一種魚類精巢組織總rna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種魚類精巢組織總RNA的提取方法，將魚類精巢組織經(jīng)液氮速凍，Trizol裂解液處理后勻漿、過濾、離心，經(jīng)蛋白酶K消化、氯仿-正丁醇混合液萃取后，再經(jīng)異丙醇-醋酸鈉沉淀，DNA酶處理后，經(jīng)洗滌而獲得魚類精巢組織總RNA。本發(fā)明所述提取方法可避免魚類精巢組織中的大量的蛋白成分和結(jié)締組織對RNA提取的影響，獲得純度穩(wěn)定、完整性好、重復(fù)性高、無污染的RNA分離純化方法。
【專利說明】一種魚類精巢組織總RNA的提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及魚類總RNA的提取，具體地說，涉及一種魚類精巢組織總RNA的提取方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 總RNA分離純化技術(shù)是分子生物學(xué)研究技術(shù)的基礎(chǔ)，從組織中提取純度穩(wěn)定、完 整性好、重復(fù)性高、無污染的總RNA的分離純化方法，是決定后續(xù)實驗結(jié)果質(zhì)量的關(guān)鍵，一 些特定的部位使用通用的RNA分離純化方法，往往不能滿足要求，需要相應(yīng)的處理與提取 制備方法。
[0003] 魚類精巢組織內(nèi)含有大量的蛋白成分（精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子等）和結(jié)締組 織，采用常規(guī)RNA分離純化方法，在抽提的過程中容易蛋白污染，而且操作過程中樣本不易 研磨，裂解時易產(chǎn)生粘稠膠團(tuán)，造成抽提過程中RNA的降解和得率偏低。由于存在上述問 題，使魚類精巢組織總RNA難以穩(wěn)定的分離和純化。
[0004] 目前，有針對性的分離純化魚精巢組織總RNA的方法較少，用傳統(tǒng)方法處理魚精 巢組織研磨不充分、裂解易形成粘稠膠團(tuán)、提取的總RNA濃度低、穩(wěn)定性差、污染率高，無法 滿足后續(xù)實驗的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種適用于魚類精巢組織 總RNA的提取方法。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種魚類精巢組織總RNA的提取方法，具體為：將魚類精巢組織經(jīng)液氮速凍， Trizol裂解液處理后勻漿、過濾、離心，經(jīng)蛋白酶K消化、氯仿-正丁醇混合液萃取后，再經(jīng) 異丙醇-醋酸鈉沉淀，DNA酶處理后，經(jīng)洗滌而獲得魚類精巢組織總RNA。
[0008] 進(jìn)一步地，所述Trizol裂解液使用前加入β -巰基乙醇和/或8-羥基喹啉，使其 在所述Trizol裂解液中的體積濃度分別為1. 0-2. 5%和0. 10-0. 15%。由于Trizol裂解 液本身含有〇. 10%的8-羥基喹啉，因此也可不再加入8-羥基喹啉。但為了更好的抑制內(nèi) 源RNA酶活性，減少RNA的降解，還可有效的排除核蛋白、色素等物質(zhì)的干擾，在Trizol裂 解液使用前加入〇. 05% 8-羥基喹啉，使其在Trizol裂解液中的體積濃度達(dá)到0. 15%。
[0009] 進(jìn)一步地，所述過濾使用35-40目濾網(wǎng)過濾。
[0010] 作為優(yōu)選，所述氯仿-正丁醇混合液使用量為l/4Trizol體積。
[0011] 進(jìn)一步地，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿與正丁醇的體積比為24:1。
[0012] 進(jìn)一步地，在使用異丙醇-醋酸鈉沉淀RNA前，加入RNase-free的脂質(zhì)體。
[0013] 進(jìn)一步地，在經(jīng)異丙醇-醋酸鈉沉淀時，異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1。
[0014] 進(jìn)一步地，所述提取方法具體包括以下步驟：
[0015] 1)取魚類精巢組織，無菌RNase-free水清洗后放入液氮中速凍，超低溫凍存；
[0016] 2)將凍存樣本轉(zhuǎn)入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，勻漿后置于冰中， 超聲破碎，過濾，離心，取上清；
[0017] 3)加入RNase-free水稀釋，再加入蛋白酶K，振蕩搖勻，離心，取上清；
[0018] 4)加入氯仿和正丁醇混合液，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置，離心，取 上清；
[0019] 5)加入 RNase-free 的脂質(zhì)體；
[0020] 6)加入與步驟5)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻，離心，棄上清 液；
[0021] 7)用預(yù)冷的乙醇懸浮沉淀，離心，棄去乙醇，瞭干，加入RNase-free水充分溶解；
[0022] 8)加入 RNase-free DNase 緩沖液、RNase-free DNA 酶、RNA 酶抑制劑和 RNase-free水，處理40_50min，得到DNA酶處理液；
[0023] 9)加入乙二胺四乙酸，加熱處理滅酶活，隨后依次加入RNase-free水、醋酸鈉和 預(yù)冷的無水乙醇，混勻后放置15_25min,離心,棄上清；
[0024] 10)用預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清，室溫封閉靜置5-10min，晾干，加入 RNase-free水或0· 5%的SDS溶液充分溶解，-80°C保存。
[0025] 更進(jìn)一步地，所述提取方法具體包括以下步驟：
[0026] 1)取60_80mg魚類精巢組織，無菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速 凍，_80°C超低溫凍存；
[0027] 2)將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free電動勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎8-10s，間隔15-20s，超聲破碎 8-10s，使用35-40目過濾網(wǎng)過濾一次，17000-19000g 4°C離心5min，取上清；
[0028] 3)加入450 μ I RNase-free水，加入蛋白酶K 50 μ 1，振蕩搖勻后56°C水浴30min， 17000-19000g 4°C離心 lOmin，取上清；
[0029] 4)加入氯仿和正丁醇混合液450_500μ 1，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜 置 5min，12000g 4°C離心 IOmin,取上清；
[0030] 5)加入5 μ g RNase-free的脂質(zhì)體，用針頭抽吸上清2-3次；
[0031] 6)加入與步驟5)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻-20°C放置 60min，12000g 4°C離心15min，棄上清液，管底部會出現(xiàn)少量沉淀；所述異丙醇-醋酸鈉混 合液中異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1，醋酸鈉濃度2mol/L，所述醋酸鈉溶液的pH = 5. 2 ;
[0032] 7)用75%已預(yù)冷的乙醇800-1000μ 1均勻懸浮漂洗沉淀，12000g4°C離心5min，棄 去乙醇，室溫封閉靜置5-10min,晾干,加入RNase-free水20 μ 1充分溶解；
[0033] 8)加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液、2 μ 1 的 RNase-free DNA 酶、2. 5 μ 1 的 RNA酶抑制劑和20. 5 μ I RNase-free水，37°C處理40-50min，得到DNA酶處理液；
[0034] 9)加入2. 5 μ 1濃度為0. 5mol/L乙二胺四乙酸，混勻78-82°C加熱處理3min，隨后 依次加入RNase-free水47. 5 μ 1、10 μ 1濃度為3. 5mol/L醋酸鈉和250 μ 1已預(yù)冷的無水 乙醇，混勻后_80°C放置15-25min，12000g 4°C離心lOmin，棄上清；
[0035] 10)用75%已預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，12000g 4°C離心5min，棄上清，室溫封閉靜置 5-10min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液20-30 μ 1充分溶解，-80°C保存。
[0036] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0037] 本發(fā)明提供一種魚類精巢組織總RNA的提取方法，可避免魚類精巢組織中的大量 的蛋白成分和結(jié)締組織對RNA提取的影響，獲得純度穩(wěn)定、完整性好、重復(fù)性高、無污染的 RNA分離純化方法。
[0038] 本發(fā)明通過在Trizol中加入2.5%的β-巰基乙醇和0.05%的8-羥基喹啉，可 在裂解過程中有效抑制內(nèi)源RNA酶活性，減少RNA的降解，還可有效的排除核蛋白、色素等 物質(zhì)的干擾。Trizol中加入β -巰基乙醇和8-羥基喹啉，用來抑制RNA酶活性，本申請根 據(jù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在處理富含RNA酶的組織時，Trizol加入2. 5%的β -巰基乙醇和0. 05% 的8-羥基喹啉協(xié)同作用效果最好，可有效的抑制內(nèi)源性RNA酶，并有效排除核蛋白和色素 等的干擾。
[0039] 本發(fā)明將冷凍樣本在Trizol中勻漿后，使用超聲破碎進(jìn)行處理，能夠更好的裂解 細(xì)胞，使RNA充分游離到液相中。液氮研磨法破碎樣本，由于液氮極易揮發(fā)，研磨過程中要 不斷的向研缽中加入液氮，耗費時間長，操作不方便，有安全隱患，而對凍存樣本進(jìn)行電動 勻漿，勻漿后再使用超聲破碎，細(xì)胞破碎速度快，勻漿徹底，操作簡單安全，縮短了處理時 間，有效減少RNA的降解。
[0040] 本發(fā)明在勻漿破碎后，使用35-40目濾網(wǎng)過濾一次，可有效去除裂解過程中產(chǎn)生 的絮狀沉淀物。裂解和勻漿過程中，Trizol與蛋白（精原細(xì)胞、精母細(xì)胞等）、細(xì)胞壁、結(jié)締 組織等產(chǎn)生的絮狀沉淀物，容易影響后續(xù)實驗，使用35-40目濾網(wǎng)過濾可去除。
[0041] 本發(fā)明對過濾液使用蛋白酶K進(jìn)行處理，結(jié)合過濾方法，可有效去除勻漿液中的 蛋白成分。由于精巢中蛋白含量高，使用過濾方法不能完全去除，勻漿階段使用蛋白酶K進(jìn) 行處理，為了提高處理效果向Trizol中加入水，可防止向Trizol液中直接加入蛋白酶K而 降低酶的活性，普通組織中蛋白酶K(QIAGEN公司）的用量為20-30 μ 1，實驗中用量增加至 50 μ 1可提高酶的處理效率。
[0042] 本發(fā)明在Trizol裂解液處理后，離心力增加至17000-19000g，可有效沉降破碎細(xì) 胞壁、雜質(zhì)等。
[0043] 本發(fā)明使用氯仿與正丁醇混合液（24:1)，可提高蛋白、DNA和RNA的分離效果，保 證RNA的純度和完整性。常規(guī)提取過程中，抽提時使用氯仿或氯仿異戊醇混合物，使用量約 為l/5Trizol體積，改用氯仿與正丁醇混合物，比例為24:1，使用量增加至1/4體積可以有 效提高處理效率，利于水相、蛋白相和有機(jī)相的分離，且異戊醇的毒性較大，改用正丁醇可 降低毒性，保護(hù)操作人員。
[0044] 本發(fā)明在沉淀RNA之前，加入RNase-free的脂質(zhì)體，可有效析出RNA，提高RNA得 率。
[0045] 本發(fā)明將常規(guī)方法中的異丙醇沉淀步驟改為使用異丙醇-醋酸鈉混合液（異丙 醇：醋酸鈉=4:1)沉淀，處理條件為-20°C放置60min，，沉淀RNA。在加入異丙醇同時加 入醋酸鈉，沉淀RNA的同時溶解多糖類物質(zhì)，使它們有效分離。醋酸鈉等高鹽溶液可在提 取過程中加入，用于去除多糖和析出RNA，一般加入的體積為10%，濃度一般為3mol/L(終 濃度0. 3mol/L)，處理條件一般為-20°C放置3小時，本申請根據(jù)實驗發(fā)現(xiàn)在加入異丙醇階 段，醋酸鈉加入量增加至20%且濃度降低至2111 〇1/1(終濃度0.4111〇1/1)，處理條件為-201： 放置60min，可提高沉淀并溶解多糖類物質(zhì)的效率，而RNA析出階段醋酸鈉濃度也增加至 3. 5mol/L，可有效析出RNA。
[0046] 本發(fā)明將一般乙醇處理過程中7000_8000g的離心力增加至12000g，能夠更好地 沉淀RNA，較大的離心力使RNA粘附于管底，去除上清的時候利于操作。
[0047] 本發(fā)明引入DNA酶處理步驟，將消化時間延長至40-50min，可提高DNA酶處理效 率，更徹底的去除基因組DNA污染。DNA酶的失活使用78-82°C熱處理3min，使DNA酶失活 更加徹底，利于后續(xù)的分離與純化，相對于氯仿抽提法，縮短了處理時間，有效減少RNA在 純化中的降解。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048] 圖1為本發(fā)明所述方法提取的魚類精巢組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0049] 圖2為本發(fā)明所述方法提取的魚類精巢組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，對β -actin基因 進(jìn)行PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0050] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0051] 實施例1
[0052] 本實施例所述魚類精巢組織總RNA的提取方法具體步驟如下：
[0053] 1.用手術(shù)工具取60mg魚類精巢組織，無菌RNase-free (無 RNA酶）水清洗后迅速 放入液氮中速凍，超低溫（_80°C )凍存。
[0054] 2.將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free電動勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎8s，間隔15s，超聲破碎8s，使 用35目過濾網(wǎng)過濾一次，170004°C離心5min，吸上清至離心管A中。
[0055] 注：Trizol裂解液（TRIzol的主要成分是苯酚，還包含異硫氰酸胍、十二烷基肌氨 酸鈉、醋酸鈉等，Life technologies公司），Trizol裂解液使用前加入25 μ 1 β -巰基乙醇 和0. 5 μ 1的8-羥基喹啉。
[0056] 注：過濾網(wǎng)目數(shù)，是指物料的粒度或粗細(xì)度，一般定義是指在1英寸*1英寸（1英 寸=25. 4mm)的面積內(nèi)有多少個網(wǎng)孔數(shù)，即篩網(wǎng)的網(wǎng)孔數(shù)，35目篩孔尺寸：0.5mm，40目篩孔 尺寸：0· 425_。
[0057] 3.向離心管A中加入450 μ I RNase-free水，加入蛋白酶K 50 μ 1(QIAGEN公司）， 振蕩搖勻后56°C水浴30min，17000g 4°C離心lOmin，吸取上清液至離心管B中。
[0058] 4.離心管B中加入氯仿和正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=24:1)450 μ 1 (約為混 合液體積的1/4)，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置5min，12000g 4°C離心lOmin， 吸取上清液至離心管C中。
[0059] 5.向上清中加入5 μ g RNase-free的脂質(zhì)體，用4. 5號針頭（搭配Iml注射器） 抽吸上清2次。
[0060] 6.向離心管C中加入上清等體積的異丙醇醋酸鈉混合液（異丙醇：醋酸鈉=4:1， 醋酸鈉濃度2mol/L)，振蕩搖勻-20°C放置60min，12000g 4°C離心15min，棄上清液，管底部 會出現(xiàn)少量沉淀。
[0061] 7.用75%已預(yù)冷的乙醇800μ 1均勻懸浮漂洗沉淀，12000g 4°C離心5min，棄去 乙醇，室溫封閉靜置5min,晾干,加入RNase-free水20 μ 1充分溶解。
[0062] 8.向 RNA 溶液中加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液（10 XDNase I Buffer，寶 生物公司）、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶（5υ/μ I RNase-free Recombinant DNase I，寶生 物公司）、2· 5μ I 的 RNA 酶抑制劑（20U/μ I RNase Inhibitor，Life technologies 公司） 和 20. 5 μ I RNase-free 水，37°C處理 40min，得到 DNA 酶處理液。
[0063] 9.向DNA酶處理液中加入2. 5μ 1 0. 5mol/L乙二胺四乙酸，混勻78°C加熱處理 3min，隨后依次加入RNase-free水47. 5 μ 1、10 μ 1濃度為3. 5mol/L醋酸鈉和250 μ 1已預(yù) 冷的無水乙醇，混勻后-80°C放置15min，12000g 4°C離心lOmin，棄上清。
[0064] 10.用75%已預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，12000g 4°C離心5min，棄上清，室溫封閉靜置 5min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液20 μ 1充分溶解，-80°C保存。
[0065] 本發(fā)明提取并純化獲得的魚類精巢組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，28s 條帶亮度是18s亮度的二倍，同時測得的魚類精巢總RNA濃度為300-500ng/μ 1，吸光度 0D260/0D280的比值穩(wěn)定在1. 8-2. 0之間，說明獲得的總RNA純度高、完整性佳、無 DNA和蛋 白污染。
[0066] 本發(fā)明提取后的魚類精巢組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，對β -actin基因進(jìn)行了 PCR擴(kuò) 增，瓊脂糖電泳凝膠檢測結(jié)果如圖2 :電泳條帶完整、清晰、特異性好，說明此總RNA能滿足 后續(xù)的RT_PCR、Real Time RT-PCR、Northern blot、體外翻譯和分子克隆等多種下游實驗。
[0067] 實施例2
[0068] 本實施例所述魚類精巢組織總RNA的提取方法具體步驟如下：
[0069] 1.用手術(shù)工具取80mg魚類精巢組織，無菌RNase-free (無 RNA酶）水清洗后迅速 放入液氮中速凍，超低溫（_80°C )凍存。
[0070] 2.將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free電動勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎10s，間隔20s，超聲破碎10s， 使用40目過濾網(wǎng)過濾一次，19000g4°C離心5min，吸上清至離心管A中。
[0071] 注：Trizol裂解液（TRIzol的主要成分是苯酚，還包含異硫氰酸胍、十二烷基肌氨 酸鈉、醋酸鈉等，Life technologies公司），Trizol裂解液使用前加入25 μ 1 β -巰基乙醇 和0. 5 μ 1的8-羥基喹啉。
[0072] 注：過濾網(wǎng)目數(shù)，是指物料的粒度或粗細(xì)度，一般定義是指在1英寸*1英寸（1英 寸=25. 4mm)的面積內(nèi)有多少個網(wǎng)孔數(shù)，即篩網(wǎng)的網(wǎng)孔數(shù)，35目篩孔尺寸：0.5mm，40目篩孔 尺寸：0· 425_。
[0073] 3.向離心管A中加入450 μ I RNase-free水，加入蛋白酶K 50 μ 1(QIAGEN公司）， 振蕩搖勻后56°C水浴30min，19000g 4°C離心10min，吸取上清液至離心管B中。
[0074] 4.離心管B中加入氯仿和正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=24:1) 500 μ 1 (混合液 體積的1/4)，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置5min，12000g 4°C離心10min，吸取 上清液至離心管C中。
[0075] 5.向上清中加入5 μ g RNase-free的脂質(zhì)體，用4. 5號針頭（搭配Iml注射器） 抽吸上清3次。
[0076] 6.向離心管C中加入上清等體積的異丙醇醋酸鈉混合液（異丙醇：醋酸鈉=4:1， 醋酸鈉濃度2mol/L)，振蕩搖勻-20°C放置60min，12000g 4°C離心15min，棄上清液，管底部 會出現(xiàn)少量沉淀。
[0077] 7.用75%已預(yù)冷的乙醇100(^1均勻懸浮漂洗沉淀，1200(^41：離心51^11，棄去 乙醇，室溫封閉靜置IOmin,晾干,加入RNase-free水20 μ 1充分溶解。
[0078] 8.向 RNA 溶液中加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液（10 XDNase I Buffer，寶 生物公司）、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶（5υ/μ I RNase-free Recombinant DNase I，寶生 物公司）、2· 5μ 1 的 RNA 酶抑制劑（20U/μ I RNase Inhibitor，Life technologies 公司） 和 20. 5 μ I RNase-free 水，37°C處理 50min，得到 DNA 酶處理液。
[0079] 9.向DNA酶處理液中加入2. 5μ 1 0. 5mol/L乙二胺四乙酸，混勻82°C加熱處理 3min，隨后依次加入RNase-free水47. 5 μ 1、10 μ 1濃度為3. 5mol/L醋酸鈉和250 μ 1已預(yù) 冷的無水乙醇，混勻后_80°C放置25min，12000g 4°C離心10min，棄上清。
[0080] 10.用75%已預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，12000g 4°C離心5min，棄上清，室溫封閉靜置 10min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液30 μ 1充分溶解，-80°C保存。
[0081] 本發(fā)明提取并純化獲得的魚類精巢組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，28s 條帶亮度是18s亮度的二倍，同時測得的魚類精巢總RNA濃度為300-500ng/μ 1，吸光度 0D260/0D280的比值穩(wěn)定在1. 8-2. 0之間，說明獲得的總RNA純度高、完整性佳、無 DNA和蛋 白污染。
[0082] 本發(fā)明提取后的魚類精巢組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，對β -actin基因進(jìn)行了 PCR擴(kuò) 增，瓊脂糖電泳凝膠檢測結(jié)果如圖2 :電泳條帶完整、清晰、特異性好，說明此總RNA能滿足 后續(xù)的RT_PCR、Real Time RT-PCR、Northern blot、體外翻譯和分子克隆等多種下游實驗。 [0083] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種魚類精巢組織總RNA的提取方法，其特征在于，將魚類精巢組織經(jīng)液氮速凍， Trizol裂解液處理后勻漿、過濾、離心，后依次經(jīng)蛋白酶K消化及氯仿-正丁醇混合液萃取， 再經(jīng)異丙醇-醋酸鈉沉淀及DNA酶處理后經(jīng)洗滌獲得魚類精巢組織總RNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Trizol裂解液使用前加入 β -巰基乙醇和8-羥基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的體積濃度分別為1. 0-2. 5 %和 0· 10-0. 15%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述過濾使用35-40目濾網(wǎng)過濾。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液使用量為 l/4Trizol 體積。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液中 氯仿與正丁醇的體積比為24:1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，在使用異丙醇-醋酸鈉沉淀RNA前， 加入RNase-free的脂質(zhì)體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，經(jīng)異丙醇-醋酸鈉沉淀時，異丙醇與 醋酸鈉的體積比為4:1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 取魚類精巢組織，無菌RNase-free水清洗后放入液氮中速凍，超低溫凍存； 2) 將凍存樣本轉(zhuǎn)入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，勻漿后置于冰中，超聲 破碎，過濾，離心，取上清； 3) 加入RNase-free水稀釋，再加入蛋白酶K，振蕩搖勻，離心，取上清； 4) 加入氯仿和正丁醇混合液，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置，離心，取上 清； 5) 加入RNase-free的脂質(zhì)體； 6) 加入與步驟5)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻，離心，棄上清液； 7) 用預(yù)冷的乙醇懸浮沉淀，離心，棄去乙醇，瞭干，加入RNase-free水充分溶解； 8) 加入 RNase-free DNase 緩沖液、RNase-free DNA 酶、RNA 酶抑制劑和 RNase-free 水，處理40-50min，得到DNA酶處理液； 9) 加入乙二胺四乙酸，加熱處理滅酶活，隨后依次加入RNase-free水、醋酸鈉和預(yù)冷 的無水乙醇,混勻后放置15-25min,離心,棄上清； 10) 用預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清，室溫封閉靜置5-10min，晾干，加入 RNase-free水或0· 5%的SDS溶液充分溶解，-80°C保存。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 取60-80mg魚類精巢組織，無菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速凍，-80°C 超低溫凍存； 2) 將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free電動勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎8-10s，間隔15-20s，超聲破碎 8-10s，使用35-40目過濾網(wǎng)過濾一次，17000-19000g 4°C離心5min，取上清； 3) 加入450μ1 RNase-free水，加入蛋白酶K 50μ1，振蕩搖勻后56°C水浴30min， 17000-19000g 4°C離心 lOmin，取上清； 4) 加入氯仿和正丁醇混合液450-500 μ 1，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置 5min，12000g 4°C離心 lOmin，取上清； 5) 加入5 μ g RNase-free的脂質(zhì)體，用針頭抽吸上清2-3次； 6) 加入與步驟5)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻-20°C放置60min， 12000g 4°C離心15min，棄上清液，管底部會出現(xiàn)少量沉淀；所述異丙醇-醋酸鈉混合液中 異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1，醋酸鈉濃度2mol/L，所述醋酸鈉溶液的pH = 5. 2 ; 7) 用75%已預(yù)冷的乙醇800-1000 μ 1均勻懸浮漂洗沉淀，12000g4°C離心5min，棄去乙 醇，室溫封閉靜置5-10min,晾干,加入RNase-free水20 μ 1充分溶解； 8) 加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液、2 μ 1 的 RNase-free DNA 酶、2. 5 μ 1 的 RNA 酶抑制劑和20. 5 μ I RNase-free水，37°C處理40-50min，得到DNA酶處理液； 9) 加入2. 5 μ 1濃度為0· 5mol/L乙二胺四乙酸，混勻78-82°C加熱處理3min，隨后依次 加入RNase-free水47. 5 μ 1、10 μ 1濃度為3. 5mol/L醋酸鈉和250 μ 1已預(yù)冷的無水乙醇， 混勻后_80°C放置15-25min，12000g 4°C離心lOmin，棄上清； 10) 用75%已預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，12000g 4°C離心5min，棄上清，室溫封閉靜置 5-10min，晾干，加入RNase-free水或0. 5%的SDS溶液20-30 μ 1充分溶解，-80°C保存。
【文檔編號】C12N15/10GK104212796SQ201410505252
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】楊曉飛, 徐紹剛, 李文通, 袁丁, 楊貴強(qiáng), 馬峻峰 申請人:北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所