一種檢測端粒酶活性的探針、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測端粒酶活性的探針、試劑盒以及方法。本發(fā)明提供的端粒酶結(jié)合引物（TS）和反向引物設(shè)計(jì)簡單，TS只需包括DNA酶的序列以及切刻酶的酶切位點(diǎn)，不需要任何的修飾；反向引物只需包括與端粒酶延伸的多G序列互補(bǔ)的序列，這使得引物易于設(shè)計(jì)，可行性強(qiáng)。本發(fā)明的檢測端粒酶活性的方法，反向引物只結(jié)合結(jié)果端粒酶延伸的TS引物，減少了非特異性擴(kuò)增，而且在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，只有擴(kuò)增出來的端粒酶多G序列和DNA酶可與hemin結(jié)合形成四聚體，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，因此，本發(fā)明提供的檢測端粒酶活性的方法特異性和靈敏度較高。此外，本發(fā)明提供的檢測端粒酶活性的試劑盒成本低、操作簡單、省時(shí)。
【專利說明】一種檢測端粒酶活性的探針、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測端粒酶活性的探針、試劑盒及方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]高靈敏地檢測端粒酶活性對于癌癥等相關(guān)疾病的早期診斷和藥物篩選有重要的意義。傳統(tǒng)檢測端粒酶活性的技術(shù)主要是建立在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)基礎(chǔ)上的對端粒酶重復(fù)片段(TTAGGG)進(jìn)行擴(kuò)增(TRAP)來檢測端粒酶活性，但是這些方法耗時(shí)、操作繁瑣，且特異性不好。為了克服基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法的缺點(diǎn)，近年來也發(fā)展出了一些不需要聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的檢測方法，如光纖敏感器，表面等離子共振技術(shù)，熒光，電化學(xué)等，但這些方法存在檢測靈敏度低、操作繁瑣、耗時(shí)或需將端粒酶結(jié)合引物固定在特別的支持物上的缺點(diǎn)。[0003]因此，有必要提供一種簡單易行、且能快速、高靈敏地檢測端粒酶活性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問題，本發(fā)明第一方面提供了一種檢測端粒酶活性的探針。本發(fā)明第二方面提供了一種檢測端粒酶活性的試劑盒。本發(fā)明第三方面提供了一種檢測端粒酶活性的方法。本發(fā)明提供的檢測端粒酶活性的探針不需要任何的標(biāo)記和修飾，本發(fā)明提供的檢測端粒酶活性的試劑盒采用的試劑成本低，本發(fā)明提供的檢測端粒酶活性的方法具有很高的靈敏度和特異性，本發(fā)明提供的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的端粒酶活性的檢測探針、檢測試劑盒和檢測方法在疾病早期診斷和藥物篩選方面具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
[0005]第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測端粒酶活性的探針，所述檢測探針包括端粒酶結(jié)合引物和反向引物，所述端粒酶結(jié)合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均為核苷酸序列，所述A的核苷酸序列為在C的核苷酸序列中加入切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的兩端具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，
[0006]所述核苷酸序列A中，距離A的5’端的15~24個(gè)堿基處具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)；
[0007]所述核苷酸序列C具有被端粒酶識別的序列；
[0008]所述反向引物具有與(TTAGGG)n互補(bǔ)的序列，其中，η為6~10的自然數(shù)，所述反向弓丨物與所述端粒酶結(jié)合引物不互補(bǔ)。
[0009]優(yōu)選地，所述DNA酶序列為如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0010]具體地，所述SEQ ID NO: 1 為 PW17 序列，即 GGGTAGGGCGGGTTGGG ；
[0011 ]所述 SEQ ID NO: 2 為 T30695 序列，即 GGGTGGGTGGGTGGGT ；
[0012]所述SEQ ID NO: 3 為 PS2.Μ 序列，即 GTGGGTAGGGCGGGTTGG ；
[0013]所述SEQ ID NO: 4 為 PS5.Μ 序列，即 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG ；[0014]所述SEQ ID NO:5 為 AGR0100 序列，
[0015]即GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。
[0016]可形成分子內(nèi)平行型G-四聯(lián)體，該G-四聯(lián)體可與氯高鐵血紅素(hemin)結(jié)合形成血紅素-G四聚體，該血紅素-G四聚體是一種DNA過氧化物酶，具有過氧化物酶的催化作用，其在3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)和過氧化氫存在條件下，可催化魯米諾發(fā)生氧化反應(yīng)并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號；此外，除魯米諾外，還可催化其他氧化還原發(fā)光底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，如3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)、N，N 二甲基二吖啶硝酸鹽(光澤精)、2，4，5-三苯基咪唑(洛粉堿)、3，4，5-三羥基苯甲酸(沒食子酸)或雙(2，4，6-三氯苯基)草酸鹽(過氧草酸鹽)。
[0017]此外，端粒酶在端粒酶結(jié)合引物的3'端不斷添加多G重復(fù)序列(TTAGGG)，該多G重復(fù)序列也能形成分子內(nèi)平行型G-四聯(lián)體，該G-四聯(lián)體可與氯高鐵血紅素(hemin)結(jié)合形成血紅素-G四聚體，該血紅素-G四聚體是一種DNA過氧化物酶，也具有過氧化物酶的催化作用，能進(jìn)一步放大化學(xué)發(fā)光信號。
[0018]優(yōu)選地，所述DNA酶序列兩端的切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQ1、Nb.Bsm1、Nt.Alwl或Nt.BstNBI 切刻酶。
[0019]優(yōu)選地，所述C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。具體地，所述SEQ ID NO:6為AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT。
[0020]優(yōu)選地，在所述C的核苷酸序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的識別位點(diǎn)后得到所述A的核苷酸序列。
[0021]在此優(yōu)選條件下，所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
[0022]具體地，所述SEQID NO:7為AAA CCT ACA ATC CGT GGA AGA GCCGAG CAG AGT T。
[0023]其中，下劃線表示的部分為C的序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的識別位點(diǎn)。
[0024]本發(fā)明提供的端粒酶結(jié)合引物(TS)含有三個(gè)切刻內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。在有端粒酶存在時(shí)，端粒酶可在端粒酶結(jié)合引物(TS)的3'端不斷添加多G重復(fù)序列(TTAGGG)，反向引物(RS)能與多G重復(fù)序列(TTAGGG)結(jié)合，并進(jìn)行復(fù)制延伸，從而形成雙鏈，此時(shí)內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)產(chǎn)生，在切刻內(nèi)切酶的不斷酶切的作用下和聚合酶的鏈置換復(fù)制作用下，該雙鏈DNA會產(chǎn)生引物、DNA酶和端粒酶多G重復(fù)序列片段；而產(chǎn)生的引物又可與多余的端粒酶結(jié)合引物(TS)相結(jié)合，從而誘發(fā)整個(gè)反應(yīng)的指數(shù)擴(kuò)增，不斷產(chǎn)生更多的引物、DNA酶和端粒酶多G重復(fù)序列。產(chǎn)物DNA酶和端粒酶多G重復(fù)序列能與氯高鐵血紅素(hemin)結(jié)合形成四聚體，在過氧化物酶檢測試劑存在時(shí)，該復(fù)合物能夠催化底物進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。
[0025]本發(fā)明提供檢測端粒酶活性的探針不需要任何的修飾、價(jià)格低廉、且設(shè)計(jì)簡單。
[0026]優(yōu)選地，所述端粒酶結(jié)合引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0027]優(yōu)選地，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0028]第二方面，本發(fā)明 提供了檢測端粒酶活性的試劑盒，包括:
[0029]端粒酶檢測試劑，及
[0030]DNA酶檢測試劑，
[0031]其中，所述端粒酶檢測試劑包括端粒酶結(jié)合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻內(nèi)切酶及端粒酶檢測緩沖液，所述DNA酶檢測試劑包括氯高鐵血紅素以及DNA過氧化物酶檢測試劑；
[0032]所述檢測探針包括端粒酶結(jié)合引物和反向引物，所述端粒酶結(jié)合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均為核苷酸序列，所述A的核苷酸序列為在C的核苷酸序列中加入切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的兩端具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，
[0033]所述核苷酸序列A中，距離A的5’端的15~24個(gè)堿基處具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)；
[0034]所述核苷酸序列C具有被端粒酶識別的序列；
[0035]所述反向引物具有與(TTAGGG)η互補(bǔ)的序列，其中，η為6~10的自然數(shù)，所述反向弓丨物與所述端粒酶結(jié)合引物不互補(bǔ)。
[0036]優(yōu)選地，所述DNA酶序列為如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0037]具體地，所述SEQ ID NO: 1 為 PW17 序列，即 GGGTAGGGCGGGTTGGG ；
[0038]所述SEQ ID NO:2 為 T30695 序列，即 GGGTGGGTGGGTGGGT ；
[0039]所述SEQ ID NO: 3 為 PS2.Μ 序列，即 GTGGGTAGGGCGGGTTGG ；
[0040]所述SEQ ID NO:4 為 PS5.Μ 序列，即 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG ；
[0041]所述SEQ ID NO:5 % AGR0100 序列，
[0042]即GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。
[0043]優(yōu)選地，所述DNA酶序列兩端的切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQ1、Nb.Bsm1、Nt.Alwl或Nt.BstNBI 切刻酶。
[0044]優(yōu)選地，所述DNA聚合酶為Bst2.0熱啟動DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、或Vent(exo_ ) DNA 聚合酶。
[0045]優(yōu)選地，所述C的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0046]具體地，所述SEQ ID NO:6 為 AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT。
[0047]優(yōu)選地，在所述C的核苷酸序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的識別位點(diǎn)后得到所述A的核苷酸序列。
[0048]在此優(yōu)選條件下，所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
[0049]具體地，所述SEQID NO:7為AAA CCT ACA ATC CGT GGA AGA GCCGAG CAG AGT T。
[0050]其中，下劃線表示的部分為C的序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的識別位點(diǎn)。
[0051]優(yōu)選地，所述端粒酶結(jié)合引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0052]優(yōu)選地，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0053]優(yōu)選地，所述端粒酶檢測緩沖液包括30毫摩爾每升的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(PH8.3)、3毫摩爾每升的氯化鎂、70毫摩爾每升的氯化鉀、1毫摩爾每升的乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.05%的吐溫20、200毫摩爾每升的dNTPs(四種脫氧核糖核苷酸的混合物)。
[0054]在此優(yōu)選情況下， 所述端粒酶檢測試劑中端粒酶結(jié)合引物的濃度為100納摩爾每升，反向引物的濃度為50納摩爾每升，DNA聚合酶的濃度為1個(gè)單位每20微升，切刻內(nèi)切酶的濃度為5個(gè)單位每20微升，采用所述端粒酶檢測試劑進(jìn)行反應(yīng)的方式優(yōu)選為:取體積比為1~2:19的待測端粒酶樣品和端粒酶檢測試劑混合，先在30~40°C下孵育8~15分鐘，然后在50~60°C下孵育15~30分鐘。
[0055]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述DNA聚合酶為Bst2.0熱啟動DNA聚合酶。
[0056]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQI切刻酶。
[0057]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述端粒酶檢測試劑進(jìn)行反應(yīng)的方式中，所述反應(yīng)條件為:先在37°C下孵育10分鐘，然后在55°C下孵育20分鐘。
[0058]優(yōu)選地，所述DNA過氧化物酶檢測試劑包括魯米諾、光澤精、洛粉堿、沒食子酸或
過氧草酸鹽。
[0059]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述DNA過氧化物酶檢測試劑還包括:105微升含有0.5毫摩爾每升的魯米諾、15微升的去離子水、75微升2XHEPES緩沖液(40毫摩爾每升的HEPES、600毫摩爾氯化鈉、PH8.0)。
[0060]在此優(yōu)選條件下，所述DNA酶檢測試劑中的氯高鐵血紅素(hemin)優(yōu)選為75納摩爾每升，采用所述DNA酶檢測試劑進(jìn)行檢測的方式優(yōu)選為:將15微升的擴(kuò)增產(chǎn)物(與擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行的有切刻內(nèi)切酶酶切反應(yīng))加入到105微升的所述DNA酶檢測試劑中得到混合物，將混合物放入GloMax96微型板塊光度計(jì)檢測化學(xué)發(fā)光的信號，使用自動加樣的程序加入過氧化氫，時(shí)間間隔設(shè)置為1.5秒，得到化學(xué)發(fā)光信號。
[0061]本發(fā)明第三方面提供了一種檢測端粒酶活性的方法，包括如下步驟:
[0062]1)提供端粒酶檢測試劑，及
[0063]DNA酶檢測試劑，
[0064]其中，所述端粒酶檢測試劑包括端粒酶結(jié)合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻內(nèi)切酶及端粒酶檢測緩沖液，所述DNA酶檢測試劑包括氯高鐵血紅素以及DNA過氧化物酶檢測試劑；
[0065]所述檢測探針包括端粒酶結(jié)合引物和反向引物，所述端粒酶結(jié)合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均為核苷酸序列，所述A的核苷酸序列為在C的核苷酸序列中加入切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的兩端具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，
[0066]所述核苷酸序列A中，距離A的5’端的15~24個(gè)堿基處具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)；
[0067]所述核苷酸序列C具有被端粒酶識別的序列；
[0068]所述反向引物具有與(TTAGGG)η互補(bǔ)的序列，其中，η為6~10的自然數(shù)，所述反向引物與所述端粒酶結(jié)合引物不互補(bǔ)；及
[0069]2)取待測端粒酶樣品，加入所述端粒酶檢測試劑進(jìn)行兩步恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，得到含所述DNA酶的產(chǎn)物；及
[0070]3)取所得含DNA酶的產(chǎn)物加入DNA酶檢測試劑，并檢測化學(xué)發(fā)光信號。
[0071]優(yōu)選地，所述DNA酶序列為如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0072]具體地，所述SEQ ID NO: 1 為 PW17 序列，即 GGGTAGGGCGGGTTGGG ；
[0073]所述SEQ ID NO:2 為 T30695 序列，即 GGGTGGGTGGGTGGGT ；
[0074]所述SEQ ID NO: 3 為 PS2.Μ 序列，即 GTGGGTAGGGCGGGTTGG ；
[0075]所述SEQ ID NO:4 為 PS5.Μ 序列，即 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG ；[0076]所述SEQ ID NO:5 為 AGR0100 序列，
[0077]即GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。
[0078]優(yōu)選地，所述DNA酶序列兩端的切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQ1、Nb.BsmI, Nt.Alwl或Nt.BstNBI 切刻酶。
[0079]優(yōu)選地，所述DNA聚合酶為Bst2.0熱啟動DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、或Vent(exo_ ) DNA 聚合酶。
[0080]優(yōu)選地，所述C的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0081]具體地，所述SEQ ID NO:6 為 AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT。
[0082]優(yōu)選地，在所述C的核苷酸序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的識別位點(diǎn)后得到所述A的核苷酸序列。
[0083]在此優(yōu)選條件下，所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
[0084]具體地，所述SEQID NO:7為AAA CCT ACA ATC CGT GGA AGA GCCGAG CAG AGT T。
[0085]其中，下劃線表示的部分為C的序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的識別位點(diǎn)。
[0086]優(yōu)選地，所述端粒酶結(jié)合引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0087]優(yōu)選地， 所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0088]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述兩步恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為:先在30~40°C下孵育8~15分鐘，然后在50~60°C下孵育15~30分鐘。
[0089]優(yōu)選地，所述端粒酶檢測緩沖液包括30毫摩爾每升的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(PH8.3)、3毫摩爾每升的氯化鎂、70毫摩爾每升的氯化鉀、1毫摩爾每升的乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.05%的吐溫20、200毫摩爾每升的dNTPs(四種脫氧核糖核苷酸的混合物)。
[0090]在此優(yōu)選情況下，所述端粒酶檢測試劑中端粒酶結(jié)合引物的濃度為100納摩爾每升，反向引物的濃度為50納摩爾每升，DNA聚合酶的濃度為1個(gè)單位每20微升，切刻內(nèi)切酶的濃度為5個(gè)單位每20微升，采用所述端粒酶檢測試劑進(jìn)行反應(yīng)的方式優(yōu)選為:取體積比為1~2:19的待測端粒酶樣品和所端粒酶檢測試劑混合，先在30~40°C下孵育8~15分鐘，然后在50~60°C下孵育15~30分鐘。
[0091]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述DNA聚合酶為Bst2.0熱啟動DNA聚合酶。
[0092]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQI切刻酶。
[0093]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述采用所述端粒酶檢測試劑進(jìn)行反應(yīng)的方式中，所述反應(yīng)條件為:先在37°C下孵育10分鐘，然后在55°C下孵育20分鐘。
[0094]優(yōu)選地，所述DNA過氧化物酶檢測試劑包括氧化還原底物，所述氧化還原底物為魯米諾、光澤精、洛粉堿、沒食子酸或過氧草酸鹽；其中，氧化還原底物的濃度為0.5毫摩爾每升。
[0095]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述DNA過氧化物酶檢測試劑還包括:15微升的去離子水、75微升2XHEPES緩沖液(40毫摩爾每升的HEPES、600毫摩爾氯化鈉、pH8.0)。
[0096]在此優(yōu)選條件下，所述DNA酶檢測試劑中的氯高鐵血紅素(hemin)優(yōu)選為75納摩爾每升，采用所述DNA酶檢測試劑進(jìn)行檢測的方式優(yōu)選為:將15微升的擴(kuò)增產(chǎn)物(與擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行的有切刻內(nèi)切酶酶切反應(yīng))加入到105微升的所述DNA酶檢測試劑中得到混合物，將混合物放入GloMax96微型板塊光度計(jì)檢測化學(xué)發(fā)光的信號，使用自動加樣的程序加入過氧化氫，時(shí)間間隔設(shè)置為1.5秒，得到化學(xué)發(fā)光信號。
[0097]本發(fā)明提供的檢測端粒酶活性的方法主要分為三步:(1)端粒酶的延伸；(2)端粒酶介導(dǎo)的兩步恒溫?cái)U(kuò)增；(3)化學(xué)發(fā)光檢測。首先構(gòu)建了一個(gè)含有切刻內(nèi)切酶位點(diǎn)的端粒酶結(jié)合引物(TS)，有端粒酶存在時(shí)，端粒酶會在TS的3'端不斷添加多G序列(TTAGGG)。因此反向引物(RP)就會與添加的多G序列(TTAGGG)進(jìn)行結(jié)合，并開始復(fù)制，形成雙鏈后，新的擴(kuò)增模板和內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)形成，剪切，聚合酶以新的擴(kuò)增模板進(jìn)行鏈置換復(fù)制，從而產(chǎn)生端粒酶延伸產(chǎn)物-多G序列(TTAGGG)，DNA酶以及引發(fā)指數(shù)擴(kuò)增的引物(trigger)。而產(chǎn)生的引物可引發(fā)指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生更多的端粒酶多G序列、DNA酶和引物，如此循環(huán)往復(fù),就會產(chǎn)生大量的端粒酶多G序列和DNA酶。端粒酶多G序列和DNA酶能與氯高鐵血紅素(hemin)結(jié)合形成血紅素多G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，在魯米諾等氧化還原底物和過氧化氫存在條件下，發(fā)生化學(xué)發(fā)光，從而檢測光信號。
[0098]本發(fā)明提供的檢測端粒酶活性的方法不需要標(biāo)記、低成本、快速、簡單、靈敏，并且特異性好。
[0099]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的檢測端粒酶活性的方法的能在30分鐘內(nèi)完成端粒酶活性的檢測。
[0100]本發(fā)明提供檢測端粒酶活性的探針、檢測端粒酶活性的試劑盒及檢測端粒酶活性的方法具有如下有益效果:
[0101]1.端粒酶結(jié)合引物(TS)設(shè)計(jì)簡單。本發(fā)明提供的端粒酶結(jié)合引物只需包括DNA酶的序列以及切刻酶的酶切位點(diǎn)，不需要任何的修飾；反向引物只需包括與端粒酶延伸的多G序列互補(bǔ)的序列，這使得引物易于設(shè)計(jì)，可行性強(qiáng)。
[0102]2.特異性高。本發(fā)明的技術(shù)方案中的兩步恒溫?cái)U(kuò)增過程中，采用本說明提供的錯(cuò)配的反向引物(如SEQ ID NO:9所示)與端粒酶延伸的TS引物結(jié)合，減少了非特異性擴(kuò)增，而且在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，只有擴(kuò)增出來的端粒酶多G序列和DNA酶可與hemin結(jié)合形成四聚體，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，因此，本發(fā)明提供的檢測端粒酶活性的方法的特異性較高。
[0103]3.靈敏度高。本發(fā)明的技術(shù)方案將端粒酶誘導(dǎo)的恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的高效率與化學(xué)發(fā)光信號顯著增強(qiáng)的兩種優(yōu)勢串聯(lián)起來，極大地提高了檢測靈敏度。
[0104]4.成本低?；瘜W(xué)發(fā)光具有靈敏度高和線性范圍廣的特點(diǎn)，而且價(jià)格低廉，在生物醫(yī)學(xué)研究和疾病診斷方面具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
[0105]5.操作簡單、省時(shí):由于本發(fā)明的技術(shù)方案中的擴(kuò)增反應(yīng)是恒溫?cái)U(kuò)增，因而不涉及控溫；而且該反應(yīng)是在一管中進(jìn)行反應(yīng)后直接測化學(xué)發(fā)光信號的，因而不涉及分離、洗滌步驟。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0106]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的端粒酶結(jié)合引物結(jié)構(gòu)示意圖；
[0107]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2提供的檢測端粒酶活性的方法流程圖；
[0108]圖3~圖5為本發(fā)明實(shí)施例2提供的TCP8樣品的檢測結(jié)果；
[0109]圖6~圖9為本發(fā)明實(shí)施例2提供的細(xì)胞提取物樣品的檢測結(jié)果；
·[0110]圖10為本發(fā)明對比實(shí)施例提供的樣品的化學(xué)發(fā)光信號檢測結(jié)果?！揪唧w實(shí)施方式】
[0111]下述實(shí)施例中所用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J., Russell, David ff., MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由寶生物工程大連有限公司合成。
[0112]實(shí)施例1
[0113]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的端粒酶結(jié)合引物的結(jié)構(gòu)示意圖，該端粒酶結(jié)合引物依次包括A、B、C。其中，所述A的核苷酸序列為在C的核苷酸序列中加入切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的兩端具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)(如圖中X’所示)，所述核苷酸序列A中，距離A的5’端的15~24個(gè)堿基處具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)(如圖中X所示)；所述核苷酸序列C具有被端粒酶識別的序列；
[0114]結(jié)合圖1，本實(shí)施例提供了一種檢測端粒酶活性的引物，包括如下步驟:
[0115](1)體外合成端粒酶結(jié)合引物(TS)，核苷酸序列(5’端到3’)如SEQ ID N0:8所示；
[0116](2)根據(jù)TS的序列以及多G序列(TTAGGG)設(shè)計(jì)反向引物(RP)，所述RP的核苷酸序列(5，端到3，)如SEQ ID N0:9所示；
[0117](3)根據(jù)TS的序列以及多G序列(TTAGGG)設(shè)計(jì)端粒酶產(chǎn)物(TPC8)，所述TPC8的核苷酸序列(5，端到3’)如SEQ ID NO: 10所示；
[0118]具體地，所述TS、RP和TPC8的核苷酸序列如下表1所示:
[0119]表1.TS、RP和TPC8的核苷酸序列
[0120]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測端粒酶活性的探針，其特征在于，所述檢測探針包括端粒酶結(jié)合引物和反向引物，所述端粒酶結(jié)合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均為核苷酸序列，所述A的核苷酸序列為在C的核苷酸序列中加入切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的兩端具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，所述核苷酸序列A中，距離A的5’端的15~24個(gè)堿基處為切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)；所述核苷酸序列C具有被端粒酶識別的序列；所述反向引物具有與(TTAGGG)n互補(bǔ)的序列，其中，η為5~10的自然數(shù)，所述反向引物與所述端粒酶結(jié)合引物不互補(bǔ)。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測端粒酶活性的探針，其特征在于，所述DNA酶序列為如SEQID NO: 1~SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測端粒酶活性的探針，其特征在于，所述DNA酶序列兩端的切刻內(nèi)切酶為 Nt.BspQ1、Nb.Bsm1、Nt.Alwl 或 Nt.BstNBI 切刻酶。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測端粒酶活性的探針，其特征在于，所述A或C的核苷酸序列如 SEQ ID NO:6 所示。
5.一種檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于，包括:端粒酶檢測試劑，及DNA酶檢測試劑，其中，所述端粒酶檢測試劑包`括端粒酶結(jié)合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻內(nèi)切酶及端粒酶檢測緩沖液，所述DNA酶檢測試劑包括氯高鐵血紅素以及DNA過氧化物酶檢測試劑；所述檢測探針包括端粒酶結(jié)合引物和反向引物，所述端粒酶結(jié)合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均為核苷酸序列，所述A的核苷酸序列為在C的核苷酸序列中加入切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的兩端具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，所述核苷酸序列A中，距離A的5’端的15~24個(gè)堿基處具有切刻內(nèi)切酶的識別位占.所述核苷酸序列C具有被端粒酶識別的序列；所述反向弓丨物具有與(TTAGGG)η互補(bǔ)的序列，其中，η為6~10的自然數(shù)，所述反向弓丨物與所述端粒酶結(jié)合引物不互補(bǔ)。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于，所述DNA酶序列為如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求5所述的檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為Bst2.0熱啟動DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、或Vent excTDNA聚合酶；所述DNA酶序列兩端的切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQ1、Nb.Bsm1、Nt.Alwl或Nt.BstNBI切刻內(nèi)切酶。
8.如權(quán)利要求5所述的檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于，所述A或C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
9.如權(quán)利要求5所述的檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于，所述DNA過氧化物酶檢測試劑包括3-氨基鄰苯二甲酰肼、N，N二甲基二吖啶硝酸鹽、2，4，5-三苯基咪唑、3，4，5_三羥基苯甲酸或雙(2，4，6-三氯苯基)草酸鹽(過氧草酸鹽)。
10.一種檢測端粒酶活性的方法，其特征在于，包括如下步驟:1)提供端粒酶檢測試劑，及DNA酶檢測試劑，其中，所述端粒酶檢測試劑包括端粒酶結(jié)合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻內(nèi)切酶及端粒酶檢測緩沖液，所述DNA酶檢測試劑包括氯高鐵血紅素以及DNA過氧化物酶檢測試劑；所述檢測探針包括端粒酶結(jié)合引物和反向引物，所述端粒酶結(jié)合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均為核苷酸序列，所述A的核苷酸序列為在C的核苷酸序列中加入切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的兩端具有切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，所述核苷酸序列C具有被端粒酶識別的序列；所述核苷酸序列A中，距離A的5’端的15~24個(gè)堿基處具有切刻內(nèi)切酶的識別位占.所述反向弓丨物具有與(TTAGGG)η互補(bǔ)的序列，其中，η為6~10的自然數(shù)，所述反向弓丨物與所述端粒酶結(jié)合引物不互補(bǔ)；及2)取待測端粒酶樣品，加入所述端粒酶檢測試劑進(jìn)行兩步恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，得到含所述DNA酶的產(chǎn)物；及3)取所得含DNA酶 的產(chǎn)物加入DNA酶檢測試劑，并檢測化學(xué)發(fā)光信號。
11.如權(quán)利要求10所述的檢測端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述兩步恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為:先在30~40°C下孵育8~15分鐘，然后在50~60°C下孵育15~30分鐘。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667513SQ201310746446
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】王黎娟, 張春陽, 張艷 申請人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院