專利名稱：一種分泌高中和活性犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞1d7株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分泌高中和活性犬瘟熱病毒(⑶V)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞1D7株，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗體工程技術(shù)。具體為高中和活性CDV單克隆抗體，對不同動物源的CDV毒株均具有高中和活性，可以用于犬、水貂和狐貍等多種犬瘟熱(CD)發(fā)病動物的臨床治療。
背景技術(shù)：
犬瘟熱(CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)引起犬和肉食目中多種動物的一種高度接觸性傳染病，發(fā)病率幾乎可達(dá)100%，死亡率為80%以上。犬瘟熱在我國的發(fā)病率和致死率均有升高的趨勢，而且臨床表現(xiàn)也與以往有所不同。典型CD在臨床上以雙相熱、急性鼻卡他、支氣管炎、卡他性肺炎、嚴(yán)重的胃腸炎和神經(jīng)癥狀為主要特征。近年來，在臨床上發(fā)現(xiàn)了大量⑶病例，僅表現(xiàn)為一般呼吸道、消化道疾病的臨床癥狀，⑶V檢測陽性，若不及時地進行⑶特異性治療，死亡率很高，對這種CD病例，我們稱之為“非典型CD”。該病呈世界性分布，敏感宿主廣泛且日益擴大。犬瘟熱是危害犬的最嚴(yán)重傳染病。不同年齡和品種的犬都可感染，尤其是幼齡犬。純種犬與當(dāng)?shù)赝练N犬相比，易感性明顯增高。在犬中首次發(fā)生犬瘟熱，死亡率可達(dá)90%。貂的犬瘟熱又稱貂瘟，是高度接觸性、傳播迅速的烈性傳染病，死亡率達(dá)98%以上。CDV在食肉目內(nèi)及食肉目犬科、鼬科與鰭足目海豹科之間跨宿主傳播，是⑶流行的重要因素。因此，犬瘟熱是養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)危害最大的傳染病。CDV屬于副粘病毒科，麻疹病毒屬，病毒粒子呈圓形或橢圓形，有時也呈長絲狀，直徑為150 300nm。粒子中心含有寬徑約15 17nm螺旋形核衣殼，外面被覆一近似雙層輪廓的膜，膜上排列有1.3nm桿狀纖突。病毒的基因組為不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA，全長15，616nt，從它的3'端到5'端依次為3'端前導(dǎo)序列、核衣殼蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基質(zhì)蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、附著或血凝蛋白基因(H)、大L蛋白基因(L)和5'端引導(dǎo)序列。P、N、L為髓芯蛋白，與RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制有關(guān)，N蛋白有包裹及保護內(nèi)部基因的功能，P蛋白可能有聚合酶功能。M、F、H為包被蛋白，位于N蛋白的外側(cè)，H蛋白以近N末端的疏水區(qū)將其嵌在M蛋白上，H蛋白是病毒侵襲宿主所必需，也是產(chǎn)生中和抗體的主要抗原之一。F蛋白是病毒表面的糖蛋白之一，介導(dǎo)病毒與感染細(xì)胞，感染細(xì)胞與非感染細(xì)胞間的融合，使病毒具有在宿主體內(nèi)擴散的能力。F蛋白首先以前體的形式被合成，只有經(jīng)細(xì)胞的蛋白酶裂解成F1、F2形式，才具有融合活性。目前預(yù)防該病使用的疫苗多為弱毒苗，但是許多犬、水貂、狐等養(yǎng)殖場在應(yīng)用弱毒疫苗后仍會發(fā)生本病。分析原因，與母源抗體、疫苗效價、使用方法以及病毒變異有關(guān)。在臨床上，CD發(fā)病動物采用抗體結(jié)合對癥治療的方法可以有效降低病死率。但是市場上現(xiàn)有的抗犬瘟熱病毒的高免血清多是來自于本源動物或異源動物，不僅抗體中和效價低，而且潛在著異源病毒傳播、過敏等風(fēng)險。應(yīng)用具有高中和活性的犬瘟熱病毒單克隆抗體治療CD，可以降低上述風(fēng)險，提高療效。目前，有關(guān)分泌CDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株已有報道，部分細(xì)胞株分泌的單克隆抗體對CDV具有中和活性，但中和效價低，對不同CDV毒株的中和活性至今未見報道。本發(fā)明從已免疫過Onderskpoort疫苗而發(fā)生非典型⑶臨床癥狀的病犬組織中分離CDV強毒株,與Onderstepoort疫苗株存在著變異。以該病毒株為免疫原,運用淋巴細(xì)胞雜交瘤技建立了 CDV特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫，通過中和試驗篩選出了分泌高中和效價的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，分泌的單克隆抗體對非典型CDV強毒株、Onderstepoort疫苗株、狐源CDV毒株和水貂源CDV毒株均具有相同的高中和活性(均達(dá)到106)，表明本發(fā)明的單克隆抗體不僅中和效價高而且抗CDV毒株范圍廣。將本發(fā)明的高中和活性單克隆抗體治療劑應(yīng)用于犬、水貂或狐貍的犬瘟熱臨床治療，均具有顯著治療效果
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
犬瘟熱是犬和肉食目中多種動物的一種高度接觸性傳染病，如果對發(fā)病動物不進行及時治療，死亡率達(dá)到80%以上。本發(fā)明的目的是提供一種分泌高中和活性CDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞株的建立是用近期從免疫失敗的病犬病理組織中分離的CDV強毒株為抗原，免疫BALB/c小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)建立的CDV特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫獲得的。用該雜交瘤細(xì)胞制備的小鼠腹水，經(jīng)病毒中和試驗證明不僅中和效價高而且抗CDV毒株范圍廣，應(yīng)用于犬、水貂或狐貍的犬瘟熱臨床的治療，效果顯著。技術(shù)方案
一種分泌高中和活性犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞1D7株，該雜交瘤細(xì)胞株于2012年2月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO C201222o用所述雜交瘤細(xì)胞1D7株制備的犬瘟熱病毒單克隆抗體。所述的單克隆抗體可在制備犬瘟熱病毒單克隆抗體治療劑中得到應(yīng)用。所述單克隆抗體治療劑對犬源犬瘟熱病毒株、水貂源犬瘟熱病毒株、狐源犬瘟熱病毒株或犬瘟熱病毒Onderskpoort疫苗株的中和效價高達(dá)106。所述單克隆抗體治療劑可用于犬、水貂或狐貍的犬瘟熱臨床治療。所述單克隆抗體治療劑制備方法為，將雜交瘤細(xì)胞1D7株注射到經(jīng)BALB/c小鼠腹腔，制備單克隆抗體腹水，離心，收集上清液，滅活補體，過濾除菌，稀釋，加入穩(wěn)定劑，分裝，低溫凍存。有益效果本發(fā)明的特點和優(yōu)點如下
I.本發(fā)明使用的⑶V免疫原是從已免疫過Onderst印oort疫苗但發(fā)生非典型⑶臨床癥狀的病犬組織中分離的CDV毒株。2.本發(fā)明從建立的82株分泌CDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫中篩選出一株雜交瘤細(xì)胞，用其制備的小鼠腹水抗體對CDV的病毒中和效價高達(dá)106。3.本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體對犬源CDV毒株、水貂源CDV毒株、狐源⑶V毒株和Onderst印oort疫苗株均表現(xiàn)相同的高中和活性，抗⑶V毒株范圍廣。4.本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體治療劑，用于犬、水貂和狐貍等多種CD發(fā)病動物的臨床治療，治療效果顯著，安全無不良副反應(yīng)。于-20°C保存二年后抗體中和效價不降低，穩(wěn)定性好。
具體實施例方式(一)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立
I. CDV抗原的制備將近期從免疫失敗的病犬組織中分離的CDV NJOl強毒株(畢振威等，非典型犬瘟熱病毒核衣殼蛋白基因序列分析及其在大腸桿菌中的表達(dá).中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，33(8) : 625-629.)接種于vero細(xì)胞，3d細(xì)胞發(fā)病變(CPE)，5d后收毒。將病變的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，4000Xg離心后去除細(xì)胞碎片。病毒上清液經(jīng)IM醋 酸鋅溶液沉淀后，用飽和EDTA溶液重新懸浮沉淀，4°C條件下，49000 X g離心60min，沉淀用NTE充分懸浮。加入20%、30%、40%、50%和60%(質(zhì)量/體積)的密度梯度蔗糖溶液，61000 X g離心90 min。吸取病毒帶，通過電鏡負(fù)染觀察病毒形態(tài)，并用分光光度計測定病毒濃度，置-70°C保存?zhèn)溆谩?.動物免疫用純化的⑶V NJOl株作為免疫原，腹腔注射免疫6 8周齡雌性BALB/c小鼠(購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實驗中心)，50 μ g/只。首免用等體積弗氏完全佐劑(Sigma公司產(chǎn)品)乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐劑(Sigma公司產(chǎn)品)乳化抗原，再免疫2次。3免后第7d斷尾采血，測定血清抗體效價。選取血清效價> IO6的小鼠，融合前3d用不加佐劑的抗原腹腔加強免疫，劑量加倍(100 μ g/只)。3.細(xì)胞融合采用PEG細(xì)胞融合方法。取SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞按I : 5 I : 10的比例，充分混勻，1，OOOrpm離心lOmin，棄上清，用手掌輕擊管底，使細(xì)胞松散均勻，置40°C水浴預(yù)熱，用ImL吸管在45s內(nèi)加完預(yù)熱至40°C的50%PEG-4000(Sigma公司產(chǎn)品)lmL，邊加邊輕輕振蕩，然后在90s內(nèi)加入15mL預(yù)熱至37°C的無胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫靜置10min，l，OOOrpm離心lOmin，棄上清，加入含15%FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)和HAT (Sigma公司產(chǎn)品)的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，分裝到已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上，于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3d后補加含HAT (Sigma公司產(chǎn)品)和15%FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPMI-1640培養(yǎng)基，5d后改用含HT (Sigma公司產(chǎn)品)和15%FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPMI-1640培養(yǎng)基，IOd后換成含15% FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)融合的細(xì)胞生長至96孔板孔底面積的1/5時，取上清進行抗體檢測。4.雜交瘤細(xì)胞的篩選按方陣法確定純化抗原的包被濃度，用包被液為0.05mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液對純化的⑶V抗原進行倍比稀釋，用稀釋至400倍的抗原量包被ELISA板，100 μ L/孔，置4°C包被過夜(不少于12h)，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；以含10%小牛血清的PBST封閉每孔，200 μ L/孔，37°C放置2h，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；將融合后12d的細(xì)胞上清、I 1600稀釋的免疫小鼠陽性血清和I 1600稀釋的小鼠陰性血清，加入相應(yīng)孔內(nèi)，100 口17孔，371作用111，？851'洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入I : 2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(本試驗室自制)，100 μ L/孔，37°C放置lh，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB- H2O2,100 μ L/孔，室溫避光顯色20min ;每孔加入50 μ L 2mol/L硫酸終止反應(yīng)。經(jīng)酶標(biāo)儀測定OD45tlnm值，以空白對照調(diào)零，P為各檢測孔的值，N為陰性參考血清的OD45tol值，當(dāng)陰性參考血清的OD45tlnm值=O. 1，陽性參考血清的OD45tlnm值與陰性參考血清的OD45tol值的比值蘭2. 1，即陰、陽性對照成立的前提下，P/N ^ 2. I的檢測孔判為陽性，I. 5 ( P/N< 2. I的檢測孔判為可疑，P/N < I. 5的檢測孔判為陰性。隔2 3d后再檢測一次，選擇兩次檢測結(jié)果均為陽性的雜交瘤細(xì)胞株。5.雜交瘤細(xì)胞的克隆化首先將陽性孔活細(xì)胞用臺盼蘭進行染色和計數(shù)，用含15% FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成100個細(xì)胞/15mL培養(yǎng)基，將稀釋的細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔O. 15mL，37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 5d后，顯微鏡下可觀察到克隆細(xì)胞的形成，記錄下只有單個克隆生長孔，8 9d時取細(xì)胞上清，及時進行ELISA檢測。選擇陽性的單克隆細(xì)胞再進行同樣的克隆3次以上，直至克隆后所有細(xì)胞孔上清檢測均為陽性、且各孔檢測OD值較接近。將克隆化的CDV特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株擴大培養(yǎng)，凍存，建立了 82株穩(wěn)定分泌CDV特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫。6.腹水的制備將滅菌的液體石蠟腹腔注射8 10周齡的BALB/c小鼠(購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實驗中心)，0.5mL /只，7天后，將雜交瘤細(xì)胞株1D7注射入小鼠腹腔，每只O. 2mL (含2X IO6 5X IO6個雜交瘤細(xì)胞)，7 10天后采取腹部明顯鼓起小鼠的腹水，3000 Xg離心10 min，收集上清，分裝后于-20°C保存?zhèn)溆谩?.病毒中和試驗用建立的82株穩(wěn)定分泌CDV特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株制備的腹水，分別進行犬瘟熱病毒中和試驗，進一步篩選分泌中和效價高、且抗CDV毒株范圍廣的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。7. I CDV NJOl株的病毒中和試驗測定CDV NJOl株的TCID5tl，確定其病毒毒價。采用固定病毒稀釋抗體的方法，將Vero細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將10倍系列稀釋的各株單克隆抗體小鼠腹水分別與等體積含200 TCID50的CDV NJOl株懸液混合均勻，37°C作用I h，取該病毒-抗體混懸液每孔O. Iml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立⑶V及正常Vero細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果，從中選出分泌高中和活性(抗體中和效價為IO6) CDV單克隆抗體的的雜交瘤細(xì)胞株1D7。7. 2 CDV Onderstepoort 疫苗株的病毒中和試驗測定 CDV Onderstepoort 疫苗株(美國富道動物保健公司產(chǎn)品)的TCID5tl，確定其病毒毒價。采用固定病毒稀釋抗體的方法，將Vero細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將雜交瘤細(xì)胞株1D7制備的小鼠腹水10倍系列稀釋，與等體積含200 TCID50的CDV Onderstepoort疫苗株懸液混合均勻，37°C作用I h，取該病毒-抗體混懸液每孔O. Iml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立⑶V及正常VeiO細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果，雜交瘤細(xì)胞株1D7制備的小鼠腹水對CDV Onderstepoort株的中和效價為106。7. 3狐源⑶V-FOX-TA株的病毒中和試驗測定⑶V FOX-TA株(楊篤寶等，狐源犬瘟熱病毒泰安株(CDV-FOX-TA)的分離與鑒定·西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，21 (I) : 204-207.)的TCID50,確定其病毒毒價。采用固定病毒稀釋抗體的方法，將Vero細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將雜交瘤細(xì)胞株1D7制備的小鼠腹水10倍系列稀釋，與等體積含200 TCID5tl的⑶V FOX-TA株懸液混合均勻，37 °C作用I h，取該病毒-抗體混懸液每孔O. Iml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立⑶V及正常Vero細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果，雜交、瘤細(xì)胞株1D7制備的小鼠腹水對⑶V-FOX-TA株的中和效價為106。7. 4水貂源⑶V株的病毒中和試驗測定水貂源⑶V毒株(袁小遠(yuǎn)等，一株水貂犬瘟熱病毒的分離與鑒定.經(jīng)濟動物學(xué)報，2006，10 (4) : 189-192)的TCID5tl，確定其病毒毒價。采用固定病毒稀釋抗體的方法，將Vero細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將雜交瘤細(xì)胞株1D7制備的小鼠腹水10倍系列稀釋，與等體積含200 TCID50的水貂源CDV毒株懸液混合均勻，37°C作用I h，取該病毒-抗體混懸液每孔O. Iml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立⑶V及正常Vero細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果，雜交瘤細(xì)胞株1D7制備的小鼠腹水對水貂源CDV毒株的中和效價為1068雜交瘤細(xì)胞株1D7的生物學(xué)特性
8. I雜交瘤細(xì)胞株染色體分析用姬姆薩染色法對雜交瘤細(xì)胞進行染色體計數(shù)。分別取SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，生長到對數(shù)期，向細(xì)胞瓶中加入秋水仙素，使其終濃度為O. I μ g/ml，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-5h。用5mL 37°C預(yù)溫的
O.075mol/L KCI低滲液將細(xì)胞吹起混勻，置37°C溫箱作用30min，向其中加入新配制的固定液(甲醇冰醋酸為3 :1) I mL，邊滴加邊混勻，IOOOrpm離心lOmin。棄上清留細(xì)胞沉淀，用5mL固定液將細(xì)胞吹起，37°C作用30min，IOOOrpm離心lOmin，重復(fù)上述操作一次。細(xì)胞沉淀用ImL固定液懸起混勻，用滴管吸取懸液I滴，滴在預(yù)先冰凍的載玻片上，平鋪于載玻片上，自然干燥。用新配制的吉姆薩染液染色lOmin，自來水沖洗后晾干，置于顯微鏡下進行觀察。此雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)量為98條,而骨髓瘤細(xì)胞的染色體的數(shù)量為65條,小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)量為40條,證明所獲得的此雜交瘤細(xì)胞株是兩種細(xì)胞融合的結(jié)果。8. 2分泌抗體穩(wěn)定性測定將獲得的雜交瘤細(xì)胞株1D7進行連續(xù)培養(yǎng)傳代20次、液氮凍存與復(fù)蘇試驗，用間接ELISA連續(xù)檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體效價均為104，證明此雜交瘤細(xì)胞株1D7仍能穩(wěn)定地分泌單克隆抗體。8. 3單克隆抗體的亞類測定亞類測定按照單克隆抗體亞類鑒定試劑盒(購買于Thermo scientific公司)操作說明書進行,結(jié)果顯示,該單克隆抗體亞類為IgGlK。8. 4單克隆抗體的效價測定用間接ELISA測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水的效價，結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞1D7培養(yǎng)上清ELISA效價為104，腹水ELISA效價1012，病毒抗體中和效價I O6。8. 5單克隆抗體的間接免疫熒光試驗實驗在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進行。將犬源⑶V毒株、水貂源⑶V毒株、狐源⑶V毒株和OnderSt印oort疫苗株分別接種到vero細(xì)胞，培養(yǎng)72h病變后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清的培養(yǎng)液洗2次，然后向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入_20°C預(yù)冷的無水乙醇ImL/孔，4°C固定30 min，用PBS洗3次，拍干；加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，200 μ L/孔，37°C孵育lh, PBS洗滌3次，拍干;加入200倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(購買于武漢博士德生物工程有限公司)，200 μ L/孔，37°C孵育lh，PBS洗滌5次，置于熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，單克隆抗體均能與犬源CDV毒株、水貂源CDV毒株、狐源⑶V毒株和Onderstepoort疫苗株感染的vero細(xì)胞反應(yīng),產(chǎn)生突光,而與正常vero細(xì)胞無熒光，證明該單克隆抗體是抗CDV的特異性單克隆抗體。8. 6單克隆抗體的特異性用包被液為0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液對vero細(xì)胞抗原進行稀釋(400倍)包被ELISA板，100 μ L/孔，置4°C包被過夜；PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；以10%小牛血清封閉每孔，200 μ L/孔，37°C放置2h ;PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；將雜交瘤細(xì)胞上清、I 1600稀釋的免疫小鼠陽性血清和I : 1600稀釋的小鼠陰性血清，加入相應(yīng)孔內(nèi)，100 4 17孔，371作用90 min ;PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入I : 2000稀釋的酶標(biāo)羊抗鼠IgG，100 μ L/孔，37°C放置60min ；PBST洗滌5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB- H2O2,100 μ L/孔，室溫避光顯色IOmin ;每孔加入50 μ L 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。經(jīng)酶標(biāo)儀測定OD45tlnm值，雜交瘤細(xì)胞上清和小鼠陰性血清的OD45tol值均小于O. 1，顯示了良好的特異性。(二)單克隆抗體治療劑的制備與檢驗
I.單克隆抗體治療劑的制備將液體石蠟注射入8 10周齡BALB/c小鼠，7天后，將雜交瘤細(xì)胞株1D7注射小鼠腹腔，每只注射2 X IO6 5 X IO6個雜交瘤細(xì)胞，7 10天后采取腹部明顯鼓起小鼠的腹水，3000g，離心10 min，收集上清。單克隆抗體腹水經(jīng)56°C、30分鐘處理，離心，收集上清液，滅活補體，過濾除菌，用PBS稀釋，加入適宜穩(wěn)定劑，分裝，置-20°C保存?zhèn)溆谩?
2.單克隆抗體治療劑的效力試驗將⑶V檢測陰性的5(Γ60日齡的比格犬(南京安立默科技有限公司)隨機分成若干組，用CDV NJOl株感染，感染后，皮下注射不同劑量的單克隆抗體治療劑，逐日觀察，觀察臨床表現(xiàn)、檢測CDV。實驗同步設(shè)立不注射單克隆抗體治療劑對照組。結(jié)果皮下注射的單克隆抗體在2小時后可進入到血液中，單克隆抗體的中和效價大于50，確定臨床治療劑量。單克隆抗體治療組中的犬未出現(xiàn)CD臨床癥狀，CDV檢測陰性；對照組出現(xiàn)⑶臨床癥狀，死亡率90%，⑶V檢測陽性。3.單克隆抗體治療劑的安全性試驗為了檢驗該制劑的安全性，將5倍的治療劑量皮下注射健康犬，逐日檢測試驗犬的體溫、精神狀態(tài)以及飲食等表現(xiàn)，試驗犬無不良副反應(yīng)。4.單克隆抗體治療劑的穩(wěn)定性試驗將分裝的單克隆抗體治療劑，分別置于37°C、4°C、-20°C保存，經(jīng)不同的保存時間后，取樣，用病毒中和試驗測定效價。其中置-20°C保存二年后的單克隆抗體治療劑，中和效價仍為 ο6。(三)單克隆抗體治療劑的臨床應(yīng)用
I.臨床CD病犬的治療將制備的單克隆抗體制備的治療劑用于門診CD發(fā)病犬的治療，采用皮下注射的方法，并輔以對癥治療，有效率100%、治愈率在97%。2.臨床CD水貂的治療將制備的單克隆抗體治療劑用于門診CD發(fā)病水貂的治療，采用皮下注射的方法，并輔以對癥治療，有效率100%、治愈率在92%。3.臨床CD狐貍的治療將制備的單克隆抗體治療劑用于門診CD發(fā)病狐貍的治療，采用皮下注射的方法，并輔以對癥治療，有效率100%、治愈率在95%。
權(quán)利要求
1.一種分泌高中和活性犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞1D7株，該雜交瘤細(xì)胞株于2012年2月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為 CCTCC NO C201222o
2.用權(quán)利要求I所述雜交瘤細(xì)胞1D7株制備的犬瘟熱病毒單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備犬瘟熱病毒單克隆抗體治療劑中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述單克隆抗體治療劑對犬源犬瘟熱病毒株、水貂源犬瘟熱病毒株、狐源犬瘟熱病毒株或犬瘟熱病毒Onderskpoort疫苗株的中和效價高達(dá)IO6。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述單克隆抗體治療劑用于犬、水貂或狐貍的犬痕熱臨床治療。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，所述單克隆抗體治療劑制備方法為，將雜交瘤細(xì)胞1D7株注射到經(jīng)BALB/c小鼠腹腔，制備單克隆抗體腹水，離心，收集上清液，滅活補體，過濾除菌，稀釋，加入穩(wěn)定劑，分裝，低溫凍存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分泌高中和活性犬瘟熱病毒(CDV)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從建立的82株分泌CDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫中篩選出一株雜交瘤細(xì)胞1D7，用其制備的小鼠腹水抗體對CDV的病毒中和效價高達(dá)106。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株分泌高中和活性CDV單克隆抗體不僅中和效價高而且抗CDV毒株范圍廣，用于犬、水貂或狐貍的犬瘟熱(CD)發(fā)病動物的臨床治療，治療效果顯著，安全無不良副反應(yīng)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體治療劑，保存二年后中和效價不降低，穩(wěn)定性好。
文檔編號C07K16/10GK102618503SQ201210081170
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月26日
發(fā)明者夏興霞, 孫婧, 張匯東, 畢振威, 溫海, 王永山, 秦海斌, 范紅結(jié), 趙艷兵 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院