綠原酸和/或其衍生物在治療腫瘤干細胞的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及綠原酸和/或其衍生物在治療腫瘤干細 胞的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 90%腫瘤引起的死亡，都是由于腫瘤復發(fā)并轉(zhuǎn)移到其他關(guān)鍵器官所致。腫瘤的復 發(fā)和轉(zhuǎn)移是由于腫瘤干細胞的存在。美國癌癥研究協(xié)會(American Association for Cancer Research)2006年對腫瘤干細胞給出的明確定義是:腫瘤中具有自我更新能力并能 產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞的細胞。腫瘤干細胞具有無限自我更新能力、多向分化潛能、較高的端 粒酶活性、強耐藥性、抗凋亡、腫瘤組織中比例較低和表達干細胞特異性標記物的特點。放 化療雖然可以殺滅大多數(shù)腫瘤細胞，但是對腫瘤干細胞卻沒有作用，腫瘤干細胞經(jīng)過增殖， 最終又可導致腫瘤復發(fā)。因此，放化療不能清除體內(nèi)的腫瘤干細胞，而只要體內(nèi)有腫瘤干細 胞的存在，腫瘤就有可能復發(fā)和轉(zhuǎn)移。
[0003] 目前臨床大多數(shù)的抗腫瘤藥物主要作用于分化的腫瘤細胞，而不是腫瘤干細胞， 所以腫瘤干細胞被看做是腫瘤多藥耐藥性、復發(fā)和轉(zhuǎn)移的罪魁禍首，腫瘤干細胞成為目前 國際上腫瘤研究的熱點，成為腫瘤治療的新靶點，為腫瘤治療帶來新希望。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供綠原酸和/或其衍生物在治療腫瘤干 細胞的藥物中的應(yīng)用，以使藥物能夠抑制和殺滅腫瘤干細胞，有效地防止腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移 以及多藥耐藥性的產(chǎn)生。
[0005] 本發(fā)明提供了綠原酸和/或其衍生物的新用途，其技術(shù)方案為：
[0006] 綠原酸和/或其衍生物在治療腫瘤干細胞的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 進一步，所述腫瘤干細胞為肝癌干細胞、胃癌干細胞、肺癌干細胞、腎癌干細胞、結(jié) 腸癌干細胞、乳腺癌干細胞、急性髓系白血病干細胞和急變期慢性髓系白血病干細胞。
[0008] 腦腫瘤干細胞、肝癌干細胞、胃癌干細胞、肺癌干細胞、腎癌干細胞、結(jié)腸癌干細 胞、乳腺癌干細胞、急性髓系白血病干細胞和急變期慢性髓系白血病干細胞屬于不同的腫 瘤干細胞，因每種腫瘤干細胞的功能不同，其內(nèi)部的信號通路、表面的識別蛋白及與靶點是 不同的，因此，綠原酸能否分別作用于腦腫瘤干細胞、肝癌干細胞、胃癌干細胞、肺癌干細 胞、腎癌干細胞、結(jié)腸癌干細胞、乳腺癌干細胞、急性髓系白血病干細胞和急變期慢性髓系 白血病干細胞的相應(yīng)祀點，其對相應(yīng)的腫瘤干細胞起到抑制效果也是不可預測的。
[0009] 本發(fā)明經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸不僅能夠作用于腦腫瘤干細胞，也能夠作用于肝癌 干細胞、胃癌干細胞、肺癌干細胞、腎癌干細胞、結(jié)腸癌干細胞、乳腺癌干細胞、急性髓系白 血病干細胞和急變期慢性髓系白血病干細胞的相應(yīng)靶點，能夠抑制和殺滅這些腫瘤干細 胞，防止這些腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移以及多藥耐藥性的產(chǎn)生。
[0010] 進一步，所述綠原酸衍生物包括藥學上可接受的綠原酸鹽以及化學合成的衍生 物。
[0011] 進一步，所述綠原酸鹽包括綠原酸鈉鹽、綠原酸鉀鹽和綠原酸鈣鹽。
[0012] 本發(fā)明中，所述藥物是具有抑制腫瘤干細胞增殖，下調(diào)腫瘤干細胞比例，減弱腫瘤 干細胞自我更新能力的功效的藥物。
[0013] 上述藥物中的活性成分為綠原酸和/或其衍生物，因此，該藥物具有抑制腫瘤干細 胞增殖，減少腫瘤干細胞數(shù)目，下調(diào)腫瘤干細胞比例，減弱腫瘤干細胞自我更新能力的功 效。
[0014] 進一步，所述藥物中含有綠原酸和/或其衍生物以及藥用輔料。
[0015] 進一步，所述藥物為聯(lián)合藥物，所述藥物中還含有現(xiàn)有的抗腫瘤藥物。
[0016] 上述藥物中可以采用綠原酸和/或其衍生物作用活性成分，也可以將綠原酸和/或 其衍生物與現(xiàn)有的抗腫瘤藥物組合作為聯(lián)合藥物而使該藥物具有更好的治療效果。
[0017] 進一步，所述現(xiàn)有的抗腫瘤藥物為阿霉素。
[0018]進一步，所述藥物的每制劑單位中含有綠原酸和/或其衍生物1~lOOOmg。
[0019] 優(yōu)選地，所述藥物的每制劑單位中含有綠原酸和/或其衍生物500mg。
[0020] 進一步，所述藥物的劑型為口服制劑或者注射制劑。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] 本發(fā)明所提供的綠原酸和/或其衍生物在治療腫瘤干細胞的藥物中的應(yīng)用，為綠 原酸提供了一種新用途，通過將綠原酸應(yīng)用于治療腫瘤干細胞的藥物中，使藥物能夠抑制 和殺滅腫瘤干細胞，有效地防止腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移以及多藥耐藥性的產(chǎn)生。
【附圖說明】
[0023] 圖1為實施例1中所述的細胞株H460的腫瘤球形成實驗的結(jié)果圖；
[0024] 圖2為實施例1中所述的細胞株H466的腫瘤球形成實驗的結(jié)果圖；
[0025] 圖3為實施例1中所述的側(cè)群細胞(SP)檢測的結(jié)果圖；
[0026] 圖4為實施例2中所述的藥物干預后微球體培養(yǎng)結(jié)果圖；
[0027]圖5為實施例2中所述的藥物干預后微球體細胞中⑶44+CD24-/l〇W細胞比例的變 化結(jié)果圖；
[0028]圖6為實施例2中所述的藥物干預后微球體細胞中側(cè)群細胞(SP)的檢測結(jié)果圖； [0029]圖7為實施例2中所述的藥物干預后微球體細胞中MDR1、BCRP的mRNA表達的差異 圖。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1
[0031] 綠原酸對肺癌干細胞生長的影響
[0032] 腫瘤球形成實驗:常規(guī)培養(yǎng)的人肺癌細胞株H460和H466的細胞分別經(jīng)胰酶消化后 以lOOOrpm的離心速度離心2min，棄上清后加入3ml無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，輕柔吹散、洗 滌細胞沉淀并離心。反復洗滌3次后加入腫瘤球培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基），制備成單細胞懸 液。
[0033] 測定制備的細胞株H460的單細胞懸液的細胞濃度并調(diào)整細胞密度為1500cellS/ ml，將單細胞懸液均勻地轉(zhuǎn)移到超低粘附的6孔板內(nèi)，并分別設(shè)立A、B、C和D組進行腫瘤球培 養(yǎng);測定制備的細胞株H466的單細胞懸液的細胞濃度并調(diào)整細胞密度為1500cellS/ml，將 單細胞懸液均勻地轉(zhuǎn)移到超低粘附的6孔板內(nèi)，并分別設(shè)立A、B、C和D組進行腫瘤球培養(yǎng)。其 中，A組均為空白組，選用生理鹽水處理;B組均選用濃度為ΙμΜοΙ/L的綠原酸處理;C組均選 用濃度為2yMol/L的綠原酸處理;D組均選用濃度為3yMol/L的綠原酸處理。每3天更換培養(yǎng) 液1次，7天后觀察腫瘤球形成情況。
[0034]根據(jù)肺癌干細胞能在無血清培養(yǎng)基中生長并形成微球的特性，這些微球由少數(shù)腫 瘤干細胞自我更新形成，因此，通過檢測微球形成體積，可以標示腫瘤干細胞的數(shù)量而設(shè)置 了上述實驗。實驗結(jié)果如圖1和圖2所示，圖1為細胞株Η460的腫瘤球形成實驗的結(jié)果圖；圖2 為細胞株Η466的腫瘤球形成實驗的結(jié)果圖。其中B、C和D組的腫瘤球體積均小于空白組，說 明綠原酸對肺癌干細胞具有抑制作用；同時，隨著綠原酸的濃度增大，腫瘤球的體積逐漸減 小，說明隨著綠原酸的濃度的增大，其對腫瘤干細胞的抑制作用越強，可以有效地減少肺癌 干細胞的數(shù)量。
[0035] 側(cè)群細胞檢測（SP):將肺癌細胞株H460細胞分為三組，編號為A、B和GA組為空白 組，采用生理鹽水孵育3天;B組和C組分別采用濃度為ΙμΜοΙ/L和3μΜ〇1/1的綠原酸孵育3天。 3天后，將A、Β和C組的細胞棄去培養(yǎng)液，4 °C的PBS沖洗，再經(jīng)胰酶-EDTA消化并以2 %胎牛血 清1640培養(yǎng)基重懸為單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞密度為IX 105cells/ml。細胞加入適當 濃度的Hoechst 33342,在37°C緩慢旋轉(zhuǎn)孵育90min后于4°C離心5min，并以預冷PBS重懸細 胞。共洗滌細胞2次。細胞保存在冰上以抑制Hoechst 33342染料外流。樣品保存于冰上，直 至上機檢測。
[0036] SP(side population)細胞是細胞群體中極少的一部分，它們可將進入細胞核的 熒光染料排出胞外，在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞檢測時表現(xiàn)為不著色，故稱為SP細胞. 已發(fā)現(xiàn)SP細胞和干細胞具有很多共性，且與腫瘤干細胞很相似，因此，可以通過檢測SP細胞 而判斷腫瘤干細胞的生長情況。
[0037]如圖3所示，為側(cè)群細胞(SP)檢測的結(jié)果圖。其中，B組和C組中的SP細胞數(shù)量均小 于A組，且C組SP細胞數(shù)量小于B組。因此，說明綠原酸在較低濃度下就可對SP細胞起到抑制 作用，且綠原酸的抑制效應(yīng)隨著濃度的增加而增強，即綠原酸可以減少肺癌干細胞的數(shù)量。
[0038] 實施例2
[0039] 綠原酸對乳腺癌腫瘤干細胞的作用
[0040] 1.小鼠乳腺癌細胞系MCF-7的無血清懸浮微球體培養(yǎng)一一富集乳腺癌干細胞 [0041 ] 將購進的MCF-7乳腺癌細胞常規(guī)復蘇后，用含10%胎牛血清的01^1鄺12培養(yǎng)基 (SSM)培養(yǎng)，以0.25 %胰酶-0.02 %EDTA消化細胞傳代。取SSM培養(yǎng)的對數(shù)生長期的MCF-7細 胞，用0.25 %胰酶-0.02 %EDTA消化并機械吹打成單細胞懸液，經(jīng)臺盼藍染色并計數(shù)后以2 X104/ml接種于無血清培養(yǎng)基（SFM，即不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，添加20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2%B27)，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，3天離心換液，當形成細胞 球后，用0.25 %胰酶-0.02%EDTA的10倍稀釋液消化成單細胞懸液重懸于SFM中，仍以2 X 104/ml的濃度接種于SFM中，約6~7天傳代一次。
[0042] 2.實驗分組及用藥
[0043] 取SFM培養(yǎng)的第10代乳腺癌細胞球，以10倍稀釋的0.25 %胰酶-0.02 %EDTA消化成 單細胞懸液并重懸于SFM中，調(diào)整細胞密度為5 X 104/ml，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，每瓶2ml，共 20瓶。20瓶細胞隨機分為4組，分別為空白對照組，綠原酸組、阿霉素組、綠原酸+阿霉素組。 對照組加入生理鹽水20μ1，阿霉素組加入0.1mg/ml阿霉素20μ1，綠原酸組加入lmg/ml綠原 酸20μ1，阿霉素+綠原酸組加入0.2mg/ml阿霉素10μ1和2mg/ml綠原酸10μ1。在37°C、5%⑶2 培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，48h離心換液，繼續(xù)SFM培養(yǎng)。10天后觀察細