中并導(dǎo)致 這些細(xì)胞凋亡。在大鼠中，60HDA是一種有效的神經(jīng)毒素，業(yè)已主要用于產(chǎn)生單側(cè)損傷?？赏?過測(cè)定響應(yīng)安非他明或阿樸嗎啡的旋轉(zhuǎn)行為來評(píng)估多巴胺損耗程度(Ungerstedt 1971)。 能容易并很好地定量構(gòu)成該模型主要優(yōu)點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)缺陷。除了行為參數(shù)外，也能測(cè)定免疫組 化后酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經(jīng)元紋狀體水平和多巴胺水平，以及在HPLC分析后其代謝 物水平。60HDA可用于確定GCSF和GMCSF在PD大鼠模型中的功效。在成體Sprague-Dawley 大鼠(體重250g)向黑質(zhì)或紋狀體中定向注射2μ1 8yg的60HDA后，造成單側(cè)損傷。在損 傷后，可每日皮下給予不同劑量的GCSF (0.03mg/kg;0. lmg/kg或其他)，持續(xù)2周。其他處 理組動(dòng)物在注射60HDA后，立即在紋狀體和黑質(zhì)內(nèi)給予單次劑量的GCSF或GMCSF (300 μ g/ kg)。對(duì)于MPTP模型研究而言，二甲胺四環(huán)素可作為神經(jīng)保護(hù)參照物(每日一次，45mg/kg， 皮下注射)。用緩沖液處理的模擬手術(shù)動(dòng)物和損傷動(dòng)物用作為對(duì)照組。兩周后，對(duì)損傷動(dòng)物 進(jìn)行旋轉(zhuǎn)行為測(cè)試。大鼠皮下注射阿樸嗎啡，置于滾籠中，記錄1小時(shí)內(nèi)對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)數(shù)。使 用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試比較每組動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)數(shù)。在行為測(cè)試后，處死動(dòng)物并對(duì)腦進(jìn)行免疫化學(xué) 處理以分析TH-陽性神經(jīng)元的總數(shù)并用HPLC測(cè)定多巴胺水平。實(shí)施例37 =GMCSF在神經(jīng)元中通過激活stat3途徑產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡活性如上已例證(實(shí)施例22)，GCSF能有效抑制初級(jí)神經(jīng)元中細(xì)胞凋亡。我們猜想 GMCSF也可具有強(qiáng)的抗細(xì)胞凋亡作用機(jī)制。因此，如實(shí)施例22所例證對(duì)GMCSF進(jìn)行相同類 型的實(shí)驗(yàn)。這里，應(yīng)用于神經(jīng)元的濃度為50ng GMCSF(Leukine，Immunex)/毫升培養(yǎng)液。圖40，部分I顯示了 GMCSF抑制PARP裂解，即特異性存在的細(xì)胞凋亡信號(hào)。通過 使用NO-供體N0R3誘導(dǎo)初級(jí)神經(jīng)元中細(xì)胞死亡。圖40，部分II顯示了 GMCSF無法產(chǎn)生增加的STATl ( “pSTATl”)或 STAT5( “pSTAT5”)磷酸化，盡管蛋白自身在神經(jīng)元中表達(dá)。圖40，部分III A.顯示了 GMCSF產(chǎn)生時(shí)間依賴性STAT3激活，即在GMCSF刺激
615分鐘后達(dá)到最大。在60分鐘，PSTAT3水平下降，低于初始水平，已知為來自造血系統(tǒng)細(xì) 胞的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。B.三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的定量。Cquantification of three independent experiments. C.通過磷酸化激活的STAT3可為JAK2抑制劑AG490所抑制。給予GMCSF5分 鐘后，pSTAT3水平與抑制劑存在情況下的水平完全不同。圖40，部分IV顯示了 GMCSF強(qiáng)烈誘導(dǎo)stat3靶基因Bcl2和BclXl表達(dá)。已知這 些基因能抗細(xì)胞凋亡。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 1.)在神經(jīng)元上GMCSF具有抗細(xì)胞凋亡活性，2.)是通過stat3途徑 介導(dǎo)的。因此，也證實(shí)了在神經(jīng)元中使用stat3系統(tǒng)作為一種篩選工具用于發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng) 保護(hù)藥物的可能性，包括新的GCSF或GMCSF模擬物。實(shí)施例38 =GMCSF在嚙齒動(dòng)物中風(fēng)模型中減小梗塞體積我們?cè)诖蟛糠秩斯J(rèn)的大鼠中風(fēng)模型——大腦中動(dòng)脈閉塞模型(MACO)中使用 GMCSF進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。原則上，該實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例1和19例示來進(jìn)行。簡言之，使用吸入麻醉法(氟烷/ N20/02)來麻醉雄性Wistar大鼠。暴露頸動(dòng)脈，并將帶涂層的尼龍絲插入頸總動(dòng)脈中，前進(jìn)至其阻塞血流產(chǎn)生MCA 為止。通過激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)細(xì)絲的正確位置。在閉塞90分鐘后，取出細(xì)絲以容許 再灌注。在局部缺血發(fā)作30分鐘或3小時(shí)后，通過輸液泵向靜脈內(nèi)導(dǎo)管(股靜脈)給予大 鼠250 μ g/公斤體重劑量的GMCSF(Leukine，Immunex)，時(shí)間大約為20分鐘。使用TTC-染 色的標(biāo)準(zhǔn)方法和以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的容量分析法在24小時(shí)后測(cè)定梗塞體積。圖41證實(shí)了在GMCSF處理的動(dòng)物中梗塞體積明顯減少，不但在早期(圖41，部分 I)，而且也在3小時(shí)的窗口晚期(圖41，部分II)。一般而言，該實(shí)驗(yàn)例證了 GMCSF對(duì)于神 經(jīng)變性病癥的適用性，具體而言，針對(duì)中風(fēng)治療的適用性。所有于此引用的參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)合出版物的全部內(nèi)容并入作為參考。顯而易見，根據(jù)上述教導(dǎo)本發(fā)明眾多的修飾和變化是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解在附 加的權(quán)利要求范圍內(nèi)，本發(fā)明可以不同于本文中所述特定方式的其他方式來實(shí)施。綜上，本發(fā)明可涉及如下方面1. 一種治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物足夠量的造 血因子來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，所述造血因子選自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物 和它們的組合物。2.方案1的方法，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機(jī)制 的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、具有涉及缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)變性疾病和伴隨神經(jīng) 細(xì)胞死亡的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。3.方案1的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機(jī)制的 神經(jīng)系統(tǒng)疾病。4.方案3的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病是 中風(fēng)。5.方案1的方法，進(jìn)一步包含給予一種或多種附加的造血因子。6.方案1的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是精神病。
7.方案6的方法，其中精神病是抑郁癥。
8.方案1的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是癡呆或多發(fā)性硬化癥。
9.方案8的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細(xì)胞刺激因子、白介素和促紅細(xì)胞生成素D
10.方案9的方法，其中將GCSF和促紅細(xì)胞生成素給予哺乳動(dòng)物。
11.方案1的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是由手術(shù)操作過程中心臟停搏或腦缺血引起的中風(fēng)、帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、神經(jīng)外傷、腦缺血。
12.方案的方法，其中造血因子是GCSF或GCSF衍生物。
13.方案的方法，其中造血因子是GMCSF或GMCSF衍生物。
14.方案的方法，其進(jìn)一步包含給予血流動(dòng)力學(xué)活性化合物。
15.方案的方法，其進(jìn)一步包含給予哺乳動(dòng)物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。
16.方案的方法，其進(jìn)一步包含給予幫助通過血腦屏障的藥劑。
17.方案的方法，進(jìn)一步包含給予抗細(xì)胞凋亡劑。
18.方案5的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是中風(fēng)。
19.方案0的方法，進(jìn)一步包含給予哺乳動(dòng)物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。
20.方案的方法，其中造血因子是人因子或衍生自人因子。
21.方案的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
22.方案的方法，其中造血因子通過一種或多種方式給予，所述方式選自直接
大腦內(nèi)注射、由靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)口和皮下。23.方案1的方法，其中給予造血因子包含給予多核苷酸，其當(dāng)在哺乳動(dòng)物中給予 時(shí)，表達(dá)足夠治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病量的造血因子。24.方案23的方法，其中多核苷酸與病毒載體或脂質(zhì)體給予。25. 一種治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，包含將神經(jīng)干細(xì)胞組合物與造血因 子接觸，所述造血因子選自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF、GCSF衍生物和它們的組合物；隨后 將神經(jīng)干細(xì)胞給予有需要的哺乳動(dòng)物。26.方案25的方法，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機(jī) 制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、具有涉及缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)變性疾病和伴隨神 經(jīng)細(xì)胞死亡的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。27.方案26的方法，具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。28.方案27的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病 是中風(fēng)。29.方案25的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是精神病。30.方案29的方法，其中精神病是抑郁癥。31.方案25的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是癡呆或多發(fā)性硬化癥。32.方案25的方法，進(jìn)一步包含將神經(jīng)干細(xì)胞組合物與一種或多種附加的造血因 子接觸。33.方案32的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細(xì)胞刺激因子、白介素和促紅 細(xì)胞生成素。34.方案33的方法，其中將神經(jīng)干細(xì)胞組合物與GCSF和促紅細(xì)胞生成素接觸。
35.方案25的方法，其中由手術(shù)操作過程中心臟停搏或腦缺血引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾 病是中風(fēng)、帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、神經(jīng)外傷、腦缺血。36.方案25的方法，其中造血因子是GCSF或GCSF衍生物。37.方案25的方法，其中造血因子是GMCSF或GMCSF衍生物。38.方案25的方法，其中造血因子是人因子或衍生自人因子。39.方案25的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。40.方案25的方法，其中神經(jīng)干細(xì)胞組合物包含人神經(jīng)干細(xì)胞。41. 一種用于鑒定與神經(jīng)元細(xì)胞上粒細(xì)胞集落刺激因子受體結(jié)合的化合物的方 法，所述化合物激活神經(jīng)元細(xì)胞中的STAT，包含將神經(jīng)元細(xì)胞與化合物接觸；并相對(duì)于不 與該化合物接觸的神經(jīng)元細(xì)胞中STAT激活作用，測(cè)定STAT激活作用的增加，其中STAT激 活作用的增加表明化合物與神經(jīng)元細(xì)胞上粒細(xì)胞集落刺激因子受體結(jié)合。42.方案41的方法，其中STAT基因是STAT-3。43.方案41的方法，其中STAT基因是STAT-5。44. 一種根據(jù)方案41的方法鑒定的化合物。45. 一種治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物足夠治療 神經(jīng)系統(tǒng)疾病量的方案44的化合物。46.方案45的方法，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機(jī) 制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、具有涉及缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)變性疾病和伴隨神 經(jīng)細(xì)胞死亡的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。47.方案46的方法，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是具有涉及局部缺血病理生理機(jī)制的 神經(jīng)系統(tǒng)疾病。48.方案47的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病 是中風(fēng)。49.方案45的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是精神病。50.方案49的方法，其中精神病是抑郁癥。51.方案45的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是癡呆或多發(fā)性硬化癥。52.方案48的方法，其進(jìn)一步包含給予哺乳動(dòng)物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。53.方案45的方法，進(jìn)一步包含給予一種或多種附加的造血因子。54.方案53的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細(xì)胞刺激因子、白介素和促紅 細(xì)胞生成素。55.方案45的方法，其進(jìn)一步包含給予血流動(dòng)力學(xué)活性化合物。56.方案45的方法，其進(jìn)一步包含給予幫助通過血腦屏障的藥劑。57.方案45的方法，其進(jìn)一步包含給予抗細(xì)胞細(xì)胞凋亡劑。58.方案45的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。59.方案45的方法，其中化合物通過一種或多種方式給予，所述方式選自直接大 腦內(nèi)注射、由靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)口和皮下。60.方案45的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是由手術(shù)操作過程中心臟停搏或腦缺血引 起的中風(fēng)、帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、神經(jīng)外傷、腦缺血。61. 一種用于鑒定與神經(jīng)元細(xì)胞上粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體結(jié)合和/或激活神經(jīng)元細(xì)胞中STAT基因表達(dá)的化合物的方法，該方法包括將神經(jīng)元細(xì)胞與化合物接 觸；并相對(duì)于不與該化合物接觸的神經(jīng)元細(xì)胞中STAT基因激活，測(cè)定STAT激活增加，其中 STAT激活增加表明化合物與神經(jīng)元細(xì)胞上粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體結(jié)合。62.方案61的方法，其中STAT基因是STAT-3。63.方案61的方法，其中STAT基因是STAT-5。64. 一種根據(jù)方案61的方法鑒定的化合物。65. 一種治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物足夠治療 神經(jīng)系統(tǒng)疾病量的方案64的化合物。66.方案65的方法，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機(jī) 制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、具有涉及缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)變性疾病和伴隨神 經(jīng)細(xì)胞死亡的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。67.方案66的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機(jī)制 的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。68.方案67的方法，其中具有涉及局部缺血病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病是中 風(fēng)。69.方案67的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是精神病。70.方案69的方法，其中精神病是抑郁癥。71.方案57的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是癡呆或多發(fā)性硬化癥。72.方案68的方法，其進(jìn)一步包含給予哺乳動(dòng)物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。73.方案65的方法，進(jìn)一步包含給予一種或多種附加的造血因子。74.方案73的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細(xì)胞刺激因子、白介素和促紅 細(xì)胞生成素。75.方案65的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。76.方案65的方法，其中化合物通過一種或多種方式給予，所述方式選自直接大 腦內(nèi)注射、由靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)口和皮下。77. 一種用于鑒定具有改善的GCSF受體激動(dòng)劑活性的化合物的方法，該方法包括 將該化合物與具有GCSF受體的神經(jīng)細(xì)胞接觸，測(cè)定該化合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)效果， 并將該化合物與GCSF比較所述效果，其中相對(duì)于GCSF的效果，該化合物具有更高的神經(jīng)保 護(hù)效果，表明了該化合物具有改善的GCSF受體激動(dòng)劑活性。78. 一種根據(jù)方案77的方法鑒定的化合物。79. 一種治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物足夠治療 神經(jīng)系統(tǒng)疾病量的方案78的化合物。80.方案79的方法，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機(jī) 制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、具有涉及缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)變性疾病和伴隨神 經(jīng)細(xì)胞死亡的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。81.方案79的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是具有涉及局部缺血病理生理機(jī)制的神經(jīng) 系統(tǒng)疾病。82.方案81的方法，其中具有涉及局部缺血病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病是中 風(fēng)。
83.方案79的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是精神病。84.方案83的方法，其中精神病是抑郁癥。85.方案79的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是癡呆或多發(fā)性硬化癥。86.方案81的方法，其進(jìn)一步包含給予哺乳動(dòng)物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。87.方案79的方法，進(jìn)一步包含給予一種或多種附加的造血因子。88.方案87的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細(xì)胞刺激因子、白介素和促紅 細(xì)胞生成素。89.方案79的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。90.方案79的方法，其中化合物通過一種或多種方式給予，所述方式選自直接大 腦內(nèi)注射、由靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)口和皮下。91.方案79的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是由手術(shù)操作過程中心臟停搏或腦缺血引 起的中風(fēng)、帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、神經(jīng)外傷、腦缺血。92. 一種用于鑒定具有改善的GCSF受體激動(dòng)劑活性的化合物的方法，該方法包括 將該化合物與具有GCSF受體的神經(jīng)細(xì)胞接觸，比較在該神經(jīng)細(xì)胞和另一與GCSF接觸的神 經(jīng)細(xì)胞中STAT基因表達(dá)水平，其中相對(duì)于在所述另一神經(jīng)細(xì)胞中STAT激活，在與該化合物 接觸的神經(jīng)細(xì)胞中STAT激活增加，表明該化合物具有改善的GCSF受體激動(dòng)劑活性。93.方案92的方法，其中STAT激活是STAT3和STAT5激活的任一或兩者。94. 一種根據(jù)方案92的方法鑒定的化合物。95. 一種治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物足夠治療 神經(jīng)系統(tǒng)疾病量的方案94的化合物。96.方案95的方法，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機(jī) 制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、具有涉及缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)變性疾病和伴隨神 經(jīng)細(xì)胞死亡的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。97.方案95的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機(jī)制 的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。98.方案97的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾 病是中風(fēng)。99.方案95的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是精神病。100.方案99的方法，其中精神病是抑郁癥。101.方案95的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是癡呆或多發(fā)性硬化癥。102.方案95的方法，其進(jìn)一步包含給予哺乳動(dòng)物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。103.方案95的方法，進(jìn)一步包含給予一種或多種附加的造血因子。104.方案103的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細(xì)胞刺激因子、白介素和促 紅細(xì)胞生成素。105.方案95的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。106.方案95的方法，其中化合物通過一種或多種方式給予，所述方式選自直接 大腦內(nèi)注射、由靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)口和皮下。107.方案95的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病是由手術(shù)操作過程中心臟停搏或腦缺血 引起的中風(fēng)、帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、神經(jīng)外傷、腦缺血。
108. 一種提高移植入哺乳動(dòng)物細(xì)胞生存率的方法，該方法包括將一種或多種編碼 造血因子的多核苷酸導(dǎo)入該細(xì)胞，所述造血因子選自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍 生物和它們的組合，其中相對(duì)于在導(dǎo)入所述一種或多種多核苷酸前的細(xì)胞生存率，該細(xì)胞 以足以提高細(xì)胞生存率的量表達(dá)所述造血因子。109.方案108的方法，其中細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)并分泌一種或多種附加的造血因子。110.方案109的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細(xì)胞刺激因子、白介素和促 紅細(xì)胞生成素。111.方案108的方法，其中造血因子是GCSF或GCSF衍生物。112.方案108的方法，其中造血因子是GMCSF或GMCSF衍生物。113.方案108的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。114.方案108的方法，其中細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。115.方案114的方法，其中神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。116.方案114的方法，其中細(xì)胞是干細(xì)胞。117.方案108的方法，其中細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)GCSF受體和GMCSF受體的一種或兩 種。118.方案108的方法，其中細(xì)胞移植入哺乳動(dòng)物神經(jīng)組織。119. 一種提高神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物生存力的方法，該方法包括相對(duì)于在與造血因子接 觸前該培養(yǎng)物，將該神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物與足以提高該神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物生存力的量的造血因子 接觸，所述造血因子選自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物和它們的組合物。120.方案119的方法，其中神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物包含神經(jīng)干細(xì)胞。121. 一種提高神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物生存力的方法，該方法包括將一種或多種多核苷酸 導(dǎo)入該神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，其中多核苷酸表達(dá)的造血因子選自GMCSF、GMCSF衍生 物、GCSF, GCSF衍生物和它們的組合物，和其中相對(duì)于與造血因子接觸前的該培養(yǎng)物，多核 苷酸表達(dá)足以提高該神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物生存能力的量的造血因子。122.方案121的方法，其中多核苷酸與病毒載體或脂質(zhì)體給予。123. 一種用于提高在危急中哺乳動(dòng)物認(rèn)知能力的方法，該方法包括相對(duì)于在給 予前的哺乳動(dòng)物，給予足以提高哺乳動(dòng)物認(rèn)知能力的量的造血因子，所述造血因子選自 GMCSF, GMCSF衍生物、GCSF、GCSF衍生物和它們的組合物。124.方案123的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。125. 一種鑒定增加腦中粒細(xì)胞刺激因子和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子至少之一的 內(nèi)源性水平的化合物的方法，該方法包括將神經(jīng)元細(xì)胞與該化合物接觸；和相對(duì)于沒有與 該化合物接觸的神經(jīng)元細(xì)胞中的該水平，測(cè)定粒細(xì)胞刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子 或兩者增加的水平，其中在粒細(xì)胞刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子或兩者中增加，表明 化合物能增加神經(jīng)元細(xì)胞中粒細(xì)胞刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子或兩者的內(nèi)源性水 平。126. 一種根據(jù)方案125的方法鑒定的化合物。127. 一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物足夠治療該神經(jīng)系 統(tǒng)疾病的量的方案126的化合物。128.方案127的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
序列表
<110>SCHNEIDER, ARMIN
SCHAEBITZ, WOLF-RUEDIGER
KOLLMAR, RAINER
SCHWAB, STEFAN
<120>使用造血生長因子治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法
<130>229530US
<160>65
<170>PatentIn 3. 2 版
<210>1
<211>70
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的契合序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2). . (5)
<223>Xaa是任意氨基酸
<220>
<22l>misc_feature
<222>(6). . (41)
<223>Xaa是任意氨基酸
<220>
<22l>misc_feature
<222>(33). . (41)
<223>可能存在或不存在
<220>
<22l>misc_feature
<222>(46). . (46)
<223>Xaa可以是任意氨基酸
<220>
<22l>misc_feature
<222>(47). . (49)
<223>Xaa是任意氨基酸
<220>
<22l>misc_feature
<222>(47). . (49)
<223>氨基酸可以存在或不存在
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>8cctggaagct gttgttccat g21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>9accccaccgt gttcttcgac20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>10catttgccat ggacaagatg20<210>11<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽序列<400>11Leu Gly His Ser Leu Gly Ile15<210>12<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223> 合成 DNA
<400>12
cgggatccgg gaccgcgtat ctgatgacga
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成 DNA
<400>13
ctcggagacg ctgaggaagg acctg
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成 DNA
<400>14
ctgcggccct agaccacgcc caccgctccc
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成 DNA
<400>15
acgtcgttgg ctcagttatg tc
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成 DNA
<400>16
atttatgtca gagatggagg atgg
<210>17
<211>20
<212>DNA
gcgtgtcaa39
25
cgtgacgtcg40
22
72
<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>17accccaccgt gttcttcgac<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>18cBtttgccBt ggacaagatg<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>19acgtcgttgg ctcagttatg tc<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>20atttatgtca gagatggagg atgg<210>21<211>177<212>DNA<213> 家鼠<400>21acgtcgttggctcacagggactgtggccct<210>22<211>400
20
20
22
24
ctcagttatg tcagacagga aatctcacca tcccacaatg attgacagct atcccgcctc cgctgggacc aattgacatc acggacagga atacccgccc gatgggcagg tcctgcctgg ctcccatcct ccatctctga cataaat
60 120 1770795]<212>PRT0796]<213>智人0797]<400>220798]MetLeuLeuLeuValThrSerLeuLeuLeuCysGluLeuProHisPro0799]1510150800]AlaPheLeuLeulieProGluLysSerAspLeuArgThrValAlaPro0801]2025300802]AlaSerSerLeuAsnValArgPheAspSerArgThrMetAsnLeuSer0803]3540450804]TrpAspCysGlnGluAsnThrThrPheSerLysCysPheLeuThrAsp0805]5055600806]LysLysAsnArgValValGluProArgLeuSerAsnAsnGluCysSer0807]657075800808]CysThrPheArgGlulieCysLeuHisGluGlyValThrPheGluVal0809]8590950810]HisValAsnThrSerGlnArgGlyPheGlnGlnLysLeuLeuTyrPro0811]1001051100812]AsnSerGlyArgGluGlyThrAlaAlaGlnAsnPheSerCysPhelie0813]1151201250814]TyrAsnAlaAspLeuMetAsnCysThrTrpAlaArgGlyProThrAla0815]1301351400816]ProArgAspValGlnTyrPheLeuTyrlieArgAsnSerLysArgArg0817]1451501551600818]ArgGlulieArgCysProTyrTyrlieGlnAspSerGlyThrHisVal0819]1651701750820]GlyCysHisLeuAspAsnLeuSerGlyLeuThrSerArgAsnTyrPhe0821]1801851900822]LeuValAsnGlyThrSerArgGlulieGlylieGlnPhePheAspSer0823]1952002050824]LeuLeuAspThrLysLyslieGluArgPheAsnProProSerAsnVal0825]2102152200826]ThrValArgCysAsnThrThrHisCysLeuValArgTrpLysGlnPro0827]2252302352400828]ArgThrTyrGlnLysLeuSerTyrLeuAspPheGlnTyrGlnLeuAsp0829]2452502550830]ValHisArgLysAsnThrGlnProGlyThrGluAsnLeuLeulieAsn0831]2602652700832]ValSerGlyAspLeuGluAsnArgTyrAsnPheProSerSerGluPro0833]275280285
ArgAlaLysHisSerValLyslieArgAlaAlaAspValArglieLeu
290295300
AsnTrpSerSerTrpSerGluAlalieGluPheGlySerAspAspGly
305310315320
AsnLeuGlySerValTyrlieTyrValLeuLeulieValGlyThrLeu
325330335
ValCysGlylieValLeuGlyPheLeuPheLysArgPheLeuArglie
340345350
GlnArgLeuPheProProValProGlnlieLysAspLysLeuAsnAsp
355360365
AsnHisGluValGluAspGlulielieTrpGluGluPheThrProGlu
370375380
GluGlyLysGlyTyrArgGluGluValLeulieValLysGlulieThr
385390395400
<210>23
<211>388
<212>PRT
<213> 小鼠
<400>23
MetThrSerSerHisAlaMetAsnlieThrProLeuAlaGlnLeuAla
151015
LeuLeuPheSerThrLeuLeuLeuProGlyThrGlnAlaLeuLeuAla
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Pro 5
Ala
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Cys
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Trp
Cys
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Thr
50
Thr
Gly
35
Leu
Ala 20
Leu Ala His Phe
Thr Gln Gly Pro 25 Asn
Pro
Ser Trp Ala Val lie Asp
Cys
55
Glu
His
40
Gly
Gly Ala Gly lie
Leu Ala Leu Leu Cys Cys 1015
Thr Asp Pro Ser Thr Pro 30
Leu Thr Phe Asp Pro Gly Thr 45
His Asp
Gly Cys Arg Cys 85
Ala Gly
Gln 70
Arg Phe Gln Pro
Asp Leu Glu
Leu Arg
Thr
Cys 130
Phe 115 Glu
Val 100
Glu Asn Glu
Asp Lys Gly
lie Leu Ala Ala 135
Ala 120 His
Gly 105 Pro
Met
90
His
Arg
75
Glu
Gly Ala 60
Arg Arg Leu His
Val Met Ser Val Arg Arg
Ala Gln Val Gly Ser Gly
His 110 Glu
Gly
95
Gln
Ser 80 Val
Thr
Phe Leu Cys
Cys 140
Ala 125
Tyr Trp
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權(quán)利要求
GCSF或編碼GCSF的多核苷酸在制備用于治療哺乳動(dòng)物中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機(jī)制的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述疾病是中風(fēng)。
3.如權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述哺乳動(dòng)物是人受試者。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述GCSF是人GCSF或衍生自人GCSF。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述治療在局部缺血損傷后1-7天開始。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其中所述治療在局部缺血事件后持續(xù)至少2周.
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述治療至少在齒狀回中刺激成體干細(xì) 胞的神經(jīng)發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過給予諸如粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)的造血生長因子治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。本發(fā)明也提供了用于篩選與神經(jīng)元細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的GCSF或GMCSF受體結(jié)合的化合物的方法；所述化合物提供了神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)增殖和/或STAT基因激活活性。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101926981SQ20091017551
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2003年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者A·施奈德, C·克呂格爾, C·索默, D·韋伯, M·毛雷爾, N·加斯勒, R·科爾馬, S·施瓦布, W·-R·謝比茨 申請(qǐng)人:西格尼斯生物科技有限責(zé)任兩合公司