專利名稱：一種檢測(cè)端粒酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)端粒酶的活性的方法，尤其是通過(guò)檢測(cè)人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(簡(jiǎn)稱hTERT，即human Telomerase Reverse Transcriptase)中某段結(jié)構(gòu)域，來(lái)確定端粒酶的活性的方法，從而為端粒酶的活性檢測(cè)提供一個(gè)精確、簡(jiǎn)便的方法，對(duì)臨床腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估，以及對(duì)細(xì)胞系的基礎(chǔ)研究，具有重要的意義。
人類端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，自身帶有模板，是一種核酸蛋白復(fù)合體，主要由RNA亞單位hTR(human Telomerase，人類端粒酶)和催化亞單位hTERT組成，其作用是hTERT以其自身的hTR為模板，合成端粒的重復(fù)序列，通過(guò)延長(zhǎng)端粒來(lái)保持染色體的穩(wěn)定[The telomerasereverse transcriptasecomponents and regulation GENES &DEVELOPMENT，121073-1085(1998)]。端粒酶活性同細(xì)胞的增殖相關(guān)，而同細(xì)胞的表型(正常或者腫瘤，良性或者惡性)無(wú)關(guān)，所以目前認(rèn)為端粒酶活性是增殖細(xì)胞的標(biāo)志物。
除造血干細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞等外，人的正常體細(xì)胞是不具有端粒酶活性的，但85～95％的腫瘤細(xì)胞、人類胚胎干細(xì)胞和增殖中的成體干細(xì)胞具有端粒酶活性[Specific association of human telomerase activity withimmortal cells and cancer，Science 2662011-2015(1994)；Telomerase activityin human germline and embryonic tissues and cells.Dev-Genet.18173-179(1996)；Asurvey oftelomerase activity in human cancer.Eur J Cancer，33787-791(1997)；Telomerase activity，cell proliferation，and cancer Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9590-92(1998)]，因而端粒酶活性已經(jīng)成為判斷增殖細(xì)胞存在的一種標(biāo)志物，例如腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞。所以端粒酶活性檢測(cè)在腫瘤的診斷、治療和預(yù)后的評(píng)估等方面顯示出極大的應(yīng)用價(jià)值。隨著干細(xì)胞研究的深入，人們?cè)絹?lái)越希望通過(guò)轉(zhuǎn)染得到永生化的干細(xì)胞系。無(wú)論在建立相應(yīng)細(xì)胞系還是檢測(cè)干細(xì)胞，同端粒酶的聯(lián)系越來(lái)越緊密了。因而如何對(duì)端粒酶活性的準(zhǔn)確判斷也越來(lái)越重要了。
只有hTR和hTERT共同存在時(shí)，細(xì)胞才具有端粒酶的活性。在進(jìn)一步的研究中，人們發(fā)現(xiàn)，hTR并不是端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞所特有的，而是廣泛存在于各種類型的細(xì)胞中，而hTERT只存在于端粒酶陽(yáng)性的細(xì)胞中。研究證明，hTERT是端粒酶活性的限定性部分，即只有hTERT的表達(dá)，細(xì)胞才能具有端粒酶的活性[Catalytic subunit of telomerase expression isrelated to RNA component expression.FEBS Letters，460285-288(1999)]。所以，近年來(lái)的研究主要是集中于對(duì)hTERT的研究。
在對(duì)hTERT的研究中，確認(rèn)細(xì)胞具有端粒酶的活性是研究的首要工作。因?yàn)橹挥写_認(rèn)有端粒酶的活性，才能確定有hTERT的存在。目前檢測(cè)端粒酶活性的方法，主要有三種TRF、RT-PCR和TRAP。1、TRF(Terminal restriction fragment length-measurement，即染色體末端內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度測(cè)量法)[參見(jiàn)Clonal Heterogeneity in Telomerase Activity and TelomereLength in Tumor-Derived Cell Lines，Proceedings of the Society forExperimental Biology and Medicine 223379-388(2000)]原理通過(guò)測(cè)量端粒重復(fù)序列的長(zhǎng)度，間接測(cè)定端粒酶的活性。
方法1)提取DNA；2)酶切(HinfI等)；3)0.8％瓊脂糖電泳；4)TTAGGG探針雜交；5)計(jì)算機(jī)程序處理。
缺點(diǎn)過(guò)程復(fù)雜，成本高，不準(zhǔn)確，需要連續(xù)的觀察。不適用于臨床檢測(cè)。目前這種方法僅局限在實(shí)驗(yàn)室使用，而且已經(jīng)很少應(yīng)用了。2、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR方法)是一種半定量方法。(參見(jiàn)文獻(xiàn)同上)方法1)提取總RNA；2)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；3)利用特定引物對(duì)hTR和hTERT的cDNA進(jìn)行PCR，并設(shè)立內(nèi)參對(duì)照；4)PAGE電泳，EB染色。
缺點(diǎn)PCR盡管比較靈敏，但是反應(yīng)條件不易控制，重復(fù)性差，容易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果。并且涉及到要提取RNA，實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格。3、TRAP(Telomeric repeat amplification protocol，即端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法)，是1994年Kim等基于PCR原理建立的。目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)端粒酶所采用的主要手段，是對(duì)端粒酶活性的直接檢測(cè)。[參見(jiàn)Kim-NW等，Specific association of human telomerase activitywith immortal cells and cancer，Science，1994 Dec 23；266(5193)2011-5]原理端粒酶在體外可以其自身RNA的模板區(qū)為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6個(gè)堿基的重復(fù)序列，用PAGE凝膠電泳可顯示6個(gè)堿基的差異梯帶。
TRAP方法的進(jìn)展(1)同位素法采用放射性核素(如P)標(biāo)記的dGTP/dCTP摻入；(Kim)(2)染色法電泳后，用EB染色，在紫外透射儀下觀察；(3)熒光法將熒光素標(biāo)記到引物上，擴(kuò)增后，PAGE電泳，利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析；(4)ELISA法引物TS 5’端標(biāo)記生物素，PCR后，利用地高辛標(biāo)記的探針雜交擴(kuò)增產(chǎn)物，顯色后，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。
TRAP的不足(1)利用細(xì)胞提取液，不能進(jìn)行組織定位，不利于臨床病理檢測(cè)，也不適用于對(duì)成體干細(xì)胞的研究；(2)由于采用PCR為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性率；(3)對(duì)于大量樣品來(lái)說(shuō)，其重復(fù)性差，成本高。
原位雜交是經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法。原來(lái)主要是應(yīng)用于基因的染色體定位，現(xiàn)在越來(lái)越多的應(yīng)用在對(duì)細(xì)胞內(nèi)的mRNA表達(dá)的檢測(cè)，從而判斷其編碼的目的蛋白是否在該細(xì)胞或組織中表達(dá)。這種方法能更快、更準(zhǔn)確的檢測(cè)出所要研究的目的蛋白的表達(dá)情況，而且實(shí)驗(yàn)周期短(從發(fā)現(xiàn)其mRNA到制作出探針)。但是，這種方法僅限于對(duì)mRNA的檢測(cè)，目前還沒(méi)有人利用該方法檢測(cè)hTERT mRNA表達(dá)來(lái)判斷端粒酶活性，同時(shí)也未見(jiàn)到有人選擇motif-T相對(duì)應(yīng)的cDNA做探針，用其來(lái)檢測(cè)端粒酶活性及其拼接變異的相關(guān)報(bào)道。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，從已知具有端粒酶活性的人類細(xì)胞中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用PCR技術(shù)，用合成的特異性PCR引物，特異的擴(kuò)增含motif-T編碼序列的cDNA片段，經(jīng)純化后，重組到T-easy質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化、篩選、酶切鑒定、測(cè)序確認(rèn)為是目的序列后，(測(cè)序部分結(jié)果見(jiàn)附

圖1)，純化質(zhì)粒。
用內(nèi)切酶從質(zhì)粒上切下片段作為模板，標(biāo)記序列，合成雙鏈的cDNA探針。鑒定、純化和測(cè)定滴度。
探針與已知的端粒酶陽(yáng)性和陰性細(xì)胞或組織進(jìn)行原位雜交呈色，在熒光顯微鏡下觀察，檢測(cè)是否有hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而通過(guò)確定是否具有端粒酶的活性，來(lái)檢驗(yàn)該探針的有效性。
在此基礎(chǔ)上，使用該探針對(duì)其他大量的臨床腫瘤樣品和實(shí)驗(yàn)室的永生化細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其是否存在端粒酶的活性。
由于對(duì)motif-T的檢測(cè)是結(jié)構(gòu)性檢測(cè)，測(cè)量結(jié)果的靈敏度和特異性強(qiáng)，從而為細(xì)胞的端粒酶的活性檢測(cè)提供一個(gè)精確、簡(jiǎn)便的方法，因而本發(fā)明在腫瘤的診斷、治療和預(yù)后的評(píng)估等方面，以及對(duì)細(xì)胞系的基礎(chǔ)研究，都具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。
上述技術(shù)方案中，PCR引物的設(shè)計(jì)是保證探針制備的關(guān)鍵，其PCR產(chǎn)物motif-T片斷是探針的主體。也可通過(guò)其它分子生物學(xué)技術(shù)獲得。
含motif-T的重組T-easy質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)氨卞青霉素篩選、酶切鑒定和測(cè)序確認(rèn)為是目的序列后(測(cè)序結(jié)果見(jiàn)附圖1)，使用試劑盒提取并純化質(zhì)粒，成批制備探針。
motif-T探針的標(biāo)記，可以采用缺口平移、同位素標(biāo)記、末端標(biāo)記等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明選用缺口平移的方法制備。
本發(fā)明中的已知具有端粒酶活性的細(xì)胞可以是人類細(xì)胞，本發(fā)明優(yōu)選人類胚胎腎細(xì)胞293細(xì)胞(human embryonic kidney cell line 293，HEK-293)。因?yàn)?93細(xì)胞為端粒酶陽(yáng)性的細(xì)胞系，而且hTERT mRNA的豐度很高(即表達(dá)量很高)，并且沒(méi)有報(bào)導(dǎo)在轉(zhuǎn)錄水平上有拼接變異的報(bào)道(目前認(rèn)為只有在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到了拼接變異，文獻(xiàn)參考說(shuō)明書(shū)中相應(yīng)的部分)，因而模板mRNA正常且穩(wěn)定，可保證擴(kuò)增出來(lái)的片段序列正確。
本發(fā)明中可以使用M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒，Moloney murineleukemin virus)反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
本發(fā)明標(biāo)記序列時(shí)，可以將帶有地高辛的核苷酸(DIG-11-dUTP)標(biāo)記到序列中。并且在檢測(cè)時(shí)，通過(guò)標(biāo)有熒光素的抗地高辛抗體(Anti-Digoxigenin-Fluorescein Fab Fragments，來(lái)自于羊)來(lái)顯色。
本發(fā)明的原理在于hTERT是端粒酶活性的限定部分，與酶的活性呈線形相關(guān)，[Catalytic subunit of telomerase expression is related to RNAcomponent expression.FEBS Letters，460285-288(1999)]，通過(guò)對(duì)hTERT基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的檢測(cè)，確定細(xì)胞或組織是否具有端粒酶的活性。
hTERT是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，其蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)含有8個(gè)結(jié)構(gòu)域，即motif-1、2、A、B’、C、D、E和T，其中motif-T為端粒酶所特有的，其他的為逆轉(zhuǎn)錄酶所共有的motif數(shù)目。motif-A、B’、和C中的一部分組成了端粒酶的活性中心(三聯(lián)天冬氨酸)，而motif-T的作用是連接RNA亞單位[The telomerase reverse transcriptasecomponents and regulationGENES&DEVELOPMENT，121073-1085(1998)；Telomerases.CurrentOpinion in Structural Biology，956-65(1999)]。
對(duì)hTERT轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)錄子中存在著大量的拼接變異，主分為兩類，即插入和缺失，并且主要集中于mRNA的3’端，而5’端，即motif-T及相臨區(qū)域?qū)?yīng)的mRNA穩(wěn)定。這些變異將導(dǎo)致翻譯出來(lái)的蛋白無(wú)酶活性，是端粒酶活性調(diào)節(jié)的一個(gè)重要方面。但是，這種拼接變異只存在于hTERT表達(dá)的腫瘤細(xì)胞或者組織中[Isolation of a candidate human telomerase catalyticsubunit gene，which reveals complex splicing pattems in different cell types.Human Molecular Genetics，62011-2019(1997)；Telomerase activity inhuman development is regulated by human telomerase reverse transcriptase(hTERT)transcription and by alternate splicing of hTERT transcripts.CancerRes.，584168-4172(1998)；Genomic organization and promotercharacterization of the gene encoding the human telomerase reversetranscriptase(hTERT)Gene，23297-106(1999)]。
hTERT中motif-T為端粒酶所特有的結(jié)構(gòu)域，是與RNA亞單位相結(jié)合的位點(diǎn)，與motif-A、B’、C同樣為端粒酶活性表達(dá)的重要位點(diǎn)，選擇motif-T相對(duì)應(yīng)的cDNA做探針，可以充分反映端粒酶的活性。
采用本發(fā)明提供的方法檢測(cè)端粒酶活性的優(yōu)點(diǎn)在于1、本發(fā)明中所選取的motif-T序列，在研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)缺失或者插入等變異現(xiàn)象，motif-T相對(duì)應(yīng)的cDNA做成的探針，結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定，所得到的信號(hào)會(huì)比其他結(jié)構(gòu)域的探針要穩(wěn)定，而現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常采用的檢測(cè)序列，檢測(cè)結(jié)果并不十分穩(wěn)定，所以本發(fā)明在端粒酶活性判斷上具有較高的準(zhǔn)確性。
2、檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，并且可以對(duì)大量樣品同時(shí)進(jìn)行可重復(fù)性的操作。
3、采用本發(fā)明方法測(cè)量的結(jié)果，靈敏度和特異性強(qiáng)，不易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果，克服了現(xiàn)有檢測(cè)方法的缺點(diǎn)。
4、由于對(duì)motif-T的檢測(cè)是結(jié)構(gòu)性檢測(cè)，因而可以在樣品中進(jìn)行定位，明確哪些結(jié)構(gòu)和細(xì)胞中存在hTERT的轉(zhuǎn)錄，即具有端粒酶活性，具有一定的精確性，十分方便于臨床檢測(cè)和干細(xì)胞研究。
5、本發(fā)明選用熒光素檢測(cè)，可節(jié)約時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，便于臨床對(duì)腫瘤的篩查、治療效果的檢測(cè)和基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式在本實(shí)驗(yàn)中所使用的，取總RNA利用Trizol試劑(Promega公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(GiBco公司)，PCR產(chǎn)物及探針純化試劑盒ConcertTMRepid PCR Purification System(Bochinger Mannheim公司)，T-easy質(zhì)粒(Promega公司)，質(zhì)粒的純化試劑盒為High Pure PlasmidIsolation Kit For mini preparations(GiBco公司)，所用的內(nèi)切酶均來(lái)自于Promega公司，酶切片段的回收試劑盒(CONCERTTMGel ExtractionSystems)(GiBco公司)，缺口平移標(biāo)記試劑盒(DIG-Nick TranslationMix)，和標(biāo)有熒光素的抗地高辛抗體(Anti-Digoxigenin-Fluorescein FabFragments來(lái)自于羊)等均為Roch公司產(chǎn)品。實(shí)施例1motif-T探針的制備制備過(guò)程(1)從人類胚胎腎細(xì)胞293細(xì)胞(human embryonic kidney cell line 293，HEK-293)中提取總RNA，用M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒，Moloney murine leukemin virus)反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用PCR技術(shù)，用合成的特異性引物，特異的擴(kuò)增含motif-T編碼序列的151bp的cDNA片段，經(jīng)純化后，重組到T-easyvector中，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，經(jīng)氨卞青霉素篩選、酶切鑒定和測(cè)序確認(rèn)為是目的序列后，使用試劑盒提取并純化質(zhì)粒。(2)用PvuII內(nèi)切酶從質(zhì)粒上切下約600bp的片段作為模板，利用缺口平移方法將帶有地高辛的UTP(DIG-11-dUTP)標(biāo)記到序列中，合成雙鏈的cDNA探針。(3)在進(jìn)一步的電泳鑒定、探針純化和滴度測(cè)定后，對(duì)已知的端粒酶陽(yáng)性和陰性細(xì)胞或者組織進(jìn)行原位雜交，通過(guò)標(biāo)有熒光素的抗地高辛抗體(Anti-Digoxigenin-Fluorescein Fab Fragments，來(lái)自于羊)顯色。(4)在熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長(zhǎng)為494nm，發(fā)射波長(zhǎng)為523nm)，細(xì)胞核為藍(lán)色，胞漿中含有大量的綠色熒光顆粒，且熒光強(qiáng)度高。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論說(shuō)明使用已知具有端粒酶活性的HEK293細(xì)胞所制備的探針具有端粒酶活性，并且活性較高?？梢杂脕?lái)檢測(cè)其他未知細(xì)胞是否具有端粒酶活性。實(shí)施例2HEK293細(xì)胞的端粒酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞HEK293細(xì)胞一、細(xì)胞準(zhǔn)備、固定和通透(注意所有的溶液應(yīng)該用Rnase抑制因子處理)1、用37℃的PBS細(xì)胞，在室溫下，固定細(xì)胞；其中固定液的組成4％多聚甲醛、5％醋酸、0.9％NaCl2.在室溫下用PBS洗細(xì)胞30分鐘；3.在雜交前按如下的方法處理細(xì)胞(1)脫水70％、90％和100％乙醇；(2)脫脂100％二甲苯(3)水化100％、90％、70％(4)用PBS沖洗；4.增加通透性37℃使用通透液，處理增加通透性；其中通透液的組成0.1％胃蛋白酶、0.1NHCl5.后固定(1)用PBS洗滌5分鐘；(2)使用1％多聚甲醛后固定10分鐘；(3)再用PBS洗滌。二、原位雜交1.在80℃將實(shí)施例1中的探針變性，后將探針加入到雜交液中，終濃度為5ng/ul；雜交液組成60％去離子甲酰胺、300mMNaCl、30mM檸檬酸鈉、10mMEDTA、25mMNaH2PO4(pH＝7.4)、5％硫酸葡聚糖、250ng/ul鮭魚(yú)精子DNA)2.向固定細(xì)胞樣品上加10ul帶有探針的雜交液，覆蓋18*18mm蓋玻片。3.37℃在濕盒中進(jìn)行雜交16小時(shí)。三、洗滌1.雜交后，除去蓋玻片，在室溫下將載玻片放到溶液中搖床上搖；洗滌溶液組成60％甲酰胺、300mM NaCl、30mM檸檬酸鈉2.重復(fù)步驟1在室溫下洗三次；在37℃洗一次。3.最后，PBS洗5分鐘。四、免疫熒光顯色1.封閉向每一張載玻片上加100ul阻止液，并蓋上蓋玻片；并放在濕盒中。
封閉液組成100Mm Tris-HCl(pH＝7.5)、150mM NaCl、0.5％(w/v)封閉劑2.去除蓋玻片，簡(jiǎn)單用溶液洗滌；3.加上含有抗體的阻止液，放到濕盒中，45分鐘；4.洗滌；溶液組成100Mm Tris-HCl(pH＝7.5)、150mM NaCl、0.05％Tween205.脫水脫水70％、90％和100％乙醇；每個(gè)濃度5分鐘；6.空氣干燥；7.用帶有抗褪色劑溶液包埋樣片；比例為甘油∶抗褪色劑＝1∶9抗褪色溶液1M Tris-HCl(pH＝7.5)、2％DABCO、DAPI(75ng/ul)8.在熒光顯微鏡下面觀察(激發(fā)波長(zhǎng)為494nm，發(fā)射波長(zhǎng)為523nm)，細(xì)胞核為藍(lán)色，胞漿中含有大量的綠色熒光顆粒，且熒光強(qiáng)度高。實(shí)驗(yàn)結(jié)論說(shuō)明HEK293細(xì)胞具有端粒酶活性，并且活性較高。實(shí)施例3神經(jīng)干細(xì)胞的端粒酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞G3一、細(xì)胞準(zhǔn)備、固定和通透(注意所有的溶液應(yīng)該用Rnase抑制因子處理)1.用37℃的PBS細(xì)胞，在室溫下，固定細(xì)胞；固定液的組成4％多聚甲醛、5％醋酸、0.9％NaCl2.在室溫下用PBS洗細(xì)胞30分鐘；3.在雜交前按如下的方法處理細(xì)胞1)脫水70％、90％和100％乙醇；2)脫脂100％二甲苯3)水化100％、90％、70％4)用PBS沖洗；4.增加通透性37℃使用通透液，處理增加通透性；通透液的組成0.1％胃蛋白酶、0.1N HCl5.后固定4)用PBS洗滌5分鐘；5)使用1％多聚甲醛后固定10分鐘；6)再用PBS洗滌。二、原位雜交。1.在80℃將實(shí)施例1中的探針變性，后將探針加入到雜交液中，終濃度為5ng/ul；雜交液組成60％去離子甲酰胺、300mM NaCl、30mM檸檬酸鈉、10mM EDTA、25mM NaH2PO4(pH＝7.4)、5％硫酸葡聚糖，250ng/ul鮭魚(yú)精子DNA)2.向固定細(xì)胞樣品上加10ul帶有探針的雜交液，覆蓋18*18mm蓋玻片。3.37℃在濕盒中進(jìn)行雜交16小時(shí)。三、洗滌1.雜交后，除去蓋玻片，在室溫下將載玻片放到溶液中搖床上搖；2.重復(fù)步驟1在室溫下洗三次；在37℃洗一次。3.最后，PBS洗5分鐘。四、免疫熒光顯色1.封閉向每一張載玻片上加100ul阻止液，并蓋上蓋玻片；并放在濕盒中。
封閉液組成100mM Tris-HCl(pH＝7.5)、150mM NaCl、0.5％(w/v)封閉劑2.去除蓋玻片，簡(jiǎn)單用溶液洗滌；3.加上含有抗體的阻止液，放到濕盒中，45分鐘；4.洗滌；5.脫水70％、90％和100％乙醇；每個(gè)濃度脫水5分鐘；6.空氣干燥。7.用帶有抗褪色劑溶液包埋樣片；比例為甘油∶抗褪色劑＝1∶99.在熒光顯微鏡下面觀察(激發(fā)波長(zhǎng)為494nm，發(fā)射波長(zhǎng)為523nm)，細(xì)胞核為藍(lán)色，胞漿中含有綠色熒光顆粒，且熒光強(qiáng)度高。結(jié)論說(shuō)明神經(jīng)干細(xì)胞具有端粒酶活性，并且活性較高。實(shí)施例4子宮頸癌組織的端粒酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組織子宮頸癌組織(北京大學(xué)腫瘤所提供)(方法一)冰凍切片(方法二)石蠟切片雜交過(guò)程同上。結(jié)果在腫瘤組織部位的細(xì)胞中，胞漿中有彌漫的綠色熒光顆粒，熒光強(qiáng)度較高；而周圍的癌旁組織中沒(méi)有綠色熒光。結(jié)論子宮頸癌組織細(xì)胞具有端粒酶活性，而癌旁的正常組織細(xì)胞不具有端粒酶的活性。實(shí)施例5陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人類成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程同上。結(jié)果細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到綠色熒光。結(jié)論該細(xì)胞中不具有端粒酶的活性。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)端粒酶活性的方法，包括以下步驟(1)從已知具有端粒酶活性的人類細(xì)胞中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用PCR技術(shù)，用合成的特異性PCR引物，特異的擴(kuò)增含motif-T編碼序列的cDNA片段，經(jīng)純化后，重組到質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定、測(cè)序，確認(rèn)為是目的序列后，純化質(zhì)粒；然后(2)用內(nèi)切酶從質(zhì)粒上切下片段作為模板，標(biāo)記序列，合成雙鏈的cDNA探針，鑒定、純化和測(cè)定探針滴度；然后(3)探針與已知的端粒酶陽(yáng)性和陰性細(xì)胞或組織進(jìn)行原位雜交呈色，在熒光顯微鏡下觀察，檢測(cè)是否有hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而通過(guò)確定是否具有端粒酶的活性，來(lái)檢驗(yàn)該探針的有效性；然后(4)使用該探針對(duì)其他大量的臨床腫瘤樣品和實(shí)驗(yàn)室的永生化細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其是否存在端粒酶的活性。
2.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于所述的PCR引物所生成的PCR產(chǎn)物motif-T片斷是探針的主體，也可通過(guò)其它分子生物學(xué)技術(shù)獲得。
3.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于所述的含motif-T的重組質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)氨卞青霉素篩選、酶切鑒定和測(cè)序確認(rèn)為是目的序列后，使用試劑盒提取并純化質(zhì)粒，成批制備探針。
4.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于所述的標(biāo)記序列，可以采用缺口平移、同位素標(biāo)記、末端標(biāo)記等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行。
5.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于所述的標(biāo)記序列，可以將帶有地高辛的核苷酸標(biāo)記到序列中。
6.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于所述的檢測(cè)是否有hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄時(shí)，可以通過(guò)標(biāo)有熒光素的抗地高辛抗體顯色。
7.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于所述的人類細(xì)胞為人類胚胎腎細(xì)胞293細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于所述的反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒為M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)端粒酶活性的方法，通過(guò)提取細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，克隆含有motif－T的cDNA序列的目的片段，合成特異探針，進(jìn)行原位雜交，然后檢測(cè)是否有hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而確定是否具有端粒酶的活性。由于對(duì)motif－T的檢測(cè)是結(jié)構(gòu)性檢測(cè)，測(cè)量結(jié)果的靈敏度和特異性強(qiáng)，從而為端粒酶的活性檢測(cè)提供一個(gè)精確、簡(jiǎn)便的方法，因而本發(fā)明在腫瘤的診斷、治療和預(yù)后的評(píng)估等方面，以及對(duì)細(xì)胞系的基礎(chǔ)研究，都具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1450170SQ0211646
公開(kāi)日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2002年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月5日
發(fā)明者王亞軍, 沈麗 申請(qǐng)人:北京科宇聯(lián)合干細(xì)胞生物技術(shù)有限公司