棒曲霉素的制備方法
【專(zhuān)利摘要】一種棒曲霉素的制備方法，包括發(fā)酵、分離、純化步驟。所制備的棒曲霉素，經(jīng)高效液相色譜儀、核磁共振對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定，核磁共振的表征數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜儀確定產(chǎn)物的分子量，確認(rèn)所制備的產(chǎn)物為棒曲霉素。各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到sigma公司同類(lèi)產(chǎn)品的指標(biāo)，產(chǎn)品的成本是sigma公司同類(lèi)產(chǎn)品的1/380，大大降低了產(chǎn)品的成本。CCTCC NO：M20140402014.02.19
【專(zhuān)利說(shuō)明】棒曲霉素的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到棒曲霉素的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 棒曲霉素（Patulin，PAT)，又稱(chēng)展青霉素，就是一種具有較強(qiáng)毒性的真菌代謝產(chǎn) 物，晶體無(wú)色棱形，分子式為C7H604,分子量為154,化學(xué)名稱(chēng)為4-羥基4-氫-呋喃（3， 2 -碳）駢批喃-2(6_氫）酮[4-hydroxy-4-H-furo(3,2c)pyran_2(6H)-0ne]。在許多因霉 菌腐敗的水果，如蘋(píng)果、杏子、藍(lán)莓、櫻桃、葡萄、梨、桃子和李子及其制品中都有發(fā)現(xiàn)，以蘋(píng) 果發(fā)霉最易積累該種毒素。
[0003] 大量的研究表明，棒曲霉素具有基因毒性和細(xì)胞毒性，能導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA 損傷[Zhou SM等，2010]，染色體畸變和微核形成[Aives I等，2000 ;Melo FT等，2012]，并 具有致癌性，致畸性，免疫毒性和生殖毒性[Puel 0等，2010]，在動(dòng)物活體內(nèi)，會(huì)損害腎臟、 肝臟和腸等器官組織[Saxena N等，2011 ;Mohan HM等，2012]。因而它成為判斷食品質(zhì)量 安全的一個(gè)重要指標(biāo)，受到世界各國(guó)及國(guó)際組織的極大關(guān)注，例如歐盟在2004年就頒布了 限制含棒曲霉素食品進(jìn)口的法令。
[0004] 隨著棒曲霉素污染食品的問(wèn)題日趨嚴(yán)重，對(duì)于其毒性、檢測(cè)方法和控制技術(shù)的研 究越來(lái)越廣泛。無(wú)論基礎(chǔ)研究還是檢測(cè)和控制研究，都需要大量的毒素樣品。而市售的棒 曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，如：Sigma公司98%以上純度的棒曲霉素 P1639-5MG(5mg)的價(jià)格 是1946. 88元人民幣，P1639-10MG (IOmg)的價(jià)格是3601. 26元人民幣。這大大增加了科學(xué) 研究工作的成本，一定程度上限制了研究工作。
[0005] 微生物具有代謝旺盛，酶活高，生長(zhǎng)繁殖速度快，發(fā)酵不受季節(jié)和水土環(huán)境影響， 發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，可利用其發(fā)酵制備各種真菌代謝產(chǎn)物，為大量獲得低成本、高純度 的棒曲霉素，保證檢測(cè)分析和控制去除技術(shù)研究對(duì)棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品的需求提供新思路。本 專(zhuān)利利用高產(chǎn)該毒素的擴(kuò)展青霉菌株在蘋(píng)果中發(fā)酵，分離純化發(fā)酵產(chǎn)物以制備高純度的棒 曲霉素，工藝方法簡(jiǎn)單，制備成本低于目前的市售價(jià)格的1/380,可為棒曲霉素的深入研究 提供物質(zhì)基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述棒曲霉素制備方法的缺點(diǎn)，提供一種制 備方法簡(jiǎn)單、棒曲霉素產(chǎn)率高、產(chǎn)品成本低的棒曲霉素的制備方法。
[0007] 解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是包括下述步驟組成：
[0008] 1、發(fā)酵
[0009] 每個(gè)250mL三角瓶中裝入IOOg去皮蘋(píng)果塊作為培養(yǎng)基，加8層紗布塞，121 °C滅菌 20分鐘。將擴(kuò)展青霉FP2菌株接種PDA試管斜面，28°C活化7天，每支試管斜面加入無(wú)菌 水制備成濃度為107cfu/mL孢子懸液，每個(gè)裝IOOg蘋(píng)果培養(yǎng)基的三角瓶中接入ImL濃度為 10 7cfu/mL的孢子懸液，28°C避光培養(yǎng)10天，獲得培養(yǎng)物。
[0010] 上述擴(kuò)展青霉FP2菌株的篩選方法如下：
[0011] ⑴分離純化
[0012] 無(wú)菌接種針蘸取不同腐爛蘋(píng)果上的霉點(diǎn)，分別劃線接種于HM固體培養(yǎng)基平板 上，28°C培養(yǎng)。待長(zhǎng)出的菌落有明顯孢子后，無(wú)菌接種針蘸取孢子分別劃線于PDA固體培養(yǎng) 基平板，28°C培養(yǎng)5天，挑取單菌落邊緣菌絲分別于PDA斜面上28°C培養(yǎng)7天，加入IOmL無(wú) 菌水，無(wú)菌接種針蘸取孢子懸液于PDA固體培養(yǎng)基平板上劃線，純化，28°C培養(yǎng)7天，分別挑 取單菌落于PDA斜面4°C冰箱保藏。
[0013] ⑵篩選
[0014] 每IOOg去皮蘋(píng)果塊裝入250mL三角瓶中，加8層紗布塞，121 °C滅菌20分鐘，制成 無(wú)菌蘋(píng)果培養(yǎng)基；
[0015] 將分離得到的12株霉菌分別用PDA斜面28°C活化7天后，各加入無(wú)菌水制備成濃 度為10 7cfu/mL的孢子懸液，分別取ImL孢子懸液接種于IOOg無(wú)菌蘋(píng)果培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng) 箱中避光培養(yǎng)8天，分別取出培養(yǎng)物，研磨，各加入IOOmL乙酸乙酯，180r/min避光振蕩抽提 1小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，上層有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾，下層培養(yǎng)物再次用IOOmL乙 酸乙酯抽提2次，合并3次乙酸乙酯抽提液，用無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾后，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，用 15mL pH為4. 0的冰醋酸水溶液溶出，-20°C保存，每株霉菌平行2組，用0. 22 μ m水系濾膜 過(guò)濾冰醋酸水溶液溶出物，按照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2008-2007 《進(jìn)出口果汁中棒曲霉毒素的檢測(cè)方法高效液相色譜法》進(jìn)行檢測(cè)，相同條件下比較棒曲霉 素的出峰面積，峰面積最大的樣品棒曲霉素含量最多。篩選出產(chǎn)棒曲霉素最多的菌株，命 名為擴(kuò)展青霉FP2菌株（Penicillium expansum FP2)，于2014年2月19日保藏于武漢武 漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2014040。
[0016] 擴(kuò)展青霉FP2菌株的ITS-5. 8S rDNA序列為：
[0017] ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt accgagtgag ggccctttgg gtccaacctc 60 ccacccgtgt ttatttacct cgttgcttcg gcgggcccgc cttaactggc cgccgggggg 120 ctcacgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acacccccga actctgcctg aagattgtcg 180 tctgagtgaa aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttccggcatc 240 gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt gaatcatcga 300 gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360 tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg gggacgggcc 420 cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480 tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac ccaaattttt atccaggtga cctcggatca 540 ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 584
[0018] 2、分離
[0019] 取培養(yǎng)物，分別研磨成糊狀，每IOOg加入乙酸乙酯IOOmL, 150?200r/min避光振 蕩抽提1小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，收集上層乙酸乙酯抽提液，下層培養(yǎng)物中加入乙酸乙 酯100mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提2小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，收集乙酸乙 酯抽提液，下層培養(yǎng)物中再加入乙酸乙酯l〇〇mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提1小 時(shí)，靜置5?10分鐘分層，合并三次乙酸乙酯抽提液，用無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至 干燥，用pH為4. 0的冰醋酸水溶液定溶至50mL，用0. 22 μ m水系濾膜過(guò)濾，得到棒曲霉素的 粗提取液。
[0020] 取棒曲霉素的粗提取液500yL，稀釋100倍，按照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢 疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2008-2007《進(jìn)出口果汁中棒曲霉毒素的檢測(cè)方法高效液相色譜法》檢測(cè) 其中棒曲霉素含量。
[0021] 使用的色譜柱為：Diam〇nsil?C18柱，250mmX4. 6mm(內(nèi)徑），粒徑5 μ m。棒曲霉 素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于Sigma公司，準(zhǔn)確吸取2mL pH為4. 0的冰醋酸水溶液，充分溶解IOmg棒曲霉 素標(biāo)準(zhǔn)品，吸取其中ImL的棒曲霉素溶液，稀釋為30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/ L的標(biāo)準(zhǔn)液，以棒曲霉素的出峰面積X為橫坐標(biāo)，棒曲霉素含量Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：
[0022] Y = 0· 4789X+0. 2114(R2 為 0· 9994)
[0023] 根據(jù)繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定出的棒曲霉素峰面積計(jì)算棒曲霉素的含量。
[0024] 3、純化
[0025] -70°C，IOOPa冷凍干燥棒曲霉素粗提取液至干，用乙酸乙酯充分溶解，40°C旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)乙酸乙酯至10?15mL，200?300目硅膠柱層析純化，用丙酮與二氯甲烷或三氯甲烷體 積比為1 : 20?40的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗脫液中 含有棒曲霉素的情況；將含有棒曲霉素的洗脫液合并，40°C避光旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于10? 15mL的石油醚與乙酸乙酯體積比為1 : 0. 5?3的溶劑中；再次200?300目硅膠柱層析， 用石油醚與乙酸乙酯體積比為1 : 0.5?3的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層 析法檢測(cè)每管洗脫液中含棒曲霉素的情況；將只含有棒曲霉素的溶液合并，避光40°C旋轉(zhuǎn) 蒸干，溶于5?15mL的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒曲霉素產(chǎn)物。
[0026] 上述薄層層析法的條件為：采用硅膠GF254層析板，乙酸乙酯與石油醚體積比1 : 2 為展開(kāi)劑，展層3次，在254nm的紫外燈下，對(duì)比觀察樣品與從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)棒曲霉素標(biāo) 準(zhǔn)品的Rf值。
[0027] 4、鑒定
[0028] 采用核磁共振分析儀，按儀器的使用方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。用質(zhì)譜分析儀，以 ESI電離方式對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，確定產(chǎn)物的分子量。
[0029] 本發(fā)明的純化步驟3為：-70°C，IOOPa冷凍干燥棒曲霉素的粗提取液至干燥，用 IOOmL乙酸乙酯充分溶解，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙酸乙酯至10?15mL，200?300目硅膠柱層析 純化，用丙酮與二氯甲烷的最佳體積比為1 : 30的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄 層層析法檢測(cè)每管洗脫液中含有棒曲霉素的情況；將含有棒曲霉素的洗脫液合并，40°C避 光旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于10?15mL的石油醚與乙酸乙酯最佳體積比為I : 1的溶劑中；再次 200?300目硅膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯最佳體積比為I : 1的洗脫劑洗脫，濕法裝 柱，干法上樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗脫液中含棒曲霉素的情況；將只含有棒曲霉素的溶 液合并，避光40°C旋轉(zhuǎn)蒸干，溶于5?15mL的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒曲霉素產(chǎn)物。
[0030] 在制備棒曲霉素的發(fā)酵步驟1中，由于米用了擴(kuò)展青霉FP2囷株，所制備的棒曲霉 素，經(jīng)高效液相色譜儀、核磁共振對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定，核磁共振的表征數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜儀確 定產(chǎn)物的分子量，確認(rèn)所制備的產(chǎn)物為棒曲霉素。各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到sigma公司同類(lèi)產(chǎn)品的指 標(biāo)，產(chǎn)品的成本是sigma公司同類(lèi)產(chǎn)品的1/380,大大降低了產(chǎn)品的成本。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1是Sigma公司生產(chǎn)的棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。
[0032] 圖2是擴(kuò)展青霉FP2菌株在蘋(píng)果培養(yǎng)基上發(fā)酵10天所得棒曲霉素粗提取液稀釋 100倍的高效液相色譜圖。
[0033] 圖3是棒曲霉素的純化產(chǎn)物溶于pH為4. 0的冰醋酸水溶液的高效液相色譜圖。
[0034] 圖4是棒曲霉素的1H-NMR譜圖。
[0035] 圖5是棒曲霉素的3C-NMR譜圖。
[0036] 圖6是Sigma公司公布的棒曲霉素核磁圖譜。
[0037] 圖7是棒曲霉素的ESI質(zhì)譜分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 1、發(fā)酵
[0041] 取28個(gè)250mL三角瓶，每瓶裝入IOOg去皮蘋(píng)果塊作為培養(yǎng)基，加8層紗布塞， 121°C滅菌20分鐘。將擴(kuò)展青霉FP2菌株接種PDA試管斜面，28°C活化7天，每支試管斜面 加入無(wú)菌水制備成濃度為10 7cfu/mL孢子懸液，在每個(gè)裝蘋(píng)果培養(yǎng)基的三角瓶中接入ImL 濃度為107cfu/mL的孢子懸液，28°C避光恒溫培養(yǎng)10天，獲得培養(yǎng)物。
[0042] 2、分離
[0043] 取28瓶培養(yǎng)物，分別研磨成糊狀，每瓶加入乙酸乙酯IOOmL, 150?200r/min避光 振蕩抽提1小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，收集上層乙酸乙酯抽提液，下層培養(yǎng)物中加入乙酸 乙酯100mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提2小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，收集乙酸 乙酯抽提液，下層培養(yǎng)物中再加入乙酸乙酯l〇〇mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提1 小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，合并三次乙酸乙酯抽提液，用無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾后，40°C旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)至干燥，用pH為4. 0的冰醋酸水溶液定溶至50mL,用0. 22 μ m水系濾膜過(guò)濾,得到棒曲霉 素的粗提取液。
[0044] 取棒曲霉素的粗提取液500yL，稀釋100倍，按照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢 疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2008-2007《進(jìn)出口果汁中棒曲霉毒素的檢測(cè)方法高效液相色譜法》檢測(cè) 其中棒曲霉素含量，見(jiàn)圖1，圖2。
[0045] 使用的色譜柱為：Diamonsil(E)C18柱，250mmX4. 6mm(內(nèi)徑），粒徑5 μ m。棒曲霉 素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于Sigma公司，準(zhǔn)確吸取2mL pH為4. 0的冰醋酸水溶液，充分溶解IOmg棒曲霉 素標(biāo)準(zhǔn)品，吸取其中ImL的棒曲霉素溶液，稀釋為30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/ L的標(biāo)準(zhǔn)液，以棒曲霉素的出峰面積X為橫坐標(biāo)，棒曲霉素含量Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：
[0046] Y = 0· 4789X+0. 2114(R2 為 0· 9994)
[0047] 根據(jù)繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定出的棒曲霉素峰面積計(jì)算棒曲霉素的含量。測(cè)得棒曲 霉素粗提取液中含有棒曲霉素 I. 35X 104mg/L，即含有棒曲霉素675mg。
[0048] 3、純化
[0049] 用蘋(píng)果培養(yǎng)基發(fā)酵擴(kuò)展青霉FP2菌株制備棒曲霉素的粗提取液三批，每批30瓶， 高效液相色譜法檢測(cè)，方法與分離步驟2相同，所得粗提取液中共有棒曲霉素2. 139g。
[0050] -70°C，IOOPa冷凍干燥棒曲霉素的粗提取液至干燥，用IOOmL乙酸乙酯充分溶解， 40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙酸乙酯至10?15mL，200?300目硅膠柱層析純化，用丙酮與二氯甲烷體 積比為1 : 30的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗脫液中含有棒 曲霉素的情況；將含有棒曲霉素的洗脫液合并，40°C避光旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于10?15mL的 石油醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的溶劑中；再次200?300目硅膠柱層析，用石油醚與乙 酸乙酯體積比為1 : 1的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗脫液 中含棒曲霉素的情況；將只含有棒曲霉素的溶液合并，避光40°C旋轉(zhuǎn)蒸干，溶于5?15mL 的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒曲霉素產(chǎn)物I. 509g。
[0051] 上述薄層層析法的條件為：采用硅膠GF254層析板，乙酸乙酯與石油醚體積比1 : 2 為展開(kāi)劑，展層3次，在254nm的紫外燈下，對(duì)比觀察樣品與從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)棒曲霉素標(biāo) 準(zhǔn)品的Rf值。
[0052] 4、鑒定
[0053] 采用氫核磁共振和碳核磁共振，按儀器的使用方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。
[0054] 1H NMR和13C NMR核磁檢測(cè)：瑞士 fcuker公司，AVANCF300MHZ核磁共振儀，圖 譜見(jiàn)圖4和圖5,與Sigma公司公布的棒曲霉素核磁圖譜數(shù)據(jù)吻合，見(jiàn)圖6。數(shù)據(jù)表征= 1H NMR(300MHz，CDC13)S 6.07-5.77(m，2H)，4.66(d，J = 17.2Hz，lH)，4.36(dd，J = 17.2， 3.9Hz，lH)，3.23(s，lH) ;13C NMR(75MHz，CDC13) δ168·60，149·83，146·26，111·19，107·48， 88.87,59. 56。這與棒曲霉素相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)吻合。
[0055] 用Bruker質(zhì)譜儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，確定產(chǎn)物的分子量。電離方式：ESI，圖譜見(jiàn)圖 7。C 7H6Na04(M+Na)+ :分子量計(jì)算值為 177. 0158,實(shí)測(cè)值為 177. 0160，C7H704(M+H)+ :實(shí)測(cè)值為 155. 0340,故純化的物質(zhì)分子量為154,與棒曲霉素的分子量吻合。
[0056] 由以上的核磁共振的表征數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜儀確定產(chǎn)物的分子量，確認(rèn)采用擴(kuò)展青霉 FP2(CCTCC N0:M2014040)菌株制備的產(chǎn)物為棒曲霉素。
[0057] 本實(shí)施例中，用蘋(píng)果培養(yǎng)基發(fā)酵擴(kuò)展青霉FP2菌株制備棒曲霉素三批，每批30瓶， 所得粗提取液中共有棒曲霉素2. 139g，經(jīng)過(guò)純化得到棒曲霉素產(chǎn)物I. 509g，溶于pH為4. 0 的冰醋酸水溶液中，高效液相色譜法檢測(cè)其純度大于等于98%，見(jiàn)圖3,成本為1350?1450 元人民幣，是購(gòu)買(mǎi)Sigma公司同類(lèi)產(chǎn)品銷(xiāo)售價(jià)格的1/380。
[0058] 實(shí)施例2
[0059] 在本實(shí)施例的純化步驟3中，_70°C，IOOPa冷凍干燥棒曲霉素的粗提取液至干燥， 用IOOmL乙酸乙酯充分溶解，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙酸乙酯至10?15mL，200?300目硅膠柱層 析純化，用丙酮與二氯甲烷體積比為1 : 20的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層 析法檢測(cè)每管洗脫液中含有棒曲霉素的情況；將含有棒曲霉素的洗脫液合并，40°C避光旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于10?15mL的石油醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的溶劑中；再次200? 300目硅膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上 樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗脫液中含棒曲霉素的情況；將只含有棒曲霉素的溶液合并，避 光40°C旋轉(zhuǎn)蒸干，溶于5?15mL的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒曲霉素產(chǎn)物。該步驟中的 其它步驟與實(shí)施例1相同。
[0060] 其它步驟與實(shí)施例1相同。
[0061] 實(shí)施例3
[0062] 在本實(shí)施例的純化步驟3中，_70°C，IOOPa冷凍干燥棒曲霉素的粗提取液至干燥， 用IOOmL乙酸乙酯充分溶解，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙酸乙酯至10?15mL，200?300目硅膠柱層 析純化，用丙酮與二氯甲烷體積比為1 : 40的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層 析法檢測(cè)每管洗脫液中含有棒曲霉素的情況；將含有棒曲霉素的洗脫液合并，40°C避光旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于10?15mL的石油醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的溶劑中；再次200? 300目硅膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上 樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗脫液中含棒曲霉素的情況；將只含有棒曲霉素的溶液合并，避 光40°C旋轉(zhuǎn)蒸干，溶于5?15mL的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒曲霉素產(chǎn)物。該步驟中的 其它步驟與實(shí)施例1相同。
[0063] 其它步驟與實(shí)施例1相同。
[0064] 實(shí)施例4
[0065] 在以上的實(shí)施例1?3的純化步驟3中，所用的二氯甲烷用等體積的三氯甲烷替 換。該步驟中的其它步驟與實(shí)施例1相同。
[0066] 其它步驟與實(shí)施例1相同。
[0067] 實(shí)施例5
[0068] 在以上的實(shí)施例1?3的純化步驟3中，用丙酮與二氯甲烷為洗脫劑硅膠柱層析 后，將含有棒曲霉素的洗脫液合并，40°C避光旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于10?15mL的石油醚與乙 酸乙酯體積比為1 : 0.5的溶劑中；再次200?300目硅膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯體 積比為1 : 0.5的洗脫劑洗脫，該步驟中的其它步驟與實(shí)施例1相同。
[0069] 其它步驟與實(shí)施例1相同。
[0070] 實(shí)施例6
[0071] 在以上的實(shí)施例1?3的純化步驟3中，用丙酮與二氯甲烷為洗脫劑硅膠柱層析 后，將含有棒曲霉素的洗脫液合并，40°C避光旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于10?15mL的石油醚與乙 酸乙酯體積比為1 : 3的溶劑中；再次200?300目硅膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯體積 比為1 : 3的洗脫劑洗脫，該步驟中的其它步驟與實(shí)施例1相同。
[0072] 其它步驟與實(shí)施例1相同。
[0073] 根據(jù)上述原理還可設(shè)計(jì)出另一種具體的棒曲霉素中的制備方法，但均在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種棒曲霉素的制備方法，其特征在于包括下述步驟： (1) 發(fā)酵 每個(gè)250mL三角瓶中裝入IOOg去皮蘋(píng)果塊作為培養(yǎng)基，加8層紗布塞，121 °C滅菌20分 鐘；將擴(kuò)展青霉FP2菌株接種PDA試管斜面，28°C活化7天，每支試管斜面加入無(wú)菌水制備 成濃度為107cfu/mL孢子懸液，每個(gè)裝IOOg蘋(píng)果培養(yǎng)基的三角瓶中接入ImL濃度為IO 7Cfu/ mL的孢子懸液，28°C避光恒溫培養(yǎng)10天，獲得培養(yǎng)物； (2) 分離 取培養(yǎng)物，分別研磨成糊狀，每IOOg加入乙酸乙酯l〇〇mL，150?200r/min避光振蕩 抽提1小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，收集上層乙酸乙酯抽提液，下層培養(yǎng)物中加入乙酸乙酯 100mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提2小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，收集乙酸乙酯 抽提液，下層培養(yǎng)物中再加入乙酸乙酯l〇〇mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提1小時(shí)， 靜置5?10分鐘分層，合并三次乙酸乙酯抽提液，用無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾后，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干 燥，用pH為4. 0的冰醋酸水溶液定溶至50mL,用0. 22 μ m水系濾膜過(guò)濾,得到棒曲霉素的粗 提取液； 取棒曲霉素的粗提取液500yL，稀釋100倍，按照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行 業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2008-2007《進(jìn)出口果汁中棒曲霉毒素的檢測(cè)方法高效液相色譜法》檢測(cè)其中 棒曲霉素含量； 使用的色譜柱為：Diamonsil?C18柱，250mmX4. 6mm(內(nèi)徑），粒徑5 μ m ;棒曲霉素標(biāo) 準(zhǔn)品，購(gòu)于Sigma公司，準(zhǔn)確吸取2mL pH為4. 0的冰醋酸水溶液，充分溶解IOmg棒曲霉素 標(biāo)準(zhǔn)品，吸取其中ImL的棒曲霉素溶液，稀釋為30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)液，以棒曲霉素的出峰面積X為橫坐標(biāo)，棒曲霉素含量Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得 到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程： Y = 0· 4789X+0. 2114(R2 為 0· 9994) 根據(jù)繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定出的棒曲霉素峰面積計(jì)算棒曲霉素的含量； (3) 純化 -70°C，IOOPa冷凍干燥棒曲霉素的粗提取液至干燥，用IOOmL乙酸乙酯充分溶解，40°C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙酸乙酯至10?15mL，200?300目硅膠柱層析純化，用丙酮與二氯甲烷或三氯 甲烷體積比為1 : 20?40的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗 脫液中含有棒曲霉素的情況；將含有棒曲霉素的洗脫液合并，40°C避光旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于 10?15mL的石油醚與乙酸乙酯體積比為1 : 0. 5?3的溶劑中；再次200?300目硅膠柱 層析，用石油醚與乙酸乙酯體積比為1 : 0.5?3的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄 層層析法檢測(cè)每管洗脫液中含棒曲霉素的情況；將只含有棒曲霉素的溶液合并，避光40°C 旋轉(zhuǎn)蒸干，溶于5?15mL的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒曲霉素產(chǎn)物； 上述薄層層析法的條件為：采用硅膠GF254層析板，乙酸乙酯與石油醚體積比1 : 2為 展開(kāi)劑，展層3次，在254nm的紫外燈下，對(duì)比觀察樣品與從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn) 品的Rf值。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的棒曲霉素中的制備方法，其特征在于所述的純化步驟（3) 為：-70°C，IOOPa冷凍干燥棒曲霉素的粗提取液至干燥，用IOOmL乙酸乙酯充分溶解，40°C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙酸乙酯至10?15mL，200?300目硅膠柱層析純化，用丙酮與二氯甲烷體積比 為I : 30的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗脫液中含有棒曲霉 素的情況；將含有棒曲霉素的洗脫液合并，40°C避光旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于10?15mL的石油 醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的溶劑中；再次200?300目硅膠柱層析，用石油醚與乙酸乙 酯體積比為1 : 1的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗脫液中含 棒曲霉素的情況；將只含有棒曲霉素的溶液合并，避光4(TC旋轉(zhuǎn)蒸干，溶于5?15mL的乙 酸乙酯中，靜止放置，得到棒曲霉素產(chǎn)物。
【文檔編號(hào)】C12P17/18GK104263777SQ201410408772
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】張曉瑞, 郭玉蓉, 柴永海, 馬瑜 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)