專利名稱：一種端粒酶活性定量檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種端粒酶活性的定量檢測技術(shù)及應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行端粒酶活性檢測的試劑盒。屬于體外生物醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，癌癥已經(jīng)成為了人類健康的第一殺手，采用基因?qū)W方法對癌癥進(jìn)行早期診斷并對腫瘤的惡性程度及早地做出準(zhǔn)確的判斷，無論是對癌癥的預(yù)防還是治療都具有十分重要的意義。
端粒酶是存在于腫瘤細(xì)胞中的一種專一性逆轉(zhuǎn)錄酶，它能以自身的RNA亞單位為模板，在蛋白亞單位逆轉(zhuǎn)錄酶的推動下把端粒重復(fù)序列(5′-(GGTTAG)n-3′)加入到線性染色體的末端，維持端粒長度和穩(wěn)定性，使細(xì)胞得以永生。愈來愈多的研究表明，端粒酶的活性分析可用于癌癥的早期診斷及惡性程度判斷。
目前，端粒酶活性的檢測研究已成為國際上的研究熱點(diǎn)，并已有多種方法見諸報道。在這些方法中，以Kim等人于1994年建立了的端粒重復(fù)擴(kuò)增法(Telomeric repeat amplificationprotocol，TRAP)最為引人注目，該法巧妙地將PCR技術(shù)應(yīng)用于的端粒酶活性檢測，極大地提高了檢測的靈敏度。在此基礎(chǔ)上，人們不斷進(jìn)行改良，提出了一系列端粒酶活性檢測的新方法。這些檢測方法包括TRAP引物改良法、親合閃爍分析-TRAP法、TRAP-酶聯(lián)免疫吸附分析法、雜交保護(hù)分析-TRAP法、比色雜交分析-TRAP法等。但就這些方法而言，都存在著一定的缺陷與不足，這就為它們在臨床上的應(yīng)用推廣設(shè)置了一定的障礙。這些缺陷主要集中表現(xiàn)在以下兩個方面(1)PCR擴(kuò)增完成以后，需要繁瑣的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測步驟。這些檢測方法不僅操作繁瑣、耗時長，不適用于樣品的大批量檢測研究，而且容易造成產(chǎn)物的交叉污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。(2)需要放射性同位素標(biāo)記。若操作不當(dāng)，不僅會對實(shí)驗(yàn)人員造成傷害，且容易污染環(huán)境。同時，只能進(jìn)行定性及半定量分析，無法達(dá)到定量檢測的需求。實(shí)時定量TRAP法的出現(xiàn)有效地克服了上述缺陷，但就目前用于端粒酶檢測的兩種實(shí)時定量方法(SYBRGreen法及Amplifluor法)而言，它們所存在的一個共同缺陷就是檢測特異性較差，PCR引物二倍體及其它非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的生成都會造成背景熒光信號的產(chǎn)生而導(dǎo)致檢測靈敏度不高。這就在一定程度上限制了這兩種實(shí)時定量檢測方法在臨床診斷上的應(yīng)用。因此，開發(fā)高度特異性診斷技術(shù)，進(jìn)行端粒酶活性的快速、有效和高度自動化的定量檢測勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物特異性的分子信標(biāo)探針引入到了端粒酶的PCR檢測體系當(dāng)中，利用分子信標(biāo)探針對端粒重復(fù)序列的專一性識別作用，來提高檢測的特異性，有效地解決了上述問題。且為實(shí)現(xiàn)分子信標(biāo)探針的順利引入采用了一種獨(dú)特的PCR擴(kuò)增策略，即在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上，同時使用了兩種逆向引物1和2，且對逆向引物1的3′-端進(jìn)行修飾，使其喪失在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的延伸能力，避免了該逆向引物在PCR擴(kuò)增中參與引物二倍體及其他非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。
本發(fā)明的目的是提供一種新的端粒酶活性定量檢測技術(shù)，它改善了端粒酶活性PCR檢測的靈敏度和特異性，可進(jìn)行大批量樣品的同時檢測。
本發(fā)明端粒酶活性定量檢測方法，包括(1)從待測樣品中提取活性端粒酶。
(2)在PCR體系中，將提取的端粒酶作用于特定的底物，得到攜帶有端粒重復(fù)序列的端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物。
(3)使用一個PCR正向引物和逆向引物1和2，對得到的端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將分子信標(biāo)探針引入到端粒酶的PCR檢測體系中。
(4)在PCR擴(kuò)增的同時，通過監(jiān)測引入的分子信標(biāo)探針?biāo)a(chǎn)生的熒光信號用以對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
所述分子信標(biāo)探針是以端粒重復(fù)序列或其互補(bǔ)序列為作用靶點(diǎn)，其序列的總長度最好為15至50個核苷酸。
所述逆向引物1的3′-端或靠近3′-端的位置包含有與端粒重復(fù)序列互補(bǔ)的核苷酸序列；5′-端或靠近5′-端的位置包含有與逆向引物2或逆向引物2的3′-端相同或相似的核苷酸序列；且逆向引物1的3′-端經(jīng)過修飾，喪失了在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的延伸能力；所述逆向引物2的全部核苷酸序列或3′-端的一段核苷酸序列與逆向引物1上的某段序列相同或相近。
本發(fā)明中引入的分子信標(biāo)是一類莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸探針，其英文名稱為molecular beacon。它的環(huán)部由-段與靶基因互補(bǔ)的探針序列構(gòu)成，探針序列的兩端是兩段相互互補(bǔ)的莖序列，它們之間退火形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分別連接在兩條臂的末端。發(fā)夾型的莖使熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)相互接近，致使熒光基團(tuán)的熒光通過能量轉(zhuǎn)移而被猝滅。當(dāng)有與之完全匹配的靶基因存在時，分子信標(biāo)的探針序列與靶基因特異性結(jié)合，形成探針-靶雜交體，迫使熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)相互遠(yuǎn)離，體系熒光復(fù)原。由于未雜交的分子信標(biāo)仍保持原來的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不發(fā)射熒光，所以在檢測探針的雜交作用時無需將探針-靶雜交體與過剩的分子信標(biāo)分離。
在本發(fā)明中，特異性分子信標(biāo)探針的引入可極大地提高檢測的特異性，減弱非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所造成的不利影響。只要生成的非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中不包含有分子信標(biāo)探針的靶序列，它就不會與分子信標(biāo)探針發(fā)生相互作用，也就不會導(dǎo)致非特異性熒光信號的生成。
對于傳統(tǒng)的TRAP方法而言，直接用分子信標(biāo)探針進(jìn)行其擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時監(jiān)測是無法實(shí)現(xiàn)的，其主要原因在于端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物序列的特殊性(為5′-(GGTTAG)n-3′的端粒重復(fù)序列)導(dǎo)致PCR逆向引物與分子信標(biāo)的探針序列之間必然存在極大的相關(guān)性，由該逆向引物參與形成的引物二倍體及其他非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物都將會導(dǎo)致分子信標(biāo)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的打開，產(chǎn)生非特異性熒光信號。而本發(fā)明采用了一種獨(dú)特的PCR擴(kuò)增策略，即在對得到的端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，使用了一個PCR正向引物和本發(fā)明所述的逆向引物1和2，有效地解決了這個問題。
由于逆向引物1的3′-端或靠近3′-端的位置包含有與端粒重復(fù)序列互補(bǔ)的核苷酸序列，一旦該引物參與到引物二倍體或其它非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的生成，也將會導(dǎo)致非特異性熒光信號的產(chǎn)生，對檢測造成極為不利的影響。因此本發(fā)明對該逆向引物的3′-端進(jìn)行了修飾，使其喪失在PCR擴(kuò)增中的延伸能力，較好地解決了這一問題，使其在所進(jìn)行的PCR循環(huán)范圍內(nèi)(大約40個循環(huán))不會對檢測過程造成任何影響。
本發(fā)明技術(shù)可檢測的樣品包括組織細(xì)胞、血液、人體分泌物、排泄物、細(xì)胞針吸出物、擦拭物及其他各種臨床樣本。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于上述檢測目的的試劑盒，它包含本發(fā)明所述的分子信標(biāo)探針、逆向引物1和2及除擴(kuò)增模板外的PCR擴(kuò)增所必需的其他成分。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明工作原理。
參見圖1.(a)在起始的保溫步驟中，端粒酶底物在活性端粒酶的作用下延伸出5′-(GGTTAG)n-3′的端粒重復(fù)序列。(b)在PCR擴(kuò)增的退火階段，生成的端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物與逆向引物1的3′-端結(jié)合。(c)在隨后的引物延伸階段，結(jié)合在逆向引物1上的端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物在Taq酶的作用下沿逆向引物1延伸，生成的產(chǎn)物上包含有逆向引物2的結(jié)合位點(diǎn)，可在隨后的PCR擴(kuò)增中作為模板進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。(d)在隨后循環(huán)的高溫變性階段，PCR模板在高溫下變性形成單鏈。(e)當(dāng)溫度降低至退火溫度時，分子信標(biāo)探針與模板上相應(yīng)的靶基因位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生熒光信號，而未結(jié)合的分子信標(biāo)探針則保持原來的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，對體系熒光信號不產(chǎn)生影響。同時，端粒酶底物及下游引物2作為隨后的PCR引物對結(jié)合在模板上的相應(yīng)位點(diǎn)。(f)端粒酶底物及下游引物2在Taq酶的作用下延伸生成雙鏈PCR產(chǎn)物。(g)進(jìn)入下一輪循環(huán)。


圖1顯示本發(fā)明的檢測技術(shù)的工作原理。
圖2.本發(fā)明的技術(shù)用于人工合成的端粒酶產(chǎn)物-MTSR6的測定研究。
(A)實(shí)時PCR擴(kuò)增中熒光信號強(qiáng)度隨PCR循環(huán)數(shù)的變化情況。
(B)根據(jù)A中給出的Ct值對反應(yīng)液中所含MTSR6量的對數(shù)值作圖得到的工作曲線。8個反應(yīng)體系中所含的MTSR6的量分別為(1)104amol；(2)103amol；(3)102amol；(4)10amol；(5)1amol；(6)10-1amol；(7)10-2amol；(8)0amol。
圖3.本發(fā)明的技術(shù)用于HL-60細(xì)胞中端粒酶活性的檢測研究。
(A)實(shí)時PCR擴(kuò)增中熒光信號強(qiáng)度隨PCR循環(huán)數(shù)的變化情況。
(B)根據(jù)A中給出的Ct值對反應(yīng)液中所含的細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)值作圖得到的工作曲線。6個反應(yīng)體系中所含的HL-60細(xì)胞數(shù)目分別為(1)104；(2)103；(3)102；(4)10；(5)5；(6)104(經(jīng)過熱處理使端粒酶失活)。
本文所用下列詞語/術(shù)語具有如下含義，另有說明除外。
Ct值每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
MTSR6在端粒酶底物的3′-端延伸出6個5′-GGTTAG-3′的端粒重復(fù)序列。
具體實(shí)施例方式
為了能更好地理解本發(fā)明，下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1對人工合成的端粒酶產(chǎn)物-MTSR6的測定。
分子信標(biāo)探針為FAM-5′-CCGTGCTAACCCTAACCCTAACCCACGG-3′-DABCYL劃線部分為發(fā)夾的莖部，未劃線部分為與靶序列特異性互補(bǔ)的探針序列。
逆向引物1為5′-TAGAGCACAGCCTGTCCGTGACGATACCGTG(CTAACC)3-3′，3′-端磷酸化。
逆向引物2為5′-TAGAGCACAGCCTGTCCGTG-3′端粒酶底物為5′-GACAATCCGTCGAACAGAGTT-3′MTSR65′-GACAATCCGTCGAACAGAGTTAG(GGTTAG)6-3′以此人工合成的DNA序列模擬端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物，驗(yàn)證本發(fā)明技術(shù)的可行性。
步驟平行配制8管PCR反應(yīng)液，除所含的MTSR6的量不同外，其它成分完全相同。PCR反應(yīng)液的成分如下1×PCR反應(yīng)緩沖液，5mM MgCl2，各0.2mM的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，0.4μM端粒酶底物，8nM逆向引物1，0.4μM逆向引物2，80nM分子信標(biāo)探針，2U BlendTaq酶及不同量的MTSR6。
用上述引物和分子信標(biāo)探針在Rotor-Gene 3000熒光PCR儀上，對上述8管反應(yīng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增 在第二組循環(huán)(40次循環(huán))的每個55℃下測定分子信標(biāo)的熒光信號。
結(jié)果如圖2所示。從結(jié)果可以看出，本發(fā)明方法可用于人工合成的端粒酶產(chǎn)物的測定，線性范圍可達(dá)107個數(shù)量級，線性相關(guān)系數(shù)始終保持在0.99以上。對于未加MTSR6的陰性對照反應(yīng)，在所進(jìn)行的PCR循環(huán)范圍內(nèi)體系熒光強(qiáng)度幾乎沒有發(fā)生變化，顯示本發(fā)明的技術(shù)具有良好的檢測特異性。
實(shí)施例2對白血病細(xì)胞HL-60中端粒酶活性的檢測。
本實(shí)施例中使用的分子信標(biāo)探針、逆向引物及端粒酶底物的序列與實(shí)施例1相同。
檢測步驟(1)細(xì)胞中端粒酶的提取收集培養(yǎng)的白血病細(xì)胞HL-60，3000rpm離心3min分離沉淀細(xì)胞，棄上清。沉淀用預(yù)冷的PBS緩沖液懸浮，3000rpm離心3min，棄上清。將細(xì)胞重懸于預(yù)冷的沖洗緩沖液(Hepes-KOH10mmol/L，pH 7.5，MgCl21.5mmol/L，KCl 10mmol/L，DTT 1mmol/L)中。4℃下，10000rpm離心1min收集沉淀。將沉淀置于1.5mL離心管中，加入200μL裂解液(Tris-HCl 10mmol/L，pH 7.5，EGTA 1mmol/L，MgCl21mmol/L，β-巰基乙醇5mmol/L，甘油10％，CHAPS 0.5％，PMSF0.1mmol/L)，冰浴裂解30min，期間用移液器反復(fù)抽吸3次，以保證充分裂解。然后，于4℃，14000rpm離心30min，吸取上清液，依次10倍稀釋。稀釋液用液氮快速冷凍，置-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 陰性對照樣品的制備取5μL細(xì)胞提取液，95℃下熱處理30min使端粒酶失活。
(2)實(shí)時PCR檢測PCR反應(yīng)液的成分如下1×PCR反應(yīng)緩沖液，5mM MgCl2，各0.2mM的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，0.4μM端粒酶底物，8nM逆向引物1，0.4μM逆向引物2，80nM分子信標(biāo)探針，2UBlend Taq酶及1μL細(xì)胞提取液.
實(shí)時PCR檢測在Rotor-Gene 3000熒光PCR儀上進(jìn)行，具體擴(kuò)增條件如下
在第二組循環(huán)(40次循環(huán))的每一55℃下測定分子信標(biāo)的熒光信號。結(jié)果如圖3所示。從結(jié)果可以看出，本發(fā)明方法可用于細(xì)胞中端粒酶活性的測定。在所研究的細(xì)胞數(shù)目范圍內(nèi)(104～5個細(xì)胞)，Ct值與細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)值之間都顯示了良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)始終保持在0.99以上。當(dāng)使用熱處理的細(xì)胞提取液作陰性對照時，發(fā)現(xiàn)其熒光信號的增長要明顯落后于陽性反應(yīng)體系，顯示本發(fā)明的技術(shù)具有良好的檢測特異性。使用本發(fā)明的技術(shù)，也可以檢測出1個細(xì)胞中的端粒酶活性，但結(jié)果的重現(xiàn)性較差，所以在進(jìn)行端粒酶活性檢測時，使用的細(xì)胞樣品數(shù)目不宜過少。
序列列表<110>南開大學(xué)<120>一種端粒酶活性定量檢測方法及試劑盒<130>20060609<160>2<210>1<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>prim_bind<222>(1)…(49)<223>最末端(3′-端)的堿基用磷酸化修飾<400>1tagagcacagcctgtccgtgacgataccgtgctaaccctaaccctaacc<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>prim_bind<222>(1)…(20)<223>
<400>2tagagcacagcctgtccgtg
權(quán)利要求
1.一種端粒酶活性定量檢測方法，包括(1)從待測樣品中提取活性端粒酶；(2)在PCR體系中，將提取的端粒酶作用于特定的底物，得到攜帶有端粒重復(fù)序列的端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物；(3)對得到的端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)在PCR擴(kuò)增的同時對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測；其特征在于(1)在端粒酶的PCR檢測體系中引入了端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物特異性的分子信標(biāo)探針，通過監(jiān)測分子信標(biāo)探針?biāo)a(chǎn)生的熒光信號用以對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。所述分子信標(biāo)探針是以端粒重復(fù)序列或其互補(bǔ)序列為作用靶點(diǎn)；(2)對得到的端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，使用一個PCR正向引物和逆向引物1和2；所述逆向引物1的3′-端或靠近3′-端的位置包含有與端粒重復(fù)序列互補(bǔ)的核苷酸序列；5′-端或靠近5′端的位置包含有與逆向引物2或逆向引物2的3′-端相同或相似的核苷酸序列；且逆向引物1的3′-端經(jīng)過修飾，喪失了在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的延伸能力；所述逆向引物2的全部核苷酸序列或3′-端的一段核苷酸序列與逆向引物1上的某段序列相同或相近。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒酶活性定量檢測方法，其特征在于分子信標(biāo)探針序列的總長度約為15至50個核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒酶活性定量檢測方法，其特征在于所述的待測樣品包括組織細(xì)胞、血液、人體分泌物、排泄物、細(xì)胞針吸出物、擦拭物及其他各種臨床樣本。
4.一種端粒酶活性檢測試劑盒，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的逆向引物1和2及權(quán)利要求1或2所述的分子信標(biāo)探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種端粒酶活性定量檢測方法，通過將端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物特異性的分子信標(biāo)探針引入到端粒酶活性的PCR檢測當(dāng)中，極大地提高了端粒酶活性檢測的特異性，為其在臨床上的應(yīng)用推廣提供了條件。為了保證分子信標(biāo)探針的順利引入，本發(fā)明采取了一種特殊的PCR擴(kuò)增策略，即在對得到的端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，使用了一個PCR正向引物和的逆向引物1和2。本發(fā)明還提供了包含所述分子信標(biāo)探針和逆向引物1和2的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1912131SQ20061001423
公開日2007年2月14日 申請日期2006年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月9日
發(fā)明者孔德明, 金雅薇, 沈含熙, 劉六戰(zhàn) 申請人:南開大學(xué)