一種達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞冷凍保存液及精巢細(xì)胞冷凍保存方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及達(dá)氏舞的細(xì)胞保存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存 液及精巢細(xì)胞冷凍保存方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在雄性性腺中，精子起源于精原干細(xì)胞（SSCs)，精原干細(xì)胞既具有自我復(fù)制能力， 又具有分化成為成熟精子的能力。哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生于生精小管內(nèi)。在鼠科中，人們已經(jīng) 在功能上證實(shí)部分A型精原細(xì)胞存在于輸精管基底膜，并通過化療、放療和移植技術(shù)完成 了具有干性的評估。在魚的精巢內(nèi)，精子發(fā)生在精小囊中。生殖細(xì)胞存在于支持細(xì)胞的胞質(zhì) 延伸形成精小囊內(nèi)，并且每個(gè)精小囊生殖細(xì)胞增殖的同時(shí)發(fā)生分化。這種單個(gè)生殖細(xì)胞，叫 做A型精原細(xì)胞，人們推測這些細(xì)胞的亞群表現(xiàn)出干細(xì)胞效力。2006年，日本學(xué)者Okutsu 等建立了虹鱒的精原細(xì)胞移植技術(shù)。將A型精原細(xì)胞的一部分移植到腹膜受體虹鱒胚胎， 向受體胚胎生殖腺移動(dòng)，并在其內(nèi)增殖，然后產(chǎn)生了大量功能性的精子。這些結(jié)果在功能上 證實(shí)魚精巢中存在精原干細(xì)胞。此外，Okutsu還發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞合并到雌魚卵巢中，分化為 功能齊全的卵，表明整合的精原細(xì)胞具有雙性潛能。最后，正常生物個(gè)體可以通過來自供體 精原細(xì)胞形成的配子受精產(chǎn)生。2007年，代理親魚技術(shù)建立，可將精原細(xì)胞異種移植入近緣 種。通過這種技術(shù)，可將苗種生產(chǎn)昂貴、世代時(shí)間長的大型魚類的精原細(xì)胞移植到親緣關(guān)系 相近但體型較小，世代時(shí)間較短的魚種中，縮短世代時(shí)間。用于移植的精原細(xì)胞需要保證穩(wěn) 定供應(yīng)，并具有一致品質(zhì)。通常，從活體上獲取的組織在維持其技能的狀態(tài)下儲藏是有期限 的，為了延長儲藏時(shí)間，可利用細(xì)胞冷凍保存方法。
[0003] 目前尚未見達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明提供的達(dá)氏舞精巢細(xì)胞 冷凍保存液及保存方法，在達(dá)氏舞精巢細(xì)胞超低溫保存過程中，可最大限度降低冰晶對細(xì) 胞的損傷。保證復(fù)蘇后的高存活率和增殖率，為今后達(dá)氏舞精原細(xì)胞移植提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是在于提供了一種達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存液，配方合理，使用方便， 適合對達(dá)氏舞精巢細(xì)胞的保存，是達(dá)氏舞精巢細(xì)胞超低溫保存和進(jìn)行細(xì)胞移植所必須的一 種溶液。
[0005] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存方法，利用該方法對達(dá)氏 舞精巢細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，能夠提高精巢細(xì)胞存活率，為達(dá)氏舞精原細(xì)胞移植提供長期穩(wěn) 定的細(xì)胞供應(yīng)。
[0006] 本發(fā)明最后一個(gè)目的是提供一種達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存液在達(dá)氏舞精巢細(xì)胞 冷凍保存中的應(yīng)用。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0008] -種達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存液，包括：
[0009] 牛血清白蛋白(BSA) 37.5-62.5mg/ml 海藻糖 40..ei0inrri〇l/L 乙二醇(EG) 100m!/L. 卵磷脂 OWg/L 胎牛血清 100-400ml/L
[0010] 其余為L-15培養(yǎng)液；
[0011] 所述的冷凍保存液pH為7. 5-8. 5。
[0012] 一種達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存液，包括（較好范圍）：
[0013] 牛血清白蛋白(BSA) 42.5-57.5mg/ml 海_糖： 45-55mmoi/l. .乙二醇(EG) 100ml/L 卵磷脂 1-l.lg/L. 眙牛血清 ISO;-3S0m丨八
[0014] 其余為L-15培養(yǎng)液；
[0015] 所述的冷凍保存液pH為7. 7-8. 3。
[0016] -種達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存液，包括（優(yōu)選范圍）：
[0017] 牛血清白蛋白(BSA) 45-55mg/ml 海藻糖 47.5-52.5mmol,/L 乙二醇(EG) lODml/L 卵磷脂 5-10g/L 胎牛血清 175-270ml/L
[0018] 其余為L-15培養(yǎng)液；
[0019] 所述的冷凍保存液pH為7. 8-8. 2。
[0020] 一種達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存液，包括（最佳范圍）：
[0021] 牛血清白蛋白(BSft): 4B-S2mg/ml 海藻糖 49~5:l.mmol/L 乙二醇(EG) 100ml/L 卵磷脂 ：7.:5-:8.5:g/L 胎牛血清 li30-220ml/L.
[0022] 其余為L-15培養(yǎng)液；
[0023] 所述的冷凍保存液pH為7· 8-8. 1。
[0024] -種達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存液，包括（最佳值）：
[0025] 牛血清白蛋白(BSA) S0mg/ml 海藻糖 50mmol/L 乙 IhEG) IQOml/L 卵磷脂 8g/L 胎牛血清 200m丨八.
[0026] 其余為L-15培養(yǎng)液；
[0027] 所述的冷凍保存液pH為8. 0。
[0028] 以上保存液的pH通過1M NaHC03或25mM HEPES調(diào)節(jié)。
[0029] -種達(dá)氏舞精巢細(xì)胞凍存稀釋液的制備方法，其步驟是：
[0030] (1)用移液槍精確量取配置稀釋液所需各液體組分的體積：
[0031] 根據(jù)公式：量取體積=配方濃度X稀釋液總體積
[0032] 1)量取L-15培養(yǎng)液加入到離心管中，體積約為需要配制稀釋液體積的三分之二；
[0033] 2)根據(jù)需要配制稀釋液體積，量取乙二醇、胎牛血清所需體積加入到L-15培養(yǎng)液 中。
[0034] (2)精確稱取稀釋液所需固體組分的重量，精確度為0.0 Olg :
[0035] 根據(jù)公式：量取重量=配方濃度X稀釋液總體積
[0036] 根據(jù)需要配制稀釋液體積，稱取牛血清白蛋白、海藻糖、卵磷脂，溶于稀釋液中。
[0037] (3)加 L-15培養(yǎng)液定容至所需溶液體積。0. 2 μ m濾膜過濾除菌?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
[0038] 達(dá)氏舞精巢細(xì)胞冷凍保存方法，包括以下步驟：
[0039] 1)清洗干凈的精巢組織移到另一培養(yǎng)皿中，將精巢組織剪碎至小塊。稱量組織塊， 以消化液：組織塊=4:l(v/w)的比例添加0. 25%胰蛋白酶消化液，20°C培養(yǎng)箱中消化，每 30min吹打一次。
[0040] 2)將步驟1)中的精巢組織消化3h后，加 L-15培養(yǎng)基+20%胎牛血清終止消化， 4〇4111濾網(wǎng)過濾。4°(：，20(^離心51^11。冷凍保存液重懸。
[0041] 3)用冷凍保存液以1 X 105個(gè)/ml稀釋細(xì)胞。
[0042] 4)取稀釋到標(biāo)準(zhǔn)濃度的細(xì)胞懸液5ml放置于冰上平衡20min，分裝至凍存管中；
[0043] 5)程序降溫：降溫程序從0°C開始，以_1°C /min速率降至-80°C，-80°C平衡30min 后放入液氮中，在-196 °C中保存。
[0044] -種達(dá)氏舞冷凍保存液在冷凍保存達(dá)氏舞精巢細(xì)胞中的應(yīng)用，包括利用本發(fā)明的 提供的冷凍保存液配方進(jìn)行達(dá)氏舞的精巢細(xì)胞的冷凍保存。
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