金銀花的檢測試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了金銀花的核苷酸序列，還公開了檢測前述序列的試劑在制備金銀花檢測試劑中的用途，以及金銀花的檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明檢測試劑盒和檢測方法可以準確、有效的鑒別金銀花，特異性強，耗時短，應用前景良好。
【專利說明】金銀花的檢測試劑盒和檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種金銀花的檢測試劑盒和檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 金銀花，又名忍冬（學名=Lonicera japonica)。藥材金銀花為忍冬科忍冬屬植物 忍冬及同屬植物干燥花蕾或帶初開的花。金銀花自古被譽為清熱解毒的良藥。它性甘寒氣 芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達又可祛邪。金銀花既能宣散風熱，還善清解血毒，用于各 種熱性病，如身熱、發(fā)疹、發(fā)斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等癥，均效果顯著。現(xiàn)代研究證明，金銀 花含有綠原酸、木犀草素苷等藥理活性成分，對溶血性鏈球菌、金黃葡萄球菌等多種致病菌 及上呼吸道感染致病病毒等有較強的抑制力，另外還可增強免疫力、抗早孕、護肝、抗腫瘤、 消炎、解熱、止血（凝血）、抑制腸道吸收膽固醇等，其臨床用途非常廣泛，可與其它藥物配 伍用于治療呼吸道感染、菌痢、急性泌尿系統(tǒng)感染、高血壓等40余種病癥。
[0003] 金銀花藥用價值和保健用途廣泛，社會需求量大。市場上經(jīng)常出現(xiàn)以其他植物冒 充金銀花使用，目前，最為常見的金銀花偽品是山銀花，山銀花是忍冬科植物山銀花的干燥 花蕾或帶初開的花。目前金銀花偽品的檢測通常以顏色、形狀等性狀為標準進行鑒別，不易 掌握，具有一定的局限性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種新的、方便準確的金銀花檢測試劑 盒和檢測方法。
[0005] 本發(fā)明提供了 SEQ ID NO. 1?3所示的3種核苷酸序列。
[0006] 本發(fā)明還提供了檢測SEQ ID NO. 1?3任意一項所示核苷酸序列的試劑在制備金 銀花檢測試劑中的用途。
[0007] 所述檢測SEQ ID NO. 1?3任意一項所述核苷酸序列的試劑包括擴增SEQ ID NO. 1?3任意一項所不核苷酸序列的試劑。
[0008] 所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 5?6、SEQ ID NO. 7?8或SEQ ID NO. 9?10 所示的引物對。
[0009] 本發(fā)明檢測金銀花的試劑盒，包括檢測SEQ ID NO. 1?3任意一項所述核苷酸序 列的相關(guān)試劑。
[0010] 所述試劑包括擴增SEQ ID NO. 1?3任意一項所示核苷酸序列的試劑。
[0011] 所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 5?6、SEQ ID NO. 7?8或SEQ ID NO. 9?10 所示的引物對。
[0012] 優(yōu)選地，所述金銀花是產(chǎn)自美國休斯頓、廣東深圳或四川樂山的金銀花。
[0013] 本發(fā)明一種金銀花的檢測方法，包括如下步驟：
[0014] a，提取金銀花樣本DNA :提取待檢樣本中的DNA ;
[0015] b，檢測：用前述的試劑盒檢測待檢樣本，即可。
[0016] 優(yōu)選地，所述金銀花是產(chǎn)自美國休斯頓、廣東深圳或四川樂山的金銀花。
[0017] 本發(fā)明SEQ ID NO. 1?3所示核苷酸序列為金銀花特異性序列，通過檢測這些序 列可以有效區(qū)分金銀花和山銀花，鑒定待檢樣本是否為金銀花，保證食品安全，本發(fā)明方法 操作簡便，具有良好的應用前景。
[0018] 下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步詳細說明，但是并不是對本發(fā)明的限 制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述 基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，都是本發(fā)明保護的內(nèi) 容。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1用于克隆的RAro擴增片段。a.用所示的高GC引物FY-27擴增后用于克隆 的JYHGCl和JYHGC 2片段。b.用所示的高GC引物FY-28擴增后用于克隆的JYHGC6片段。 c.用所示的高GC引物FY-29擴增后用于克隆的JYHGC7片段。通道"M"為標明DNA分子量 大小的DL2000DNA標記。
[0020] 圖2所克隆的片段通過測序后獲得的DNA序列信息。a.克隆JYHGCl-I的DNA序 列。b.克隆JYHGC2-1的DNA序列。c.克隆JYHGC7-2的DNA序列。d.克隆JYHGC6-2的 DNA序列。
[0021] 圖 3SCAR 標記 JYHGC1-1, JYHGC2-1, JYHGC7-2 和 JYHGC6-2 在各物種的檢測。通道 1-5是從廣東深圳、湖北宜昌、四川峨眉和樂山、湖南婁底來的5種金銀花；通道6-7是福建 和海南桂圓；通道8-9是凸靈芝和紅芝；通道10是桅子花；通道11是廣東荔枝；通道12從 廣西采集的野生龍荔；通道13瀘州青果；通道14是四川涼山天麻；通道15是地丁；通道16 是四川古藺的趕黃草；通道17是溝景天；通道18是大鼠肝臟。
[0022] 圖 4SCAR 標記 JYHGC1-1, JYHGC2-1, JYHGC7-2 和 JYHGC6-2 在鑒別山銀花中的作 用。通道1-7是從美國休斯頓、廣東深圳、湖北宜昌、四川峨眉和樂山、湖南婁底來的6種金 銀花；通道7是重慶秀山縣的"山銀花"（灰氈毛忍冬）。

【具體實施方式】
[0023] 實施例IRAPD技術(shù)擴增金銀花特異SCAR標記
[0024] 一、CTAB法提取植物DNA
[0025] 1、收集廣東、廣西、四川峨眉、四川樂山以及湖南各地產(chǎn)金銀花及其它植物物種樣 本，同時收集美國休斯頓的金銀花。置于4°C冰箱備用；
[0026] 2、取植物葉片或花蕾約2g左右減碎放于研缽中，加入石英砂快速研磨成粉末狀， 將粉末裝入5ml離心管中，裝入的量約占離心管的1/3 ;
[0027] 3、加入 2ml 65 °C 預熱的 CTAB 提取緩沖液（Hexadecyl trimethyl-ammonium bromide).和4 ii I 0 -巰基乙醇，充分混勻，于65°C水浴40min，間隔IOmin振蕩1次以免成 團；
[0028] 4、每管加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1)，充分振蕩5min使其成乳白色，室溫下 4000rpm離心15min，取上清于一新的5ml離心管中（剪掉Tip頭后吸取上清，以免打斷 DNA)；
[0029] 5、緩慢加入等體積預冷的異丙醇于離心管中，上下顛倒混勻（操作輕柔），-20°C 冰箱預冷30min后，4000rpm離心6min ;
[0030] 6、去掉液體，用70%的乙醇和無水乙醇清洗1次（加入70%的乙醇后，上下顛倒 洗滌，于離心機4000rpm離心2min后，倒掉液體。加入無水乙醇，重復1次。洗脫完畢后， 倒掉液體后，4000rpm離心2min后,用移液器吸進殘余液體）；
[0031] 7、開蓋置于室溫干燥5min，用100 的CldH2O洗脫，置于4°C過夜使其完全溶解 后，放于-20°C長期保存；
[0032] 8、DNA 純化
[0033] (1)加入終濃度 lOOng/ml 的 RNase A、2 ill 的蛋白酶 K(20mg/ml)，37°C 保溫 Ih ;
[0034] (2)加入等體積的酚/氯仿/異戊醇上下顛倒混勻使其成乳白色，室溫下4000rpm 離心5min ;
[0035] (3)取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇再次抽提；
[0036] (4)取上清液后加入終濃度為0? 3mol/L的NaAc (Ph4. 8)，2?3倍體積冷的無水乙 醇，-20°C冰箱放置Ih左右，10000r/min4°C離心lOmin，除去上清；
[0037] (5)用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，自然干燥后溶液CldH2O中備用。
[0038] 注意事項：根據(jù)需要，DNA的純化也可采用商業(yè)銷售的各種DNA純化試劑盒純化。
[0039] 9、DNA質(zhì)量檢測和濃度分析
[0040] (1)電泳法：1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DN A的質(zhì)量。
[0041] (2) NANO DROP 法：（測 OD 值法）
[0042] ?打開分光光度計圖標，選擇 Nuncli Acid ; (Nanodrop，ND1000)
[0043] ?加入CldH2O 4 ill，點擊0K，初始化儀器；
[0044] ?再次加入 CldH2O 4 ill，選擇 DNA-50,點擊 BLANK ;
[0045] ?加入樣本I y 1，點擊Measure,測出值后作好詳細記錄。
[0046] ?滴入ddH20 4 ii 1洗漆兩次。
[0047] 注意事項：
[0048] (l)260nm、230nm、280nm下的吸光度分別代表了核酸、鹽濃度和蛋白質(zhì)等有機物的 吸光度值。0D260/0D280(R)體現(xiàn)了 RNA中的蛋白質(zhì)等有機物的污染程度，質(zhì)量較好的DNA 的R值應在1. 8-2. 0之間，當R < 1. 8時，溶液中的蛋白質(zhì)等有機物的污染比較明顯；當R > 2. 2時，說明有RNA的污染。
[0049] 10、將 DNA 用 IXTE 稀釋到 IOng/iil，保存在-20°C 備用。
[0050] 11、動物組織或者細胞樣本中DNA提取采用酚/氯仿法，詳細見《精編醫(yī)學分子生 物學實驗指導》（中國醫(yī)藥科技出版社，主編：傅俊江）
[0051] 二、RAPD 技術(shù) PCR 擴增
[0052] 1、設(shè)計并合成長度為10個核苷酸的高GC含量的引物，100% GC含量引物并進行 HPLC(高效液相色譜）純化后純度達95%左右，其它引物經(jīng)檢測純度均高。各條高GC含量 引物的名稱、序列見下表1 :
[0053] 表1各個高GC引物序列
[0054]

【權(quán)利要求】
1. SEQ ID NO. 1?3所示的3種核苷酸序列。
2. 檢測SEQ ID NO. 1?3任意一項所示核苷酸序列的試劑在制備金銀花檢測試劑中的 用途。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：所述檢測試劑包括擴增SEQ ID NO. 1?3 任意一項所不核苷酸序列的試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于：所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 5?6、 SEQ ID NO. 7?8或SEQ ID NO. 9?10所示的引物對。
5. -種檢測金銀花的試劑盒，其特征在于：包括檢測SEQ ID NO. 1?3任意一項所述 核苷酸序列的相關(guān)試劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑包括擴增SEQ ID NO. 1?3任 意一項所不核苷酸序列的試劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 5? 6、SEQ ID NO. 7?8或SEQ ID NO. 9?10所示的引物對。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述金銀花是產(chǎn)自美國休斯頓、廣東深 圳或四川樂山的金銀花。
9. 一種金銀花的檢測方法，其特征在于：包括如下步驟： a，提取金銀花樣本DNA :提取待檢樣本中的DNA ; b，檢測：用權(quán)利要求5?7任意一項所述的試劑盒檢測待檢樣本，即可。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于：所述金銀花是產(chǎn)自美國休斯頓、廣 東深圳或四川樂山的金銀花。
【文檔編號】C12N15/11GK104212909SQ201410505403
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】傅俊江 申請人:瀘州醫(yī)學院