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一種抗手足口病藥物活性檢測方法及其試劑盒的制作方法

文檔序號:9501937閱讀:631來源:國知局
一種抗手足口病藥物活性檢測方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,特別設(shè)及一種抗手足口病藥物活性檢測方法及其試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病是由病毒引起的兒科疾病,屬于我國法定丙類傳染病。0-6歲的嬰幼兒是 該病的易感人群,其中W2-3歲兒童感染最為常見,患兒感染后首先在四肢及口腔等部位 引起瘤疹或潰瘍,多數(shù)患兒給予及時有效治療后可在1-2周內(nèi)痊愈。然而,少數(shù)患兒病情進 展迅速,可在發(fā)病1-5天左右出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和屯、肺感染,具有較高的致死風(fēng)險,存活病 例仍可留有后遺癥。
[0003]根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告,能夠引起手足口病癥狀的病毒大約有20多種,其中W腸道病毒 71 型(enterovirus71,EV71)和柯薩奇病毒A組 16 型(coxsachievirusA16, CoxAie)最為常見,其他能夠引起手足口病的病毒主要包括:柯薩奇病毒A組2、4、5、7、9和 10 型(CoxA2、CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9 和CoxAlO),柯薩奇病毒B組 1-5 型(CoxBl-5) W及??刹《厩蒀HO)等。目前,尚沒有直接祀向病毒的特效藥物或預(yù)防性疫苗,臨床主要 采取對癥治療的策略。運一現(xiàn)狀提示藥物研發(fā)人員仍需要對抗手足口病化合物或組合物深 入研究和篩選。
[0004]手足口相關(guān)病毒的2A蛋白酶和3C蛋白酶常用作做篩選祀點,2A和3C蛋白酶屬 于半脫氨酸蛋白酶,特異識別和切割蛋白質(zhì)谷氨酷胺(Gin)和甘氨酸(Gly)之間的酷胺鍵。 在病毒的生活史中主要參與干擾宿主蛋白合成、促進病毒蛋白原加工與成熟、協(xié)助病毒核 酸復(fù)制W及啟動宿主細胞程序性死亡等??偟膩碚f,2A和3C蛋白酶在手足口病毒的生活史 中具有重要作用,同時也是一個良好的研究祀點。但是目前尚沒有針對該祀點的藥物正式 上市,運暗示了針對該祀點的藥物篩選工作尚需要更新、更靈敏、更可靠的方法。
[0005]現(xiàn)有的手足口病毒蛋白酶抑制劑篩選方法主要有酶偶聯(lián)法、酵母雙雜交法和HPLC測定產(chǎn)物法。其中,酶偶聯(lián)法測定的精確度不高、線性范圍較窄,可重復(fù)性不佳;而酵母雙雜 交法實驗周期長,干擾因素較多;HPLC測定產(chǎn)物法周期比較長、通量小、針對儀器和操作人 員的技術(shù)壁壘比較高。正是因為篩選方法的瓶頸,嚴(yán)重制約了基于此祀點藥物的大規(guī)模、高 通量篩選和發(fā)現(xiàn)。例如,輝瑞公司曾經(jīng)采用酶偶聯(lián)法篩選得到3C蛋白酶抑制劑蘆平曲韋并 進入開發(fā)階段值ragovichetal.,JMed化6111,1999,42:1213 - 1224),后因沒有明顯的臨 床藥效宣告失敗。總之,截止目前,尚沒有基于此祀點的藥物正式獲批上市。因此,有必要 建立快速、精確、干擾因素少的蛋白酶抑制劑篩選方法,從而推動蛋白酶抑制劑類的抗手足 口藥物大量涌現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此,本發(fā)明提供了一種抗手足口病藥物活性檢測方法及其試劑盒。該檢測 方法具有簡單、微量、快速的優(yōu)點,藥物篩選工作量小,實驗快速精確,實驗結(jié)果重復(fù)性好, 可用于抗手足口病藥物的篩選與開發(fā);本法基于蛋光素酶的生物發(fā)光檢測方法,靈敏度高, 干擾因素少,受試品兼容性強。
[0007] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明提供W下技術(shù)方案:
[000引本發(fā)明提供了一種抗手足口病藥物活性檢測方法,包括如下步驟:
[0009] 將編碼Gln-Gly的核巧酸序列插入巧光素酶質(zhì)粒,經(jīng)體外非細胞轉(zhuǎn)錄翻譯獲得含 Gln-Gly的重組巧光素酶;
[0010] 體外重組表達手足口病毒蛋白酶,手足口病毒蛋白酶為2A或3C蛋白酶;
[0011] 手足口病毒蛋白酶與含Gln-Gly的重組巧光素酶、受試物發(fā)生酶促反應(yīng),檢測巧 光素的生物發(fā)光強度,獲得受試物的抗手足口病藥物活性。
[0012] 本發(fā)明檢測方法的基本原理為:巧光素酶質(zhì)粒載入底物對應(yīng)的核巧酸序列后, 通過體外非細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)合成重組蛋光素酶。本發(fā)明中,2A和3C蛋白酶的底物為 Gln-Gly二膚,對應(yīng)的核巧酸序列可為CAAGGU。圖1A示質(zhì)粒中蛋白底物對應(yīng)的核巧酸序列 (CAAGGU)插入位點,質(zhì)粒經(jīng)體外非細胞轉(zhuǎn)錄翻譯后合成重組蛋光素酶。如圖1B所示,蛋光 素酶由于多了Gln-Gly兩個氨基酸殘基,無法形成正確的催化構(gòu)象,導(dǎo)致蛋光素酶不能催 化蛋光素氧化發(fā)光;加入蛋白酶將蛋光素中多余的氨基酸殘基切開后,蛋光素酶折疊形成 正確的催化構(gòu)象,催化蛋光素氧化發(fā)光,因此,蛋光素發(fā)光強度即表征了蛋白酶活力。W受 試物對空白生物發(fā)光強度的抑制作用表征受試物的蛋白酶抑制力。
[0013] 在本發(fā)明提供的一些實施例中,手足口病毒選自柯薩奇病毒A2(CoxA2)、 A4 (CoxA4)、A5 (CoxA5)、A7 (CoxA7)、A9 (CoxA9)、A10 (CoxAlO)、A16 型(CoxAie),柯薩奇病毒 B1 (CoxBl)、B2 (CoxB2)、B3 (CoxB3)、B4 (CoxB4)和B5 (CoxB5)型,腸道病毒 71 型巧V71),W 及埃可病毒巧CHO)。
[0014] 在本發(fā)明提供的一些實施例中,編碼Gln-Gly的核巧酸序列為CAAGGU。根據(jù)密碼 子簡并性,也可W使用其他可W翻譯出Gln-Gly的其他核巧酸序列,如:CAAGGC,CAAGGA, CAAGGG,CAGGGU,CAGGGC,CAGGGA,CAGGGG。
[001引作為優(yōu)選,巧光素酶質(zhì)粒為pGloSensor?-10F質(zhì)粒。
[0016] 作為優(yōu)選,酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系為:
[0017] 含Gln-Gly的重組巧光素酶:1~10μg
[001引手足口病毒蛋白酶: 10~100IU
[0019]受試物: >0ymol/L
[0020] 胎pes緩沖液: 補足至10~200μL。
[0021] 優(yōu)選地,酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系為:
[002引含Gln-Gly的重組巧光素酶:1~10μg
[0023] 手足口病毒蛋白酶: 10~100IU
[0024]受試物: >0ymol/L
[0025]Hepes緩沖液: 補足至100μL
[0026] 在本發(fā)明提供的一些實施例中,酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系為:
[0027] 含Gln-Gly的重組巧光素酶:1μg
[002引手足口病毒蛋白酶: 20IU
[0029]受試物:>0ymol/L
[0030] 胎pes緩沖液:補足至10μL
[0031] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中,酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系為:
[0032] 含Gln-Gly的重組巧光素酶:10μg
[0033] 手足口病毒蛋白酶: 20IU
[0034]受試物: >0ymol/L
[0035] Hepes緩沖液:補足至25μL
[0036] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中,酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系為:
[0037] 含Gln-Gly的重組巧光素酶:2μg
[003引手足口病毒蛋白酶: 50IU
[0039]受試物: >0ymol/L
[0040] Hepes緩沖液:補足至50μL
[0041] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中,酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系為:
[004引含Gln-Gly的重組巧光素酶:5μg
[0043] 手足口病毒蛋白酶: 10IU
[0044]受試物: >0ymol/L
[004引胎pes緩沖液:補足至150 μ L
[0046] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中,酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系為:
[0047] 含Gln-Gly的重組巧光素酶:10μg
[0048] 手足口病毒蛋白酶: 100IU
[0049]受試物: >0ymol/L
[0050] 胎pes緩沖液:補足至200μL
[0051] 作為優(yōu)選,胎pes緩沖液的濃度為10~lOOmM,pH 7. 0~8.0。
[0052] 優(yōu)選地,胎pes緩沖液的濃度為20mM,pH 7. 5。
[0053] 作為優(yōu)選,酶促反應(yīng)的溫度為30°C。
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