一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)基因方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，包括：農(nóng)桿菌的活化、農(nóng)桿菌感受態(tài)制備、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、煙草葉盤(pán)的制備和農(nóng)桿菌對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化步驟。本發(fā)明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草轉(zhuǎn)基因方法，發(fā)現(xiàn)LBA4404對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化效率比EHA105高；本方法不僅整體的操作過(guò)程較為簡(jiǎn)單，實(shí)施條件比較容易控制，轉(zhuǎn)化效率更高，具備很好的實(shí)用性。
【專利說(shuō)明】一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)基因方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)基因方方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 從自從1984年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來(lái)，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)日益得到廣泛的應(yīng)用， 它對(duì)于分子遺傳學(xué)研究和作物改良都具有特別重要的意義。截至目前，幾乎所有的作物都 開(kāi)展了轉(zhuǎn)基因研究，育種目標(biāo)涉及到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效兼抗性及多用途等諸多方面。一批抗 病、抗蟲(chóng)、抗逆、抗除草劑等轉(zhuǎn)基因作物已進(jìn)入商品化生產(chǎn)階段。煙草作為模式植物，具有生 命周期短、組織培養(yǎng)技術(shù)成熟、子代數(shù)量多的特點(diǎn)，在植物轉(zhuǎn)基因研究具有重要地位。盡管 目前植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)比較成熟，但是植物轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化效率不高是普遍的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo) 的煙草轉(zhuǎn)基因方法，具備轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一、農(nóng)桿菌的活化； 步驟二、農(nóng)桿菌感受態(tài)制備； 步驟三、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化； 步驟四、煙草葉盤(pán)的制備； 步驟五、農(nóng)桿菌對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。
[0005] 步驟一、農(nóng)桿菌的活化：于-70°c冰箱中取出保存的甘油菌LBA4404和H11105兩 種農(nóng)桿菌；用接種環(huán)劃線于含有利福平（Rif，50mg/L)的LB平板上，于光照培養(yǎng)箱中（28°C ) 倒置培養(yǎng)48小時(shí)；挑單菌落接種于含有利福平（Rif，50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，搖菌震 蕩培養(yǎng)（28°C，220轉(zhuǎn)/分）20小時(shí)左右； 步驟二、農(nóng)桿菌感受態(tài)制備：待菌液0D_約達(dá)到0. 5時(shí)，將菌液移入無(wú)菌的1. 5mL的離 心管中，4°C，4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清；于離心管仲加入500uL 0. 05M的冰預(yù)冷的 氯化鈣，將菌液懸浮混勻，靜止冰浴30分鐘；，4°C，4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清；于 離心管中加入0. 05M的氯化鈣100uL，4°C冰箱中存放備用； 步驟三、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化： 取0. lug左右的重組質(zhì)粒加入100uL的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴10分鐘；液氮 速凍5分鐘；立即轉(zhuǎn)入28°C的水浴鍋中，孵育5分鐘后，立即冰浴3-5分鐘；并在超凈臺(tái)中 加入500uL含有利福平（Rif，50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基；于搖床中震蕩培養(yǎng)（28°C，220轉(zhuǎn)/ 分）4-5小時(shí)；取出后涂在含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif的LB平板上面，28°C倒置培 養(yǎng)48小時(shí)左右至長(zhǎng)出單菌落為止；挑單菌落接種于含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif的 LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)（28°C，220轉(zhuǎn)/分)。經(jīng)菌液PCR鑒定后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)； 步驟四、煙草葉盤(pán)的制備： 從煙草無(wú)菌幼苗上摘取完全展開(kāi)的葉片，平鋪于稱量紙上，用手術(shù)刀將葉片的邊緣以 及主葉脈劃掉，將葉片切成0. 5平方厘米左右的葉盤(pán)，盡量創(chuàng)造更多的機(jī)械損傷； 步驟五、農(nóng)桿菌對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，包括以下步驟： 1) 含有重組表達(dá)載體的EHA105和LBA4404甘油菌菌株從-70°C取出，劃線于含有 50mg/L的Kan和50mg/L Rif的LB平板上面，28°C倒置培養(yǎng)，挑單菌落接種于2mL LB液體 培養(yǎng)基中，于28°C，220轉(zhuǎn)/分，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜； 2) 以1%的接種量接種于100mL LB液體培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；無(wú)菌狀態(tài) 下，4000rpm離心lOmin ;沉淀用20mT, MS液體培養(yǎng)基洗漆后，4000rpm離心lOmin，用20mL MS液體培養(yǎng)基懸??； 3) 將煙草葉盤(pán)放入菌液中，混合8-10min，使農(nóng)桿菌與葉盤(pán)組織傷口部位充分接觸。將 葉盤(pán)從農(nóng)桿菌懸浮液中取出，置于滅菌濾紙上吸干，然后置于MS固體培養(yǎng)基上，用封口膜 封好后，在28°C的培養(yǎng)室里共培養(yǎng)2天； 4) 把MS培養(yǎng)基上的煙草葉盤(pán)轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基，在25°C光照周期14h培養(yǎng)2-3周，每 隔5天換一次培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)接過(guò)程中注意要將葉盤(pán)的邊緣侵入到培養(yǎng)基里，以便葉盤(pán)吸收營(yíng) 養(yǎng)；待愈傷組織分化成苗后用解剖刀切取整體的小植株轉(zhuǎn)入裝有分化培養(yǎng)基MS分的廣口 瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)； 5) 植株長(zhǎng)大后，切除多余的愈傷組織保留整株的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中MS根中，讓其 生根；待再生幼苗根系發(fā)達(dá)后，開(kāi)蓋加入經(jīng)陽(yáng)光暴曬的自來(lái)水，培養(yǎng)4-7天；強(qiáng)化植株后，取 出植株，用無(wú)菌水洗掉幼苗根部的瓊脂再移栽到滅菌土的盆缽中，放置于室溫中培養(yǎng)煉苗 7-10天；待植株有新芽長(zhǎng)出現(xiàn)象后方可移至室外。
[0006] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)基因方法，通過(guò)研究 EHA105和LBA4404兩種農(nóng)桿菌對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)LBA4404比EHA105對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化效 率更高；本方法不僅整體的操作過(guò)程較為簡(jiǎn)單，實(shí)施起來(lái)較容易，而且能夠快速大量高效地 侵染植物組織，具備很好的實(shí)用性。

【具體實(shí)施方式】
[0007] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0008] 實(shí)施例1 一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)基因方法，由以下步驟來(lái)完成： 步驟一，農(nóng)桿菌的活化：于-70°C冰箱中取出保存的甘油菌LBA4404和H11105兩種農(nóng) 桿菌；用接種環(huán)劃線于含有利福平（Rif，50mg/L)的LB平板上，于光照培養(yǎng)箱中（28°C )倒 置培養(yǎng)48小時(shí)；挑單菌落接種于含有利福平（Rif，50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，搖菌震蕩 培養(yǎng)（28 °C，220轉(zhuǎn)/分）20小時(shí)左右。
[0009] 步驟二，農(nóng)桿菌感受態(tài)制備：將步驟一所獲得的菌液0D_約達(dá)到0. 5時(shí)，將菌液移 入無(wú)菌的1. 5mL的離心管中，4°C，4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清；于離心管仲加入500uL 0. 05M的冰預(yù)冷的氯化|丐，將菌液懸浮混勻，靜止冰浴30分鐘；4°C，4000轉(zhuǎn)/分，離心10分 鐘，棄上清；于離心管中加入〇. 05M的氯化鈣100uL，4°C冰箱中存放備用。
[0010] 步驟三，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：取〇. lug左右的重組質(zhì)粒(含有待轉(zhuǎn)化的目的基因） 加入100uL的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴10分鐘；液氮速凍5分鐘；立即轉(zhuǎn)入28°C的 水浴鍋中，孵育5分鐘后，立即冰浴3-5分鐘；并在超凈臺(tái)中加入500uL含有利福平（Rif， 50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基；于搖床中震蕩培養(yǎng)（28°C，220轉(zhuǎn)/分）4-5小時(shí)；取出后涂在含 有50mg/L的Kan和50mg/L Rif的LB平板上面，28°C倒置培養(yǎng)48小時(shí)左右至長(zhǎng)出單菌 落為止；挑單菌落接種于含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng) (28°C，220轉(zhuǎn)/分)。經(jīng)菌液PCR鑒定后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0011] 步驟四，煙草葉盤(pán)的制備：從煙草無(wú)菌幼苗上摘取完全展開(kāi)的葉片，平鋪于稱量紙 上，用手術(shù)刀將葉片的邊緣以及主葉脈劃掉，將葉片切成〇. 5平方厘米左右的葉盤(pán)，盡量創(chuàng) 造更多的機(jī)械損傷。
[0012] 步驟五，農(nóng)桿菌對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，需要分別進(jìn)行如下工作： X:含有目的基因（棉花ACC氧化酶基因，序列如SEQ ID NO. 1所示）的EHA105和 LBA4404菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（0D_=0. 5); S將步驟四中的葉盤(pán)放入含有目的基因的菌液中充分接觸，間斷性搖晃幾次。
[0013] 甚:將葉盤(pán)從農(nóng)桿菌懸浮液中取出，置于滅菌濾紙上吸干，然后置于MS固體培養(yǎng)基 上（葉片的光滑面朝上)，用封口膜封好后，在28°C的培養(yǎng)室里共培養(yǎng)2天。
[0014] ::?:葉盤(pán)轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基（MS+6-BA lmg/L+Km 100mg/L+Cp 500mg/L)，在 25°C光 照周期14h (20001ux)培養(yǎng)2-3周，每隔5天換一次培養(yǎng)基，即每隔4天轉(zhuǎn)接一次，根據(jù)愈 傷的生長(zhǎng)狀況調(diào)整卡霉素的濃度。轉(zhuǎn)接過(guò)程中注意要將葉盤(pán)的邊緣侵入到培養(yǎng)基里，以便 葉盤(pán)吸收營(yíng)養(yǎng)，而且轉(zhuǎn)接當(dāng)中要一直按照開(kāi)始時(shí)轉(zhuǎn)接的方式把葉片的光滑面朝上。
[0015] S待愈傷組織分化成苗后用解剖刀切取整體的小植株轉(zhuǎn)入裝有分化培養(yǎng)基MS分 的廣口瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0016] ⑧植株長(zhǎng)大后，切除多余的愈傷組織保留整株的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中MS根 (1/2 MS+Kan 100mg/L+NAA 0. 2mg/L)中，讓其生根。再生幼苗根系發(fā)達(dá)后，開(kāi)蓋加入經(jīng)陽(yáng)光 暴曬的自來(lái)水，培養(yǎng)4-7天。強(qiáng)化植株后，取出植株，用無(wú)菌水洗掉幼苗根部的瓊脂再移栽 到滅菌土的盆缽中，放置于室溫中培養(yǎng)煉苗7-10天。待植株有新芽長(zhǎng)出現(xiàn)象后方可移至室 夕卜。注意觀察整個(gè)過(guò)程轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)狀況，注意澆水，開(kāi)關(guān)燈等。
[0017] 實(shí)施例2 實(shí)施例1的轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定，由以下步驟來(lái)完成： 步驟一，轉(zhuǎn)基因煙草DNA的提取，需要分別進(jìn)行如下工作： (1)將2mL CTAB分離緩沖液加入10mL離心管中，置于65°C水浴中預(yù)熱。
[0018] (2)稱取1. 5g葉片，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎。
[0019] (3)取0. 2g粉末直接加入預(yù)熱的CTAB分離緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻。
[0020] (4 )樣品于65 °C保溫30分鐘。
[0021] (5)加等體積（2mL)的氯仿-異戊醇，輕輕顛倒混勻。
[0022] (6)室溫下lOOOOrpm離心10分鐘，移上清至另一新管中。
[0023] (7)加入2倍體積的100%乙醇或0. 7倍體積異丙醇，會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，_20°C放置 30 min 或-80°C放置 10min，12000rpm 離心 10 回收 DNA 沉淀。
[0024] (8)用70%乙醇清洗沉淀兩次，吹干后溶于適量的滅菌ddH20中或溶于1?1. 5mL TE 中，分裝后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025] 步驟二，轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定： 上游引物：5 ' -ATGGCTACTTTCCCAGTGAT-3 '， 下游引物：5' -TTAAGCTGTTGCAATGGGAG-3'， PCR體系為：lyL煙草DNA，上下游引物各lyL，Taq酶0· 2yL (5U/yL)，10xTaq酶 buffer 2yL，10mM dNTP 2yL, ddH20 12.5以1^，總體系為2(^1^
[0026] PCR 程序?yàn)椋?4°C，3min ;94°C，30s ;54°C，45s ;72°C，50s ;30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延 伸 lOmin。
[0027] PCR結(jié)果顯示，LBA4404轉(zhuǎn)化的83株煙草苗中有65株含有目的基因，轉(zhuǎn)化效率 為78. 3% ;EHA105轉(zhuǎn)化的98株煙草苗中有47株含有目的基因，轉(zhuǎn)化效率為48. 0% ;因此， LBA4404比EHA105對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化效率高。
【權(quán)利要求】
1. 一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一、農(nóng)桿菌的活化； 步驟二、農(nóng)桿菌感受態(tài)制備； 步驟三、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化； 步驟四、煙草葉盤(pán)的制備； 步驟五、農(nóng)桿菌對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于：步驟一中，于_70°C 冰箱中取出保存的甘油菌農(nóng)桿菌；用接種環(huán)劃線于含有利福平的LB平板上，于光照培養(yǎng)箱 中倒置培養(yǎng)48小時(shí)；挑單菌落接種于含有利福平的LB液體培養(yǎng)基中，搖菌震蕩培養(yǎng)20小 時(shí)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于：步驟二中，待菌液 0D6(KI到0. 5時(shí)，將菌液移入無(wú)菌的1. 5mL的離心管中，4°C，4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上 清；于離心管仲加入500uL 0. 05M的冰預(yù)冷的氯化鈣，將菌液懸浮混勻，靜止冰浴30分鐘； 4°C，4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清；于離心管中加入0. 05M的氯化鈣100uL，備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于：步驟三中，取0. lug 的重組質(zhì)粒加入100uL的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴10分鐘；液氮速凍5分鐘；立即 轉(zhuǎn)入28°C的水浴鍋中，孵育5分鐘后，立即冰浴3-5分鐘；并在超凈臺(tái)中加入500uL含有 利福平的LB液體培養(yǎng)基；于搖床中震蕩培養(yǎng)4-5小時(shí)；取出后涂在含有50mg/L的Kan和 50mg/L Rif的LB平板上面，28°C倒置培養(yǎng)48小時(shí)左右至長(zhǎng)出單菌落為止；挑單菌落接種 于含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定后進(jìn) 行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于：步驟四中，煙草無(wú)菌 幼苗上摘取完全展開(kāi)的葉片，平鋪于稱量紙上，用手術(shù)刀將葉片的邊緣以及主葉脈劃掉，將 葉片切成0.5平方厘米的葉盤(pán)。
6. 據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于：步驟五中，包括以下步 驟： 1) 含有重組表達(dá)載體的EHA105和LBA4404甘油菌菌株從-70°C取出，劃線于含有 50mg/L的Kan和50mg/L Rif的LB平板上面，28°C倒置培養(yǎng)，挑單菌落接種于2mL LB液體 培養(yǎng)基中，于28°C，220轉(zhuǎn)/分，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜； 2) 以1%的接種量接種于100mL LB液體培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；無(wú)菌狀態(tài) 下，4000rpm離心10min ;沉淀用20mT, MS液體培養(yǎng)基洗漆后，4000rpm離心10min，用20mL MS液體培養(yǎng)基懸?。? 3) 將葉盤(pán)放入菌液中，混合8-10min，使農(nóng)桿菌與葉盤(pán)組織傷口部位充分接觸；將葉盤(pán) 從農(nóng)桿菌懸浮液中取出，置于滅菌濾紙上吸干，然后置于MS固體培養(yǎng)基上，用封口膜封好 后，在28°C的培養(yǎng)室里共培養(yǎng)2天； 4) 把MS培養(yǎng)基上的葉盤(pán)轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基，在25°C光照周期14h培養(yǎng)2-3周，每隔 5天換一次培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)接過(guò)程中注意要將葉盤(pán)的邊緣侵入到培養(yǎng)基里，以便葉盤(pán)吸收營(yíng)養(yǎng)； 待愈傷組織分化成苗后用解剖刀切取整體的小植株轉(zhuǎn)入裝有分化培養(yǎng)基MS分的廣口瓶 中，繼續(xù)培養(yǎng)； 5)植株長(zhǎng)大后，切除多余的愈傷組織保留整株的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中MS根中，讓其 生根；待再生幼苗根系發(fā)達(dá)后，開(kāi)蓋加入經(jīng)陽(yáng)光暴曬的自來(lái)水，培養(yǎng)4-7天；強(qiáng)化植株后，取 出植株，用無(wú)菌水洗掉幼苗根部的瓊脂再移栽到滅菌土的盆缽中，放置于室溫中培養(yǎng)煉苗 7-10天；待植株有新芽長(zhǎng)出現(xiàn)象后方可移至室外。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK104232683SQ201410505256
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】胡德龍, 史紅林, 劉艷, 王全智, 解振強(qiáng), 賈思振 申請(qǐng)人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院