驢的細(xì)管冷凍精液制作方法及應(yīng)用
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及驢的驢的細(xì)管冷凍精液制作。
[0002]技術(shù)背景:
采用假陰道法采集成年種公驢精液，經(jīng)品質(zhì)評定后，用5種不同冷凍保存液稀釋、平衡，冷凍保存制作細(xì)管冷凍精液，以篩選適宜的驢精液冷凍保存液和冷凍保護(hù)劑。結(jié)果表明:乳糖-葡糖-甘油-卵黃液為最佳種冷凍保存液(P (0.05);甘油為最佳冷凍保護(hù)劑，其適宜濃度為5%，精子凍后活率平均為0.36，畸形率<27.4%，頂體完整率82.2%，解凍后常溫下精子存活時間為8.2h。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
驢在馬匹改良中具有重要作用，驢細(xì)管冷凍精液(以下簡稱凍精)是指將采集到的驢的新鮮精液，經(jīng)過精液品質(zhì)檢測、原精液離心濃縮和添加特制冷凍稀釋保護(hù)液等特殊處理后，把精液封裝在微型(0.25ml)塑料細(xì)管內(nèi)，利用液氮為冷源，按特定的程序和冷凍速度進(jìn)行冷凍，使精液以凍結(jié)的形式保存于超低溫環(huán)境下，達(dá)到長期保存驢精液的目的。驢細(xì)管凍精的制作和使用，有利于擴(kuò)大優(yōu)良種公驢的改良覆蓋面和提高其利用率，驢細(xì)管凍精冷凍保存不受驢活體有限生命的限制，可最大限度的延長使用期限。
[0004]【具體實(shí)施方式】:
1.驢精液的采集:驢用假陰道法采精，采精前選擇發(fā)情明顯，性情溫順的母驢或母馬作為臺馬并保定在保定架內(nèi)，確保人畜安全，再把公驢牽到采精架，讓公驢爬跨發(fā)情臺畜數(shù)次，爬跨時采精員控制保護(hù)公驢陰，莖防止公驢與臺畜發(fā)生本交，當(dāng)公驢性興奮充分，陰莖充分勃起將陰莖導(dǎo)入準(zhǔn)備好的假陰道采精，當(dāng)公驢陰莖插入假陰道并抽動數(shù)次后即可射
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[0005]2.細(xì)管凍精制作設(shè)備:相差顯微鏡，分光光度計(jì)，普通離心機(jī)，MRS-3自動分裝機(jī)，程控冷凍儀，廣口液氮生物容器，液氮，微型塑料細(xì)管，拇指管，電冰箱，低溫操作柜，細(xì)管冷凍架，玻片，量筒，量杯，離心試管，恒溫水浴鍋，移液器和稀釋液等。
[0006]3.驢冷凍稀釋液的配制:用正交法篩選適合驢細(xì)管凍精使用的冷凍稀釋液，稀釋液的主要成分為:葡萄糖，甘氨酸，蔗糖，甘油，卵黃和蒸餾水，配制時稱量試劑必須準(zhǔn)確，試劑稱量后混合、完全溶解、濾紙過濾和消毒待用。
[0007]4.驢精液的處理:a.過濾:采集到的驢精液用經(jīng)消毒的脫脂紗布過濾，濾除雜質(zhì)和部分副性物。b.測量采精量:過濾后的驢精液用量筒測量采精量，記錄采精量。c.驢精子密度的測定:取驢精液樣品100微升，加入0.7%的氯化鈉溶液1900微升，充分混勻，放入分光光度計(jì)比色槽測定精子密度，記錄精子密度。d.檢查原精活力:取驢原精樣品5-10微升滴在載玻片上，用蓋玻片壓片在顯微鏡下觀察精子活力，精子活力60%以上的驢精液可用于制作細(xì)管凍精。e.驢精液稀釋后總量的確定，根據(jù)驢原精液活力、采精量、細(xì)管容積、精子密度和每劑量有效精子數(shù)(每劑量有效精子數(shù)1500-2000萬個)確定稀釋后精液的總量，計(jì)算公式為:稀釋液后精液總量=0.25*0.35*精子密度*采精量/0.15。
[0008]5.驢精液的離心濃縮:驢精液稀釋后精液總量的確定后，把驢精液分裝于刻度離心試管，放入離心機(jī)中，以2000轉(zhuǎn)/分的速度離心10?15分鐘，盡量吸出上清液，計(jì)量所吸出的上清液。
[0009]6.驢精液的稀釋:在吸去上清液的精液中加入冷凍稀釋液至稀釋后精液的總量并混勻，稀釋液的添加量等于稀釋液后精液總量減去離心去除上清液的數(shù)量。
[0010]7.精液的分裝，稀釋后的驢精液用MRS-3自動分裝機(jī)在實(shí)驗(yàn)室室溫下分裝在微型塑料細(xì)管內(nèi)，封口和印字。
[0011]8.驢細(xì)管精液的平衡，分裝后的細(xì)管精液放置于+4°C的溫度下保存4?12小時。
[0012]9.驢細(xì)管精液的冷凍，平衡后的驢精液在+4°C左右溫度下整齊放在細(xì)管冷凍架上，然后把細(xì)管冷凍架和精液放入程控冷凍儀冷凍，冷凍曲線為:+4°C至-100°C，冷凍速度為60°C /mn._100°C至_140°C，冷凍速度為20°C /mn，然后把凍結(jié)后的細(xì)管凍精浸入液氮中進(jìn)行超低溫凍結(jié)；廣口液氮生物容器冷凍:平衡后的驢精液在+4°C左右溫度下整齊放在細(xì)管冷凍架上，然后把細(xì)管冷凍架和精液放入-120?-140°C的液氮蒸汽中冷凍15-20分鐘，然后把凍結(jié)后的細(xì)管凍精浸入液氮中進(jìn)行超低溫凍結(jié)。
[0013]10.驢細(xì)管凍精的解凍檢查和保存:冷凍后的驢細(xì)管凍精隨機(jī)抽取1-2支，立即放入40±2°C的水浴中解凍,檢查解凍活力，解凍活力可達(dá)35?40%，解凍活力35%以上的驢細(xì)管凍精包裝放于液氮中長期保存。
[0014]11.驢細(xì)管凍精的使用，冷凍解凍后活力達(dá)35%以上的驢細(xì)管凍精即可用于人工授精，一個情期輸精兩次，每次使用細(xì)管凍精2?3支，總受胎率可達(dá)60?70%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.驢精液的采集，其特征是驢用假陰道法采精，采精前選擇發(fā)情明顯，性情溫順的母驢或母馬作為臺馬并保定在保定架內(nèi)，確保人畜安全，再把公驢牽到采精架，讓公驢爬跨發(fā)情臺畜數(shù)次，爬跨時采精員控制保護(hù)公驢陰，莖防止公驢與臺畜發(fā)生本交，當(dāng)公驢性興奮充分，陰莖充分勃起將陰莖導(dǎo)入準(zhǔn)備好的假陰道采精，當(dāng)公驢陰莖插入假陰道并抽動數(shù)次后即可射精。
2.細(xì)管凍精制作設(shè)備，其特征是相差顯微鏡，分光光度計(jì)，普通離心機(jī)，MRS-3自動分裝機(jī)，程控冷凍儀，廣口液氮生物容器，液氮，微型塑料細(xì)管，拇指管，電冰箱，低溫操作柜，細(xì)管冷凍架，玻片，量筒，量杯，離心試管，恒溫水浴鍋，移液器和稀釋液等。
3.驢冷凍稀釋液的配制，其特征是用正交法篩選適合驢細(xì)管凍精使用的冷凍稀釋液，稀釋液的主要成分為:葡萄糖，甘氨酸，蔗糖，甘油，卵黃和蒸餾水，配制時稱量試劑必須準(zhǔn)確，試劑稱量后混合、完全溶解、濾紙過濾和消毒待用。
4.驢精液的處理，其特征是a過濾:采集到的驢精液用經(jīng)消毒的脫脂紗布過濾，濾除雜質(zhì)和部分副性物，b測量采精量:過濾后的驢精液用量筒測量采精量，記錄采精量，c驢精子密度的測定:取驢精液樣品100微升，加入0.7%的氯化鈉溶液1900微升，充分混勻，放入分光光度計(jì)比色槽測定精子密度，記錄精子密度，d檢查原精活力:取驢原精樣品5-10微升滴在載玻片上，用蓋玻片壓片在顯微鏡下觀察精子活力，精子活力60%以上的驢精液可用于制作細(xì)管凍精，e驢精液稀釋后總量的確定，根據(jù)驢原精液活力、采精量、細(xì)管容積、精子密度和每劑量有效精子數(shù)(每劑量有效精子數(shù)1500-2000萬個)確定稀釋后精液的總量，計(jì)算公式為:稀釋液后精液總量=0.25*0.35*精子密度*采精量/0.15。
5.驢精液的離心濃縮，其特征是驢精液稀釋后精液總量的確定后，把驢精液分裝于刻度離心試管，放入離心機(jī)中，以2000轉(zhuǎn)/分的速度離心10?15分鐘，盡量吸出上清液，計(jì)量所吸出的上清液。
6.驢精液的稀釋，其特征是在吸去上清液的精液中加入冷凍稀釋液至稀釋后精液的總量并混勻，稀釋液的添加量等于稀釋液后精液總量減去離心去除上清液的數(shù)量。
7.精液的分裝，其特征是稀釋后的驢精液用MRS-3自動分裝機(jī)在實(shí)驗(yàn)室室溫下分裝在微型塑料細(xì)管內(nèi)，封口和印字。
8.驢細(xì)管精液的平衡，其特征是分裝后的細(xì)管精液放置于+4°C的溫度下保存4?12小時。
9.驢細(xì)管精液的冷凍，其特征是平衡后的驢精液在+4°C左右溫度下整齊放在細(xì)管冷凍架上，然后把細(xì)管冷凍架和精液放入程控冷凍儀冷凍，冷凍曲線為:+4°C至-10(TC，冷凍速度為60°C /mn._100°C至_140°C，冷凍速度為20°C /mn，然后把凍結(jié)后的細(xì)管凍精浸入液氮中進(jìn)行超低溫凍結(jié)；廣口液氮生物容器冷凍:平衡后的驢精液在+4°C左右溫度下整齊放在細(xì)管冷凍架上，然后把細(xì)管冷凍架和精液放入-120?_140°C的液氮蒸汽中冷凍15-20分鐘，然后把凍結(jié)后的細(xì)管凍精浸入液氮中進(jìn)行超低溫凍結(jié)。
10.驢細(xì)管凍精的解凍檢查和保存，其特征是冷凍后的驢細(xì)管凍精隨機(jī)抽取1-2支，立即放入40±2°C的水浴中解凍,檢查解凍活力，解凍活力可達(dá)35?40%，解凍活力35%以上的驢細(xì)管凍精包裝放于液氮中長期保存。
11.驢細(xì)管凍精的使用，其特征是冷凍解凍后活力達(dá)35%以上的驢細(xì)管凍精即可用于人工授精，一個情期輸精兩次，每次使用細(xì)管凍精2?3支，總受胎率可達(dá)60?70%左右。
【專利摘要】驢在馬匹改良中具有重要作用，驢細(xì)管冷凍精液（以下簡稱凍精）是指將采集到的驢的新鮮精液，經(jīng)過精液品質(zhì)檢測、原精液離心濃縮和添加特制冷凍稀釋保護(hù)液等特殊處理后，把精液封裝在微型（0.25ml)塑料細(xì)管內(nèi)，利用液氮為冷源，按特定的程序和冷凍速度進(jìn)行冷凍，使精液以凍結(jié)的形式保存于超低溫環(huán)境下，達(dá)到長期保存驢精液的目的。驢細(xì)管凍精的制作和使用，有利于擴(kuò)大優(yōu)良種公驢的改良覆蓋面和提高其利用率，驢細(xì)管凍精冷凍保存不受驢活體有限生命的限制，可最大限度的延長使用期限。
【IPC分類】A61D19-02, A01N1-02
【公開號】CN104542573
【申請?zhí)枴緾N201310496150
【發(fā)明人】趙家才, 毛翔光, 何永富, 李雯, 馬燕茹, 魯增榮, 雷衡, 李春平, 王春蘭, 孫開蘭
【申請人】云南省種畜繁育推廣中心, 云南恒翔家畜良種科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月22日