牛奶制品中青霉素酶的AlphaLISA檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種牛奶制品中青霉素酶的AlphaLISA檢測試劑盒，其包括青霉素酶標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化青霉素酶、抗青霉素酶單克隆抗體、抗鼠IgG包被受體磁珠、鏈親和素供體磁珠、檢測緩沖液、白色反應(yīng)板、封口膜、操作說明書。其中抗鼠IgG包被受體磁珠包括100ug/mL受體磁珠，0.05%的Proclin-300和PH7.4的PBS溶液，鏈親和素供體磁珠包括100ug/mL供體磁珠，25mM的HEPES、100mM的NaCl溶液和0.05%的Proclin-300。使用本發(fā)明的試劑盒建立了牛奶制品中青霉素酶的AlphaLISA檢測方法，使具有樣品用量少、靈敏度高、不需洗滌、檢測周期短等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】牛奶制品中青霉素酶的AI phaL ISA檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及牛奶制品中的青霉素酶的檢測，具體涉及一種牛奶制品中青霉素酶的AlphaLISA檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]牛乳中抗生素的殘留問題越來越多的引起國際社會的關(guān)注，隨著國家對乳及乳制品抗生素殘留監(jiān)管力度的增加，一些不法商販在牛奶中非法添加青霉素酶，使牛乳在檢測中達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。青霉素酶的過度使用會使人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)，更可能引起抗生素的濫用?，F(xiàn)有的青霉素酶的檢測方法有碘量法、酸度法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、頭孢硝噻吩顯色法以及杯碟法等。但是這些方法都有著諸如操作繁瑣，檢測靈敏度不高等缺點(diǎn)。特別是作為確證方法的杯碟法，操作過程需要進(jìn)行微生物培養(yǎng)，然后將系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品加入牛津杯，檢測時間不少于3?5天，通量性極低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述問題，本發(fā)明通過AlphaLISA檢測方法來檢測牛奶制品中青霉素酶，提供了一種用于檢測牛奶制品中青霉素酶的AlphaLISA檢測試劑盒。
[0004]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:牛奶制品中青霉素酶的AlphaLISA檢測試劑盒，包括青霉素酶標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化青霉素酶、抗鼠IgG包被受體磁珠、鏈親和素供體磁珠、抗青霉素酶單克隆抗體和檢測緩沖液；其中所述抗鼠IgG包被受體磁珠包括100ug/mL受體磁珠(終濃度)、0.05%的Proclin-300和pH7.4的PBS溶液，鏈親和素供體磁珠包括100ug/mL供體磁珠(終濃度)、25mM 的 HEPESUOOmM 的 NaCl 溶液和 0.05% 的 Proclin-300。
[0005]上述試劑盒中所述抗鼠IgG包被受體磁珠為I mg/mL,鏈親和素供體磁珠為I mg/mL,抗青霉素酶單克隆抗體為I mg/mL,生物素化青霉素酶0.5mg/mL。
[0006]使用時，以總體積25uL計(jì):其中抗鼠IgG包被受體磁珠5uL、鏈親和素供體磁珠5uL、抗青霉素酶單克隆抗體5uL、生物素化青霉素酶5uL、待測樣品5uL。
[0007]本發(fā)明的試劑盒封裝時，包括青霉素酶標(biāo)準(zhǔn)品(5000 UI/mL, 100 uL/盒)、生物素化青霉素酶(0.5 mg/mL, 100 uL/盒)、抗青霉素酶單克隆抗體(I mg/mL, 20 uL/盒)、抗鼠IgG包被受體磁珠(I mg/mL, 50 uL/盒)、鏈親和素供體磁珠(I mg/mL, 50 uL/盒)、檢測緩沖液(100 mL/盒)、白色反應(yīng)板(96T，I塊/盒)、封口膜(I塊/盒)、操作說明書(I份/盒)。
[0008]借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少有一下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:利用本發(fā)明檢測牛奶中的青霉素酶，樣品用量少僅使用5uL即可、靈敏度高、不需洗滌、檢測周期短等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為青霉素酶標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖；
圖2為AlphaLISA檢測反應(yīng)過程示意圖；
圖中:1-鏈親和素供體磁珠，2-生物素化青霉素酶，3-抗青霉素酶單克隆抗體，4-青霉素酶，5-抗鼠IgG包被受體磁珠。
【具體實(shí)施方式】
[0010]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0011]試劑盒中的抗青霉素酶單克隆抗體可選用市購的，也可用常規(guī)制備單克隆抗體的方法制備。鏈親和素供體磁珠包括100ug/mL供體磁珠、25mM的HEPESUOOmM的NaCl溶液和0.05%的Proclin-300。檢測緩沖液選用常規(guī)檢測試劑盒中的緩沖液。
[0012]一、抗鼠IgG包被受體磁珠的制備
1.洗滌受體磁珠:取5~5(^1^(2011^/1^)的受體磁珠于1.51^的離心管中，加入5(^1^的 PBS (pH=7.4), 14000r/min 離心 15min,去上清。
[0013]2.偶聯(lián):(400mM 的 NaBH3CN，現(xiàn)配:25mg NaBH3CN+lmL 水)配制如下體系(20 μ L):5 μ L 受體磁珠(20mg/mL) +10 μ L 抗鼠 IgG 抗體(lmg/mL) +IyL NaBH3CN+0.125 μ L 的10%TW20+3.875 μ L 的 HEPES Buffer。
[0014]在37°C條件下,6~10r/min振蕩反應(yīng)18~24h。
[0015]3.封閉:(用800mM的NaOH配制65mg/mL的CMO,現(xiàn)配:5mL ^ 325mg)向管中加入10μ L的CMO Buffer，在37°C條件下，6~10r/min振蕩反應(yīng)lh。
[0016]4.洗滌和保存:在41:條件下，1400017/1^11離心151^11，去上清，然后加入20(^1^的 Tirs-HCl (pH=8.0, IOOmM)。進(jìn)行 10 次超聲振蕩(每次 ls)，在 4°C 條件下，14000r/min離心15min,去上清。加入Tirs-HCl(pH=8.0),進(jìn)行2次超聲振蕩,離心,去上清,加200 μ L的PBS和0.05%的Proclin，渦旋振蕩，超聲振蕩，避光。使用之前再次進(jìn)行渦旋振蕩。
[0017]二、青霉素酶的生物素化 第一步:將青霉素酶進(jìn)行下述凈化:
使用材料，Thermo Zeba Desalt Spin (5mL/ 支),15mL 收集管適合> 7000da 的蛋白，500~2000 μ L樣品量，起始濃度≥20 μ g/mL。
[0018]1.去掉柱子底端封口帽，打開蓋子，將柱子放入15mL的收集管中。
[0019]2.在4°C條件下，1500r/min離心2min，去除保護(hù)液。離心過程中，保持一個方向(向外)。
[0020]3.向 5mL 的柱子中加入 2.5mL 的 I XPBS (ρΗ=7.4)，洗柱，在 4°C條件下，1000r/min離心2min，重復(fù)2~3次。
[0021]4.將柱子放入新的收集管中，去掉蓋子，慢慢將樣品注入樹脂模的中心位置。5mL的柱子的上樣量為500~2000 μ L0
[0022]5.(低體積樣品)為了保證少量樣品的回收，可添加一層超純水或緩沖液到樹脂模上，當(dāng)樣品完全吸收后，可促進(jìn)回收率。5mL的柱子中，若樣品含量< 750 μ L，可添加100 μ L的緩沖液。
[0023]6.在4°C條件下，1000r/min離心2min,收集待測樣品。
[0024]7.濃度測定。
[0025]第二步:對青霉素酶進(jìn)行下述的生物素修飾 使用試劑:Solulink chromalink。[0026]1.利用脫鹽柱，將液體交換成IOOmM磷酸鈉，150mM的NaCl以及MDB(修飾buffer，pH=8.0)。
[0027]2.測定脫鹽蛋白濃度。將MDB調(diào)整到I~2.5mg/mL。
[0028]3.配制DMF (二甲基甲酰胺):1~4mg的link+100 μ L無水DMF，_20°C保存2周。
[0029]4.計(jì)算分子比，加入10~20mol等分的Biolink stock到相應(yīng)的蛋白buffer中，室溫，90min。
[0030]5.脫鹽:交換液體為AphaLISA所需。
[0031]三、青霉素酶的AlphaLISA反應(yīng)條件的摸索
在本試劑盒中，我們采用反向競爭模式。原理如下:首先是待測樣本中的青霉素酶和已知濃度的抗青霉素酶單克隆抗體特異性結(jié)合。然后再加入生物素化青霉素酶競爭結(jié)合游離的抗青霉素酶單克隆抗體，反應(yīng)后加入鏈親合素供體磁珠和抗鼠IgG受體磁珠，反應(yīng)將形成下圖2所示的供體磁珠-生物素化青霉素酶-抗青霉素酶單抗-受體磁珠復(fù)合物，并在680 nm的入射光下發(fā)生熒光共振能力轉(zhuǎn)移(FRET)，單體氧作用到受體磁珠上，同步激發(fā)出615 nm的發(fā)射光。檢測過程均在室溫下完成。[0032]本發(fā)明選擇了經(jīng)杯碟法證明青霉素酶陽性10份陽性牛奶樣品和10份陰性牛奶樣品進(jìn)行條件摸索。
[0033]操作方法:
1.每孔加入5uL生物素化青霉素酶，5uL抗青霉素酶單克隆抗體。
[0034]2.每孔加入5uL青霉素酶標(biāo)準(zhǔn)品或5uL待測樣品，2000r/min離心30sec。
[0035]3.加封口膜，23°C避光反應(yīng)I小時。
[0036]4.每孔加入5uL抗鼠IgG包被受體磁珠。
[0037]5.每孔加入5uL鏈親和素供體磁珠,2000r/min離心30sec。
[0038]6.加封口膜，23°C避光反應(yīng)I小時。
[0039]7.置于Enspire讀板機(jī)上讀數(shù)。
[0040]在25uL反應(yīng)體積下，得到一個較穩(wěn)定的反應(yīng)體系:其中抗鼠IgG包被受體磁珠5uL、鏈親和素供體磁珠5uL、抗青霉素酶單克隆抗體5ul、生物素化青霉素酶5uL、待測樣品5uL0
[0041]四、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
我們將青霉素酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為500 UI/mL,50 UI/mL,5 UI/mL,2.5 Π/mL四個活性單
位梯度。然后按照上述最佳反應(yīng)體系進(jìn)行AlphaLISA檢測，結(jié)果如下:
【權(quán)利要求】
1.牛奶制品中青霉素酶的AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于:包括青霉素酶標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化青霉素酶、抗鼠IgG包被受體磁珠、鏈親和素供體磁珠、抗青霉素酶單克隆抗體和檢測緩沖液；其中所述抗鼠IgG包被受體磁珠包括100ug/mL受體磁珠，0.05%的Proclin-300和PH7.4的PBS溶液，鏈親和素供體磁珠包括100ug/mL供體磁珠，25mM的HEPESUOOmM 的 NaCl 溶液和 0.05% 的 Proclin-300。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述牛奶制品中青霉素酶的AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于:所述抗鼠IgG包被受體磁珠為I mg/mL,鏈親和素供體磁珠為I mg/mL,抗青霉素酶單克隆抗體為I mg/mL,生物素化青霉素酶0.5mg/mL ； 使用時，以總體積25uL計(jì):其中抗鼠IgG包被受體磁珠5uL、鏈親和素供體磁珠5uL、抗青霉素酶單克隆抗體5uL、生物素化青霉素酶5uL、待測樣品5uL。
【文檔編號】G01N33/04GK103529181SQ201310473997
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】王昱, 聶福平, 楊俊 , 李應(yīng)國, 肖進(jìn)文, 袁曾壯, 葉自霞 申請人:重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心