一種土壤抗生素污染對(duì)人體健康影響的評(píng)估方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及污染環(huán)境檢測(cè)與健康評(píng)估領(lǐng)域，具體涉及一種土壤抗生素污染對(duì)人體健康影響的評(píng)估方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)和飼料工業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，抗生素被廣泛使用。但是絕大部分抗生素不能完全被機(jī)體吸收，以原形或者代謝物形式排入環(huán)境，經(jīng)不同途徑對(duì)水體和土壤造成污染，進(jìn)而通過(guò)食物鏈危害人類健康。四環(huán)素類抗生素是在世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的抗生素，四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，包括土霉素、金霉素、四環(huán)素及半合成衍生物甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素、二甲胺基四環(huán)素等，其結(jié)構(gòu)均含有并四苯基本骨架。近年來(lái)土霉素被廣泛應(yīng)用于畜禽的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其藥物殘留問(wèn)題日趨嚴(yán)重，排放到環(huán)境中的藥物及其潛在的影響也引起越來(lái)越多的關(guān)注。
[0003]目前對(duì)抗生素的生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)的研究較少，可利用的生態(tài)毒理效應(yīng)數(shù)據(jù)也較少，對(duì)于進(jìn)入食物鏈中的抗生素對(duì)人體危害的風(fēng)險(xiǎn)還不是十分清楚。因此，控制和檢測(cè)抗生素殘留，研究抗生素污染的生態(tài)毒理效應(yīng)是非常必要的。
[0004]申請(qǐng)?zhí)枮?01410764095.4的專利文獻(xiàn)公開了一種土壤抗生素污染的診斷方法，包括以下步驟:(1)將肝細(xì)胞接種到一組抗生素濃度呈梯度分布的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后檢測(cè)培養(yǎng)基中肝細(xì)胞分泌的酶的活性；(2)建立培養(yǎng)基中抗生素濃度與所述酶的活性之間的關(guān)系曲線；(3)將肝細(xì)胞接種到含待測(cè)土壤浸提液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后檢測(cè)相應(yīng)酶的活性，根據(jù)關(guān)系曲線計(jì)算得到待測(cè)土壤中抗生素的濃度；所述酶為乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。利用該方法不僅能檢測(cè)土壤中抗生素的濃度，又能反映土壤中抗生素的生物毒性。
[0005]目前，抗生素污染的診斷方法都是基于土壤安全閾值進(jìn)行的，而對(duì)于評(píng)價(jià)作物可食用部位的抗生素的檢測(cè)方法相對(duì)較少。生物標(biāo)志物法是診斷污染物污染程度和評(píng)估健康風(fēng)險(xiǎn)的一種有效手段，由于快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，體外細(xì)胞通常用來(lái)研究污染物的生物有效性與毒性，且與體內(nèi)細(xì)胞有一定的相關(guān)性，從而明確污染物對(duì)健康的相對(duì)危害情況，因此體外細(xì)胞毒性指標(biāo)可以被用來(lái)評(píng)估土壤-作物可食用部的食物鏈系統(tǒng)抗生素污染帶來(lái)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。目前利用生物標(biāo)志物法研究土壤-農(nóng)作物系統(tǒng)抗生素污染方面還是空白。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種土壤抗生素污染對(duì)人體健康影響的評(píng)估方法，通過(guò)檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性評(píng)估土壤抗生素污染對(duì)人體健康影響。
[0007]—種土壤抗生素污染對(duì)人體健康影響的評(píng)估方法，包括以下步驟:
[0008](1)將小白菜種子放置到抗生素污染的土壤中培養(yǎng)，培養(yǎng)至小白菜長(zhǎng)出可食用部分;
[0009](2)利用體外消化法處理小白菜可食用部分得到消化產(chǎn)物；
[0010](3)將肝細(xì)胞接種到含有消化產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取上清液檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性；
[0011 ] (4)根據(jù)所述谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，評(píng)估土壤抗生素污染對(duì)人體健康影響。
[0012]現(xiàn)有研究證明環(huán)境中抗生素污染通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體進(jìn)而危害人體健康，蔬菜作為人們?nèi)粘ｏ嬍持斜夭豢缮俚氖澄镏?，本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)蔬菜中抗生素對(duì)人體的影響，進(jìn)而評(píng)估土壤抗生素污染對(duì)人體健康的影響。小白菜為蔬菜指示作物品種，是一類主要以鮮嫩的綠葉、葉柄和嫩莖為產(chǎn)品的速生蔬菜，具有生長(zhǎng)期短，采收靈活的特點(diǎn)，故本發(fā)明采用小白菜。
[0013]肝臟是人體最大的解毒器官，90%的抗生素需要肝臟代謝解毒，然后排出體外。當(dāng)抗生素濃度超過(guò)肝臟的解毒能力時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)肝損害，主要臨床表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶升高。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)四環(huán)素和青霉素濃度的增加導(dǎo)致體外細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH、AKP和ALT的活性增加，其中ALT的活性對(duì)于抗生素濃度變化反應(yīng)更為敏感(申請(qǐng)?zhí)枮?01410764095.4的專利文獻(xiàn))。
[0014]谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定常用方法為賴氏(R-F)法和速率法，本發(fā)明選用賴氏比色法檢測(cè)，對(duì)于人體肝細(xì)胞而言，ALT位于肝細(xì)胞漿中，較輕的損傷肝細(xì)胞膜，使其通透性增加，ALT都能從肝細(xì)胞中滲出，它的增加說(shuō)明了肝細(xì)胞產(chǎn)生了一定的損傷，肝細(xì)胞出現(xiàn)異常，進(jìn)而說(shuō)明可以對(duì)人體健康造成一定的危害。
[0015]因此，本發(fā)明采用檢測(cè)肝細(xì)胞分泌的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性來(lái)評(píng)估抗生素污染對(duì)人體健康的影響，檢測(cè)得到的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性數(shù)值越高表明土壤中抗生素污染對(duì)人體健康影響越嚴(yán)重。
[0016]所述小白菜的品種為早熟8號(hào)。該品種具有抗病性強(qiáng)，結(jié)球性好，商品性好，品質(zhì)佳，產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)。由于該小白菜性質(zhì)穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確反應(yīng)土壤中抗生素進(jìn)入食物鏈的情況，而且因?yàn)樗L(zhǎng)周期短，可以節(jié)省人工成本。
[0017]所述抗生素為四環(huán)素類抗生素。四環(huán)素類抗生素是在世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的抗生素，在土壤污染中具備代表性。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素濃度與肝細(xì)胞分泌的酶活性指標(biāo)有顯著的正相關(guān)性和線性回歸關(guān)系。更為優(yōu)選的，所述抗生素為土霉素。
[0018]步驟(1)中，小白菜種子放入土壤培養(yǎng)之前進(jìn)行消毒處理。小白菜種子種入土壤之前先進(jìn)行消毒，有效提高后期小白菜的成活率，保證本發(fā)明評(píng)估結(jié)果的一致性。優(yōu)選的，所述消毒處理為小白菜種子用濃度為0.1?0.3%高錳酸鉀溶液浸泡0.5?lh。高錳酸鉀作為強(qiáng)氧化劑，有殺滅細(xì)菌作用，其殺菌力極強(qiáng)，而且高錳酸鉀溶液配制簡(jiǎn)單，方便操作，需隨配隨用。
[0019]步驟⑴中，小白菜的培養(yǎng)時(shí)間不少于15天。將預(yù)處理后的小白菜種子均勻放入鋪有待檢土壤的培養(yǎng)皿中，放入20?25°C培養(yǎng)箱，避光培養(yǎng)，期間添加去離子水保持土壤濕潤(rùn)。培養(yǎng)3?5d后，轉(zhuǎn)入人工氣候室培養(yǎng)15天以上收獲，期間每天添加去離子水，人工氣候室培養(yǎng)條件為:白天溫度22?25°C，夜間溫度20?23°C，光照/黑暗時(shí)間14h/10h。
[0020]所述肝細(xì)胞為人體肝細(xì)胞HL-7702。采用人體肝細(xì)胞HL-7702的酶的活性作為檢測(cè)抗生素的指標(biāo)，可以評(píng)估抗生素對(duì)人體的毒性。
[0021]所述培養(yǎng)基為無(wú)血清的DEME培養(yǎng)基。本發(fā)明檢測(cè)的是谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，為了避免培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)的影響，選擇無(wú)血清的DEME培養(yǎng)基。
[0022]肝細(xì)胞的接種密度約為4X 105?6X 10 5個(gè)/mL。細(xì)胞培養(yǎng)最好保證單層，細(xì)胞數(shù)目過(guò)多或過(guò)少會(huì)造成較大的誤差。更為優(yōu)選的，肝細(xì)胞的接種密度約為4X 105個(gè)/mL。
[0023]步驟(3)中，培養(yǎng)基中消化產(chǎn)物的含量為10%?20%。單純的消化液會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境改變而死亡，用DMEM培養(yǎng)基稀釋是為了保持與之前的培養(yǎng)環(huán)境一致，避免細(xì)胞因環(huán)境改變過(guò)大而死亡。更為優(yōu)選的，培養(yǎng)基中消化產(chǎn)物的含量為10%。
[0024]步驟(3)中，細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間不少于2小時(shí)。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備的有