本發(fā)明涉及亞硫酸氫根熒光檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種檢測(cè)亞硫酸氫根的試劑及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

最新研究表明，生物體內(nèi)亞硫酸鹽可以通過活性氧物質(zhì)(ros)氧化硫化氫或含硫氨基酸而內(nèi)源性產(chǎn)生，這可能導(dǎo)致體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激性疾病。h2o2作為一種活性氧物質(zhì)(ros)，是細(xì)胞代謝的必然副產(chǎn)物。氧化應(yīng)激的信號(hào)分子如：二氧化硫(so2)也被認(rèn)為是一種環(huán)境污染物，研究表明，二氧化硫通常與神經(jīng)系統(tǒng)疾病，心血管疾病甚至肺癌的病發(fā)相關(guān)。so2的毒性主要?dú)w因于其二種還原劑衍生物，亞硫酸鹽(so3^2-)和亞硫酸氫鹽(hso3^-)，因此，開發(fā)有效的方法監(jiān)測(cè)亞硫酸氫根具有重大的研究有意義，對(duì)于生物研究和臨床診斷起著至關(guān)重要的作用。

目前，大部分熒光探針使用熒光增強(qiáng)型實(shí)現(xiàn)三亞硫酸氫根的檢測(cè)，檢測(cè)限較高。因此研究開發(fā)一種信號(hào)響應(yīng)明顯且檢測(cè)限低的、可以在細(xì)胞濃度水平上檢測(cè)亞硫酸的試劑顯得尤為重要。

在本發(fā)明中，合成了一種基于半花菁的化合物，通過亞硫酸氫根和化合物在親核取代反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度的比率變化，實(shí)現(xiàn)亞硫酸氫根的特異性檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種合成簡(jiǎn)單、操作方便、選擇性高、信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)、檢測(cè)限低的定量檢測(cè)亞硫酸氫根的試劑及其制備方法，以及該試劑在亞硫酸氫根和雙氧水檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種檢測(cè)亞硫酸氫根的試劑，它是(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物，英文名稱是：(e)-2-(2-(3h-benzo[f]chromen-2-yl)vinyl)-3-methylbenzo[d]thiazol-3-iumiodide，結(jié)構(gòu)式為：

(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的合成方法，步驟為：

將摩爾比為1:2.5:2.5的2-羥基-1-萘甲醛和丙烯醛及碳酸鉀溶解在的1,4-二氧六環(huán)溶液中；混合物在105℃加熱反應(yīng)72-75小時(shí)；反應(yīng)完成后，將其冷卻至室溫倒入冰水中攪拌30分鐘；混合物用乙酸乙酯萃取三次,有機(jī)相減壓旋干；經(jīng)硅膠柱色譜分離(乙酸乙酯:石油醚，9:1,v/v)純化得3h-苯并[f]色烯-2-甲醛；

將摩爾比為1:1.4的3h-苯并[f]色烯-2-甲醛和2,3-二甲基苯并噻唑-3-碘化物溶于乙醇中，加入催化劑哌啶；混合物在78℃攪拌回流12-14小時(shí)，然后冷卻至室溫，過濾、洗滌、真空干燥得到墨綠色固體，即(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物。

一種檢測(cè)亞硫酸氫根的方法，步驟為：

(1)、配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液；

(2)、按體積比9:1將pbs緩沖溶液和dmso溶液加到2ml熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測(cè)，隨著待測(cè)樣的加入,630nm處的熒光強(qiáng)度的逐漸降低，伴隨著520nm熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；

(3)、用蒸餾水配制2mm的亞硫酸氫根溶液，按體積比9:1將pbs緩沖溶液和dmso溶液加到2ml熒光比色皿中，逐漸加入亞硫酸氫根溶液的體積為0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30μl，同時(shí)在熒光光譜儀上測(cè)定520nm處與630nm處相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值(i520/i630)為、0.404、0.609、1.231、2.667、4.471、6.970、9.583、11.500、13.529、14.375、14.385，以亞硫酸氫根濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)熒光強(qiáng)度比值(i520/i630)為縱坐標(biāo)繪制圖，得到亞硫酸氫根濃度的工作曲線；線性回歸方程為：f520/f630＝0.71c-3.52，c的單位為10^-6mol/l；

(4)、測(cè)定樣品溶液時(shí)，將測(cè)得的熒光強(qiáng)度代入線性回歸方程，即可求得亞硫酸氫根的濃度。

一種檢測(cè)過氧化氫的方法，步驟為：

(1)、配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液；

(2)、把10μldmso溶液加入到2mlpbs–dmso(10mm,ph＝7.4,9:1,v/v)的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測(cè)，隨著待測(cè)樣亞硫酸氫根的加入,630nm處的熒光強(qiáng)度的逐漸降低，伴隨著在520nm熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；

(3)、用蒸餾水配制2mm的過氧化氫溶液，取100μm過氧化氫溶液，逐漸用微量進(jìn)樣器加到加入上述比色皿中，邊加過氧化氫邊在熒光分光光度儀上檢測(cè)，隨著過氧化氫的加入，520nm處熒光強(qiáng)度降低，630nm處熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),體系熒光逐漸恢復(fù)到探針本身的熒光強(qiáng)度。

本發(fā)明的(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物還可用于細(xì)胞成像。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：1、檢測(cè)體系成本低廉，且兩步合成；2、本發(fā)明的檢測(cè)方法，對(duì)亞硫酸氫根檢測(cè)顯示了高的靈敏性和選擇性；3、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單，只需要借助熒光光譜儀即可實(shí)現(xiàn)。4、檢測(cè)信號(hào)明顯，為比率型熒光。

附圖說明

圖1實(shí)施例1制備的(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的核磁氫譜圖

圖2實(shí)施例1制備的(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的核磁碳譜圖

圖3實(shí)施例1制備的(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的質(zhì)譜圖

圖4實(shí)施例2(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物與hso3^-作用的熒光發(fā)射圖

圖5實(shí)施例3(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物與hso3^-作用后過氧化氫可逆性恢復(fù)探針熒光發(fā)射圖

圖6實(shí)施例4(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物與各種分析物的熒光柱狀圖

圖7實(shí)施例5測(cè)定亞硫酸氫根的工作曲線

圖8實(shí)施例6測(cè)定樣品的熒光發(fā)射圖

圖9實(shí)施例7檢測(cè)亞硫酸氫根的細(xì)胞成像圖

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的制備及表征

將丙烯醛(0.5ml,7.5mmol)和2-羥基-1-萘甲醛(0.516g,3.0mmol)溶解在含有碳酸鉀(1.035g,7.5mmol)的1,4-二氧六環(huán)溶液中。混合物在105℃加熱反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)完成后，將其冷卻至室溫倒入冰水中攪拌30分鐘。混合物用乙酸乙酯萃取三次,有機(jī)相減壓旋干,然后通過柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚，9:1,v/v)得到3h-苯并[f]色烯-2-甲醛。

將3h-苯并[f]色烯-2-甲醛(0.105g,0.5mmol)和2,3-二甲基苯并噻唑-3-碘化物(0.204g,0.7mmol)溶于乙醇中，加入催化劑哌啶(30μl)催化劑。混合物在78℃攪拌回流12小時(shí)，然后冷卻至室溫，過濾、洗滌、真空干燥得到墨綠色固體。即為e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物。

¹hnmr(600mhz,dmso)δ8.44(d,j＝8.0hz,1h),8.33(s,1h),8.23(d,j＝8.4hz,1h),8.20(d,j＝8.5hz,1h),8.07(d,j＝15.6hz,1h),7.99(d,j＝8.9hz,1h),7.94(d,j＝8.1hz,1h),7.88(t,j＝7.8hz,1h),7.80(t,j＝7.7hz,1h),7.67(t,j＝7.6hz,1h),7.49(t,j＝7.4hz,1h),7.39(d,j＝15.7hz,1h),7.25(d,j＝8.8hz,1h),5.38(s,2h),4.32(s,3h),2.09(s,1h).(圖1).¹³cnmr(151mhz,dmso)δ170.77,153.89,144.86,141.56,132.80,132.10,129.46,128.80,128.51,128.32,127.70,127.47,127.39,127.17,124.15,123.66,120.91,116.81,116.15,114.73,111.87,63.65,35.61(圖2).esi-ms:m/zcalcd356.1104,found356.1116(圖3).

實(shí)施例2

配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的溶液；把10μl(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液加入到2mlpbs–dmso(10mm,ph＝7.4,9:1,v/v)的熒光比色皿中，取亞硫酸氫根溶液，逐漸用微量進(jìn)樣器加到此比色皿中，邊加樣邊在熒光分光光度儀上檢測(cè)，隨著亞硫酸氫根的加入，630nm處熒光強(qiáng)度降低，并伴隨著520nm處熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。熒光發(fā)射圖見圖4。

實(shí)施例3

配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的溶液；把10μl(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液加入到2mlpbs–dmso(10mm,ph＝7.4,9:1,v/v)的熒光比色皿中，取30μm亞硫酸氫根溶液，加入上述緩沖溶液當(dāng)中，待體系熒光強(qiáng)度不在發(fā)生變化時(shí)，取100μm過氧化氫溶液，逐漸用微量進(jìn)樣器加到此比色皿中，邊加樣邊在熒光分光光度儀上檢測(cè)，隨著過氧化氫的加入，520nm處熒光強(qiáng)度降低，630nm處熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),體系熒光逐漸恢復(fù)到探針本身的熒光強(qiáng)度。熒光發(fā)射圖見圖5。

實(shí)施例4

配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm的(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物溶液；在21個(gè)熒光比色皿中，各加入2ml的pbs-dmso(9:1，ph7.4)溶液和10μl(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液，再分別加入3摩爾當(dāng)量亞硫酸氫根，以及30摩爾當(dāng)量的各種分析物：cys，hcy，gsh，h2s，cn^-，so4^2-，co3^2-，f^-，cl^-，br^-，i^-，hpo4^2-，h2po4^-，no3^-，scn^-，hco3^-，s2o3^2-，n3^-，aco^-，so3^2-，hso3^-在熒光分光光度儀上檢測(cè)，繪制不同分析物對(duì)應(yīng)的520nm處和630nm處相對(duì)熒光強(qiáng)度比值的柱狀圖，(見圖6)。亞硫酸氫根和亞硫酸根使得(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物在520nm處和630nm的熒光強(qiáng)度明顯變化，其它的分析物基本沒有引起(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物熒光變化。

實(shí)施例4

配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的溶液；把10μl(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液加入到2mlpbs–dmso(10mm,ph＝7.4,9:1,v/v)的熒光比色皿中，逐漸加入亞硫酸氫根溶液的體積為0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30μl，同時(shí)在熒光光譜儀上測(cè)定520nm處與630nm處相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值(i520/i630)為、0.41、0.61、1.23、2.67、4.47、6.96、9.58、11.50、13.53、14.38、14.39，以亞硫酸氫根濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)熒光強(qiáng)度比值(i520/i630)為縱坐標(biāo)繪制圖(見圖7)，得到亞硫酸氫根濃度的工作曲線；線性回歸方程為：f520/f630＝0.71c-3.52，c的單位為10^-6mol/l。

實(shí)施例6

配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的溶液；把10μl(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液加入到2mlpbs–dmso(10mm,ph＝7.4,9:1,v/v)的熒光比色皿中，取nahso3的溶液8μl，用微量進(jìn)樣器加到此比色皿中，同時(shí)在熒光光譜儀上測(cè)定520nm和630nm處熒光強(qiáng)度為200.6和94，520nm處與630nm處相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值(i520/i630)為2.134,通過實(shí)施例4的線性回歸方程，求得c＝7.96×10^-6mol/l10^-6mol/l。偏差為0.5％。見圖8。

實(shí)施例7

用dmso配制2mm的探針dmso溶液；將探針dmso溶液加入mcf-7細(xì)胞培養(yǎng)液中，使得其濃度為10μm，與mcf-7細(xì)胞在37℃下孵育30分鐘。此時(shí)體系在共聚焦顯微鏡紅色通道中顯示處紅色熒光，而綠色通道只有很微弱的綠色熒光。將50μmhso3^-與上述預(yù)處理過的mcf-7細(xì)胞再孵育30分鐘后，此時(shí)體系在共聚焦顯微鏡綠色通道顯示強(qiáng)烈的綠色熒光，而紅色通道的熒光基本消失。對(duì)照組中，將上述50μmhso3^-與10μm探針預(yù)處理過的mcf-7孵育后的體系中再次加入50μm的過氧化氫，30分鐘之后在共聚焦顯微鏡綠色通道熒光明顯減弱，同時(shí)紅色通道熒光增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，探針能夠檢測(cè)活細(xì)胞中外源性的hso3^-，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)過氧化氫與亞硫酸氫根可逆性氧化還原過程監(jiān)測(cè)。圖9為共聚焦顯微鏡下mcf-7細(xì)胞與探針作用后的成像圖(a1，b1，c1,d1)。探針預(yù)處理后的mcf-7細(xì)胞再與外源的亞硫酸氫根作用后的細(xì)胞成像圖(a2，b2，c2,d2)，探針預(yù)處理后的mcf-7細(xì)胞與亞硫酸氫根作用后再次孵育過氧化氫的成像圖(a3，b3，c3,d3)。