含有犬gmcsf基因的重組犬瘟熱病毒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種含有編碼犬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的基因的重組犬瘟熱病毒，更具體地，重組犬瘟熱病毒是rCDV-GMCSF。本發(fā)明還公開了該重組犬瘟熱病毒的制備方法。本發(fā)明運(yùn)用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)，將犬GMCSF基因插入犬瘟熱病毒的基因組內(nèi)，構(gòu)建了含有犬GMCSF基因的重組基因組全長cDNA克隆pCI-CDV-GMCSF，經(jīng)RT-PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)、電鏡觀察證實(shí)成功救獲了表達(dá)GMCSF蛋白的重組犬瘟熱病毒rCDV-GMCSF，且該重組犬瘟熱病毒的生長滴度與野生型犬瘟熱病毒無明顯差異，為進(jìn)一步研究GMCSF作為佐劑應(yīng)用于犬瘟熱弱毒疫苗株的免疫奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
【專利說明】含有犬GMCSF基因的重組犬瘟熱病毒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種含有編碼犬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的基因的重組犬瘟熱病毒，更具體地，重組犬瘟熱病毒是r⑶V-GMCSF。本發(fā)明還公開了該重組犬瘟熱病毒的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]犬痕熱是犬痕熱病毒(Canine Distemper Virus, CDV)引起多種動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性和致死性傳染病，常引起犬、貂、狐等動(dòng)物發(fā)病，給犬和毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，CDV自然感染宿主在不斷擴(kuò)大，除犬科動(dòng)物外，還可感染大熊貓、小熊貓、獅、虎和豹等食肉目所有8個(gè)科、偶蹄目豬科、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動(dòng)物。疫苗接種能有效預(yù)防該病。
[0003]犬瘟熱病毒屬于副粘病毒科麻疹病毒屬，基因組為非分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，全長15，690個(gè)核苷酸，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，依次為核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合酶蛋白(L)，負(fù)鏈RNA病毒的主要特點(diǎn)是基因組RNA不具有感染性，而且裸露的基因組RNA本身也不能作為模板，只有在與核蛋白(NP)結(jié)合成核糖核蛋白(RNP)復(fù)合體后，才能作為模板起始復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并表達(dá)和包裝出具有感染性的子代病毒。
[0004]粒細(xì)胞-巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子(GranulocyteMacrophage Colony StimulatingFactor, GMCSF)是一種有廣泛免疫活性的效應(yīng)因子，能刺激粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞的增殖、分化及功能成熟，激活樹突狀細(xì)胞增強(qiáng)其遞呈抗原的能力；增強(qiáng)IL-2的產(chǎn)生，活化CD4+T細(xì)胞，提高其分泌抗體的能力，同時(shí)亦可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的功能，提高細(xì)胞免疫水平。
[0005]犬瘟熱的預(yù)防免疫主要是通過接種犬瘟熱病毒弱毒疫苗進(jìn)行工動(dòng)免疫。無論是進(jìn)口疫苗還是其復(fù)制品或國內(nèi)生產(chǎn)的疫苗，雖有一定的效果，但都不能徹底控制犬瘟熱的發(fā)生。因此，研發(fā)一種能夠徹底控制犬瘟熱的免疫原性高的病毒疫苗是亟待解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明選用我國臨床上廣泛應(yīng)用的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株，利用反向遺傳操作平臺(tái)，構(gòu)建了含有犬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)基因的重組犬瘟熱全長cDNA克隆pC1-CDV-GMCSF。應(yīng)用構(gòu)建的全長cDNA克隆，利用反向遺傳操作技術(shù)救獲了重組犬瘟熱病毒r⑶V-GMCSF，該重組病毒與親本疫苗株的生長特性一致，并且GMCSF蛋白的表達(dá)具有遺傳穩(wěn)定性。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種含有編碼犬GMCSF蛋白的基因的重組犬瘟熱病毒，所述重組犬瘟熱病毒為r⑶V-GMCSF，其基因組序列如SEQ ID N0.4所示。
[0008]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過反向遺傳操作技術(shù)在犬瘟熱病毒弱毒疫苗中表達(dá)所述犬GMCSF蛋白，犬瘟熱病毒弱毒疫苗優(yōu)選CDV/R-20/8疫苗株。
[0009]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，GMCSF基因位于所述犬瘟熱病毒基因組編碼的磷蛋白(P)基因和基質(zhì)蛋白(M)基因之間的非編碼區(qū)。
[0010]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼犬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子即GMCSF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述犬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子即GMCSF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供本發(fā)明的重組犬瘟熱病毒的制備方法，該方法包括:(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入編碼犬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子即GMCSF蛋白的基因的所述犬瘟熱病毒的基因組CDNA序列，優(yōu)選所述犬瘟熱弱毒疫苗株是CDV/R-20/8 ； (2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒包括編碼所述犬瘟熱弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述犬瘟熱弱毒疫苗的磷蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述犬瘟熱弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述犬瘟熱病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(4)從轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的細(xì)胞懸液中拯救重組犬瘟熱病毒。
[0013]將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述犬瘟熱病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞的詳細(xì)步驟如下:BHK-21細(xì)胞接種于六孔板中，待第二天生長至70%~80%單層時(shí)，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟如下:(1)將氯化鈣與各質(zhì)?；旌响o置，靜置期間將BHK-21細(xì)胞消化下來，離心，棄掉DMEM ； (2)將細(xì)胞加入氯化鈣與質(zhì)?；旌弦褐?，吹打均勻，靜置，靜置期間將DMEM置于37°C溫箱孵育；(3)將新的DMEM加入步驟⑵的混合液中，混勻后加入6孔板；(4) 12h后43°C水浴熱激2h ； (5) 24h后用含有10% DMSO的PBS液休克細(xì)胞2.5min，之后加入完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)于5% CO2,37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述犬瘟熱病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞的操作步驟如下所示:BHK-21細(xì)胞接種于六孔板中，待第二天生長至70%~80%單層時(shí)，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pC1-⑶V-GMCSF與輔助質(zhì)粒 pC1-CDV-N、pC1-CDV-P、pC1-CDV-L 共轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染量分別為 5 μ g、l μ g、
0.8 μ g和0.5 μ g。轉(zhuǎn)染步驟如下:⑴將氯化鈣與各質(zhì)粒混合靜置，靜置期間將BHK-21細(xì)胞消化下來，800g室溫離心5min，棄掉DMEM ； (2)將細(xì)胞加入氯化鈣與質(zhì)?；旌弦褐?，吹打均勻，靜置20min，靜置期間將5% DMEM置于37°C溫箱孵育；(3)將新的5% DMEM加入步驟(2)的混合液中，混勾后加入6孔板；(4) 12h后43 C水浴熱激2h ; (5) 24h后用含有10%DMSO的PBS液休克細(xì)胞2.5min，之后加入完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)于5% C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0015]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是pC1-CDV-GMCSF,所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別是質(zhì)粒 pC1-CDV-N、pC1-CDV-P、pC1-CDV-L。
[0016]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是Vero細(xì)胞或BHK細(xì)胞。
[0017]具體而言,重組犬痕熱病毒(Canine distemper virus,CDV)作為新型的活病毒載體疫苗具有巨大的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。本研究以犬瘟熱弱毒疫苗株CDV/R-20/8為親本株，采用反向遺傳操作技術(shù)救獲了含有犬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)基因的重組犬瘟熱病毒r⑶V-GMCSF，常規(guī)透射電鏡觀察病毒粒子形態(tài)，結(jié)果顯示重組病毒r⑶V-GMCSF具有完整的副粘病毒粒子形態(tài)，粒子的大小及形狀與母本毒rCDV無明顯差異；間接免疫熒光證實(shí)GMCSF蛋白在重組病毒r⑶V-GMCSF感染的Vero細(xì)胞中獲得高效表達(dá)；病毒一步生長試驗(yàn)顯示，反向遺傳救獲的r⑶V和r⑶V-GMCSF的生長滴度峰值無明顯差異。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下:本發(fā)明運(yùn)用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)，將犬GMCSF插入犬瘟熱病毒的基因組內(nèi)，構(gòu)建了含有犬GMCSF基因的重組基因組全長cDNA克隆pC1-⑶V-GMCSF，GMCSF蛋白穩(wěn)定高效表達(dá)，提高了重組犬瘟熱病毒的免疫原性。為進(jìn)一步研究GMCSF作為佐劑應(yīng)用于犬瘟熱弱毒疫苗株的免疫奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1.含有狂犬病毒糖蛋白G基因重組犬瘟熱全長質(zhì)粒pC1-⑶V-RVG (圖1A);表達(dá)犬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子即GMCSF基因重組犬瘟熱全長質(zhì)粒pC1-CDV-GMCSF(圖1B)構(gòu)建:其中“斜體大寫字母序列”為PmeI酶切位點(diǎn)，“加下劃線的小寫字母”為基因轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列GE，“加下劃線的大寫字母”為基因轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)序列GS，“大寫加粗的CTT”為基因間隔區(qū)核苷酸，“斜體加粗的序列GCCACCACC”為KozaK序列；
[0020]圖2.重組犬瘟熱病毒rCDV-GMCSF的RT-PCR鑒定結(jié)果；
[0021]圖3.重組犬瘟熱病毒r⑶V-GMCSF感染Vero細(xì)胞的間接免疫熒光圖片:(A)rCDV-GMCSF感染的Vero細(xì)胞；(B)未感染的Vero細(xì)胞；
[0022]圖4.rCDV-GMCSF電子顯微鏡觀察圖(X 40000)；
[0023]圖5.r⑶V-GMCSF和r⑶V感染Vero細(xì)胞的生長動(dòng)力學(xué)曲線；
[0024]圖6.質(zhì)粒 pBluescript II KS+載體圖譜;
[0025]圖7.質(zhì)粒pCI載體圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例只是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。
[0027]實(shí)施例含有編碼犬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)的基因的重組犬瘟熱病毒的構(gòu)建
[0028]I材料和方法
[0029]1.1 材料
[0030]犬瘟熱弱毒疫苗CDV/R-20/8購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組犬瘟熱病毒全長cDNA克隆質(zhì)粒pC1-CDV-RVG和表達(dá)CDV NP、P和L蛋白的輔助質(zhì)粒pC1-CDVN、pCI_CDVP和pCI_CDVL由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；BHK-21細(xì)胞(ATCC N0.CCL-10)和Vero細(xì)胞(ATCC N0.CCL-81)由本研究室保存，培養(yǎng)液均為含10%胎牛血清的DMEM ;質(zhì)粒pCI (Promega)和pBluescript IIKS+(Clontech)由本研究室保存；Phus1n DNA聚合酶，T4DNA連接酶及其它限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；RNA提取用TRIzol、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶MLV、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒，RPMI1640培養(yǎng)液購自Invitrogen ;胎牛血清購自長春西諾生物科技有限公司；犬抗⑶V全病毒高免血清由本研究室制備；熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗犬二抗購自Sigma公司；熒光顯微鏡為BX51FL ；Olympus,購自O(shè)lympus公司；Hanks液,犬淋巴細(xì)胞分離液,刀豆蛋白A (Con A)購自索萊寶公司。
[0031]1.2犬GMCSF基因的獲取和序列分析
[0032]從GenBank獲得犬GMCSF 開放閱讀框序列(GenBank Access1n N0.S49738),設(shè)計(jì)一對(duì)引物(見表1)，上游引物起始密碼子ATG前分別引入了 GE、GS和KozaK序列，并在上下游引物中引入PmeI酶切位點(diǎn)，同時(shí)保證全長總堿基數(shù)為6的倍數(shù)。
[0033]無菌采取比格犬外周血1mL于抗凝采血管，以犬淋巴細(xì)胞分離液分離出單核細(xì)胞，用Hanks液洗滌后離心收集單核細(xì)胞，再用含10%胎牛血清、I % Con A RPMI1640培養(yǎng)液，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)20h，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)后的單核細(xì)胞。
[0034]使用TRIzol法提取誘導(dǎo)培養(yǎng)后的單核細(xì)胞RNA (方法見試劑說明書)。提取的RNA溶于DEPC水中，以鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(MLV)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。以cDNA為模板利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增GMCSF基因，經(jīng)凝膠電泳回收后平端克隆至pBluescript II KS+載體EcoRV位點(diǎn)，克隆產(chǎn)物經(jīng)序列測定正確后命名pB-GMCSF。
[0035]表1表達(dá)犬GMCSF全長基因組克隆質(zhì)粒構(gòu)建用引物
[0036]

【權(quán)利要求】
1.一種重組犬瘟熱病毒，其特征在于，所述重組犬瘟熱病毒在其基因組中插入犬GMCSF基因。
2.根據(jù)權(quán)利I所述的重組犬瘟熱病毒，其特征在于，所述重組犬瘟熱病毒是由弱毒疫苗株CDV/R-20/8構(gòu)建而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組犬瘟熱病毒，其特征在于，所述犬GMCSF基因位于所述犬瘟熱病毒中編碼磷蛋白基因P和編碼基質(zhì)蛋白基因M之間的非編碼區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組犬瘟熱病毒，其特征在于，所述犬GMCSF基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組犬瘟熱病毒，其特征在于，所述犬GMCSF基因編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
6.—種權(quán)利要求1所述的重組犬瘟熱病毒的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入犬GMCSF基因的所述犬瘟熱病毒的基因組cDNA序列； (2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒編碼所述犬瘟熱病毒的核蛋白N、磷蛋白P、和/或大聚合酶蛋白L ； (3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和所述輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述犬瘟熱病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的所述宿主細(xì)胞； (4)從轉(zhuǎn)染的所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞懸液中拯救所述重組犬瘟熱病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)的詳細(xì)過程如下:BHK-21細(xì)胞接種于六孔板中，待第二天生長至70%~80%單層時(shí)，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟如下:(1)將氯化鈣與各質(zhì)?；旌响o置，靜置期間將BHK-21細(xì)胞消化下來，離心，棄掉DMEM ；⑵將BHK-21細(xì)胞加入氯化鈣與質(zhì)?；旌弦褐?，吹打均勻，靜置，靜置期間將DMEM置于37°C溫箱孵育；(3)將新的DMEM加入步驟(2)得到的混合液中，混勻后加入6孔板；(4)12h后43°C水浴熱激2h;(5)24h后用含有10% DMSO的PBS液休克細(xì)胞2.5min，之后加入完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)于5% C02、37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是pC1-CDV-GMCSF。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述pC1-CDV-GMCSF的轉(zhuǎn)染量為5μ go
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是三個(gè)，所述三個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別編碼所述犬瘟熱病毒的所述核蛋白N、所述磷蛋白P、所述大聚合酶蛋白L0
11.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別是pC1-CDV-N、pC1-CDV-P、pC1-CDV-L。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，所述pC1-⑶V-N、所述pC1-⑶V-P、所述pC1-CDV-L的轉(zhuǎn)染量分別是I μ g、0.8 μ g和0.5 μ g。
13.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其中所述宿主細(xì)胞是Ve1細(xì)胞或BHK細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK104164409SQ201410345409
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】高玉偉, 馮娜, 王磊, 虞一聰, 李天松, 王鐵成, 李元果, 王化磊, 鄭學(xué)星, 趙永坤, 黃耕, 楊松濤, 夏咸柱 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所